1、分析各類葛根中葛根素的成份        摘要:目的建立不同品種葛根中葛根素及總黃酮的含量測定方法。方法采用RP-HPLC法,以甲醇-水(3268)為流動相,檢測波長為250 nm測葛根素含量;紫外分光光度法測柴葛、粉葛中總黃酮含量。結果葛根素峰分離度提高,峰形改善;葛根素0.2042.04 g范圍內與峰面積線性關系良好(r=0.999 9),回收率為98.7%(n=5),精密度RSD=0.86%。總黃酮濃度在4.0816.32 g/ml范圍內與吸收度線性關系良好(r=0.999 8)。結論該法靈敏、準確、簡便易行,重復性好

2、,可用于中藥葛根藥材及飲片的質量控制。      關鍵詞:葛根  葛根素  含量  分析     0 引言       葛根為豆科植物柴葛和甘葛藤的干燥根,前者習稱柴葛,甘葛藤習稱“粉葛”,始載于神農本草經,味甘、辛,性平,具有增加腦及冠狀動脈血流量、降低血管阻力、收縮平滑肌、降血糖及解熱等多種功效。民間用于治療傷寒、溫熱頭痛、煩熱消渴等癥,也是中醫常用的祛風解毒藥。現代研究表明,葛根含葛根異黃酮,主要為葛根素、大豆苷、大豆苷元3種活性成分,其中

3、葛根素是本屬的特征成分,也是主要成分,為了對葛根進行有效的質量控制,本實驗以葛根素為指標,以柴葛、粉葛藥材為對象,建立了高效液相色譜法測定其葛根素的含量方法,并采用紫外分光光度法對其中的總黃酮進行了含量測定,為柴葛、粉葛的藥材鑒定提供參考方法。     1 儀器與材料     1.1 儀器美國 Waters 公司600-2487高效液相色譜儀,Millenium數據處理系統;Waters2487紫外檢測器;島津UV-2401PC型紫外分光光度計;島津AY120型萬分之一電子分析天平;SB3200型超聲清洗器。   

4、  1.2 材料葛根素對照品:中國藥品生物制品檢定所;甲醇為色譜純;水為重蒸餾超純水;其它試劑均為分析純。柴葛產于安徽岳西,粉葛產于廣西。     2 方法與結果     2.1 HPLC法測定葛根中葛根素的含量     2.1.1 色譜條件色譜柱:Zorbax XDB-C18(4.6mm×250mm, 5m);流動相甲醇-水(3268);流速1ml/min;檢測波長250 nm;柱溫22;進樣體積10l。理論板數按葛根素峰計算不低于5000。在該色譜條件下,樣品中的葛根素與其它峰均能

5、達到基線分離,保留時間在14.3 min左右。     2.1.2 對照品溶液的制備精密稱取葛根素對照品5.1mg,甲醇定容于25ml量瓶。分別移取0.5,1.0,2.0,2.5ml于5ml量瓶,水定容,與原液共同作為HPLC用對照品溶液。     2.1.3 供試品溶液的制備 熱回流提取法:精密稱取柴葛、粉葛粉末(過50目篩)各0.1g,置具塞錐形瓶中,精密加入30%乙醇50 ml,稱重。回流提取30min,放冷,稱重并以30%乙醇補足減失重量,搖勻過濾,取續濾液為供試品,待測。     索氏提取法:稱

6、取柴葛、粉葛粉末各0.5g, 精密稱定,以甲醇為提取劑提取4h,過濾,濃縮提取液并用甲醇定容于10ml量瓶。超聲處理30min,取上清液以水定容于10ml量瓶,待測。     2.1.4 線性關系考察取對照品溶液,按照色譜條件進樣10l,葛根素進樣量X(g)為橫坐標,以峰面積Y為縱坐標繪制標準曲線,其回歸方程為:Y=3.5076×106X+3.2745×104,r=0.9999。結果表明,葛根素進樣量在0.2042.04g范圍內與峰面積線性關系良好,可用外標兩點法計算含量。     2.1.5 精密度考察在色譜條件

7、下,吸取同一對照品溶液10 l,連續進樣5次,測得峰面積,RSD=0.8%,表明進樣與峰面積積分的精密度良好。     2.1.6 重復性考察取同一批柴葛、粉葛樣品5份,按外標法計算含量,RSD=2.8%,表明分析方法重復性良好。     2.1.7 穩定性考察精密吸取對照品溶液10l,分別在0,1,2,4,8,12,24,48h時進樣,在色譜條件下測定峰面積,其RSD值為1.4%。表明葛根素在室內正常條件下48h內穩定,因此整個實驗過程可以在常溫不避光的條件下操作。     2.1.8 回收率考察精密稱

8、取已知葛根素含量的同一樣品藥材粉末5份,20mg/份,精密稱定后,每份加入濃度為0.204mg/ml的對照品溶液2.53.3 ml,按“供試品溶液制備”項下操作,精密吸取10 l,進樣,計算回收率。     2.1.9 樣品測定按“供試品溶液制備”項下操作,制備各樣品溶液,精密吸取10l,進樣,在所選色譜條件下測定,外標兩點法計算含量。     2.2 紫外分光光度法測定葛根中總黃酮含量     2.2.1 線性關系考察精密稱取葛根素對照品5.1mg,甲醇定容于25ml量瓶。移取0.2,0.4,0.5,0

9、.6,0.8ml置于10ml量瓶,水定容,為紫外測總黃酮用對照品溶液。     以溶液濃度為橫坐標,吸收度為縱坐標,得線性方程:Y= 0.078X+0.0152,r=0.9998。表明總黃酮濃度在4.0816.32g/ml范圍時與吸收度線性關系良好。     2.2.2 供試品制備 方法1:分別稱取柴葛、粉葛4.5g,置于圓底燒瓶,乙醇回流提取3次,40ml/次,時間均為1h。合并3次濾液并濃縮置25ml量瓶,乙醇定容。取1ml用乙醇定容于100量瓶,再取1ml上清液于10ml量瓶,水定容,待測。以1ml乙醇加水定容于10ml量瓶中為

10、空白對照。     方法2:取上述液相用索氏提取法制得的待測品0.4ml,置于10ml量瓶,水定容,待測。     2.2.3 吸收波長考察與樣品測定在200800nm間紫外掃描濃度為8.16g/ml的葛根素對照品溶液。在249251nm處有最大吸收,選用250nm測定。分別測定兩種方法制得4個樣品。     3 討論     HPLC法對不同產地的柴葛、粉葛中的葛根素的含量進行了測定,表明柴葛中葛根素含量約為粉葛的3倍,紫外測總黃酮含量表明,柴葛中葛根素量占總黃酮量的55%

11、左右,粉葛中葛根素量占其總黃酮量的48%左右。同時比較了不同提取方法對葛根素和總黃酮含量測定的影響,發現回流提取法得到的葛根素含量較高,更有利于其提取。     在葛根素的提取中使用體積分數為30%的乙醇,是通過實驗與參閱文獻得出的結果。此時總黃酮中的酚羥基主要以離子形式存在,HPLC色譜圖為單峰,而使用60%乙醇提取時,總黃酮中酚羥基以離子與分子形式共存,色譜圖為雙峰。     葛根素HPLC圖譜中葛根素峰易拖尾,分離度低,本文研究了甲醇:水不同配比對峰形、分離度和保留時間的影響,體積比為2575時葛根素峰拖尾,與后面的小峰分離度為1.3,體積比為3565時葛根素峰與前峰易重合。甲醇水比(V/V)為3268時,在樣品分析中葛根素與其它峰均能達到基線分離,保留時間適中,柱效高,故選用為流動相。