1、第六節(jié)大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化一、基本知識(shí)核酸不能自己進(jìn)入細(xì)菌，而是需要幫助，并對(duì)細(xì)菌經(jīng)過處理，才能穿過細(xì)胞的內(nèi)、 外膜進(jìn)入，在里邊表達(dá)和復(fù)制。?感受態(tài)細(xì)胞：受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法的處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了暫 時(shí)性的改變，成為能允許外源DNA分子進(jìn)入的感受態(tài)細(xì)胞（Competent cells。?轉(zhuǎn)化（Transformation :是將外源DNA分子引入受體細(xì)胞，使之獲得新的遺傳 性狀的一種手段，它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領(lǐng)域的基本實(shí)驗(yàn)技 術(shù)。2二、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備常用CaCl 2成批制備感受態(tài)細(xì)菌，這些細(xì)菌可使每微克超螺旋質(zhì)粒 DNA產(chǎn)生 5 M062X0

2、7個(gè)轉(zhuǎn)化菌落，這樣的轉(zhuǎn)化效率足以滿足所有在質(zhì)粒上進(jìn)行的常規(guī)克隆的 需要。適用于大多數(shù)大腸桿菌菌株，并且快速，重復(fù)性更好。制備的感受態(tài)細(xì)胞可貯 存于-70C,數(shù)月至1年。但保存時(shí)間過長會(huì)使轉(zhuǎn)化效率受到影響。新鮮細(xì)胞 4 c保 存可用5天。用于電轉(zhuǎn)化法的感受態(tài)細(xì)胞的制備使用低鹽緩沖液或水洗細(xì)胞，通過高壓脈沖的作用將載體 DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞。（具體 操作及參數(shù)，參考儀器說明3?下列有3個(gè)因素對(duì)于獲得持續(xù)高的轉(zhuǎn)化頻率來說是至關(guān)重要的：-轉(zhuǎn)化緩沖液中試劑的純度 為田胞的生長狀態(tài)破璃和塑料器皿的清潔度4例：Cacl 2法制備感受態(tài)細(xì)胞（化學(xué)法步驟：1從于37c培養(yǎng)1620小時(shí)的新鮮平板中挑取一個(gè)單菌落

3、（直徑23mm，轉(zhuǎn)到 一個(gè)含有100ml LB或SOB培養(yǎng)基的1L燒瓶中。于37c劇烈振搖培養(yǎng)約3小時(shí)。 為得到有效轉(zhuǎn)化，活細(xì)胞數(shù)不應(yīng)超過108細(xì)胞/ml,可每隔2030分鐘測(cè)量OD 600值 來監(jiān)測(cè)培養(yǎng)物的生長情況。2在無菌條件下將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一個(gè)無菌、一次性使用的、用冰預(yù)冷的50ml內(nèi)烯管中，在冰上放置10分鐘，使培養(yǎng)物冷卻至0C。3于4 C,離心10分鐘,以回收細(xì)胞。4倒出培養(yǎng)液，將管倒置1分鐘以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡。55以10ml用冰預(yù)冷的0.1mol /L Cacl 2重懸每份沉淀，放置于冰浴上。6于4C,離心10分鐘.以回收細(xì)胞。7倒出培養(yǎng)液，將管倒置1分鐘以使最后殘留的這量培

4、養(yǎng)液流盡。8每50ml初始培養(yǎng)物用2ml用冰預(yù)冷的0.1mol /L CaCl 2重懸每份細(xì)胞沉淀。9分裝成200ul ,貯存于-70C、4 c備用。？轉(zhuǎn)化6三、轉(zhuǎn)化方法：?電轉(zhuǎn)化法:使用低鹽緩沖液或水洗制備的感受態(tài)細(xì)胞，通過高壓脈沖的作用將 載體DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞。?化學(xué)方法（熱激法:使用化學(xué)試劑（如CaCl 2制備的感受態(tài)細(xì)胞，通過熱擊處理 將載體DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞。7?電轉(zhuǎn)化法：當(dāng)大腸桿菌暴露在電場(chǎng)中時(shí)，細(xì)胞膜會(huì)不穩(wěn)定而誘導(dǎo)形成暫時(shí)孔洞，于是DNA 分子進(jìn)入細(xì)胞。電穿孔法最初用于將 DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞，通過優(yōu)化各個(gè)參數(shù)，每微 克DNA可以得到1091010轉(zhuǎn)化體。影響參數(shù)：電場(chǎng)強(qiáng)

5、度；電脈沖的長度；DNA濃度;質(zhì)粒的大小。一般電轉(zhuǎn)化的效率是用化學(xué) 方法制備的感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率的1020倍。而且，制備用于電穿孔的細(xì)胞要比制 備感受態(tài)細(xì)胞更容易得多，低鹽溶液或水洗，加10%的甘油,-70C保存。8?化學(xué)方法：1用貯存于-70C、4 C或新鮮的感受態(tài)細(xì)胞懸液中各取200ul轉(zhuǎn)移到無菌的微量離心管中，每管加DNA （體積<10ul ,DNA <50ng，輕 輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物，在冰中放置30分鐘。2將管放到預(yù)加溫到42c的循環(huán)水浴中，恰恰放置90秒，不要搖動(dòng)試管。3快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻12分鐘。4每管加800ul SOC培養(yǎng)基。用水浴將培養(yǎng)基加溫至37

6、C，然后將管轉(zhuǎn)移到37c搖床上，溫育45分鐘使細(xì)菌復(fù)蘇， 并且表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性標(biāo)記基因。如果要求更高的轉(zhuǎn)化效率 ，在復(fù)蘇期中， 應(yīng)溫和地?fù)u動(dòng)細(xì)胞。95將適當(dāng)體積（每個(gè)90mm平板可達(dá)200ul已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含 20mmol /L MgS04和相應(yīng)抗生素的SOB瓊脂培養(yǎng)基上。用一無菌的彎頭玻棒輕輕 地將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞涂到瓊脂平板表面。6將平板置于室溫直至液體被吸收。7倒置平皿，于37c培養(yǎng),1216小時(shí)后可出現(xiàn)菌落。10第七節(jié)含重組質(zhì)粒的細(xì)菌菌落的鑒定幾種方法來鑒定含重組質(zhì)粒的細(xì)菌菌落：1小規(guī)模提取質(zhì)粒DNA進(jìn)行限制酶切 分析;2西:補(bǔ);3插入失活;4雜交篩選5菌落PCR。11一、

7、小規(guī)模制備質(zhì)粒DNA進(jìn)行限制酶切分析要挑取一些獨(dú)立的轉(zhuǎn)化菌落進(jìn)行小規(guī)模培養(yǎng)，分離質(zhì)粒DNA后用限制酶進(jìn)行消 化,再通過凝膠電泳進(jìn)行分析。該方案頗費(fèi)氣力，但這是首選的方法。在實(shí)際應(yīng)用中， 有可能在23小時(shí)內(nèi)提取和分析36份小量制備的質(zhì)粒DNA。12二、a互補(bǔ)許多載體都帶有Lac Z基因的調(diào)控序列和頭146個(gè)氨基酸的編碼信息，編碼a- 互補(bǔ)肽，該肽段能與宿主編碼的缺陷型 &半乳糖甘酶實(shí)現(xiàn)基因內(nèi)互補(bǔ)（俄互補(bǔ)。當(dāng)這 種載體轉(zhuǎn)入可編碼 代半乳糖甘酶C端部分序列的宿主細(xì)胞中時(shí)，在異內(nèi)基-&D硫代 半乳糖甘（IPTG的誘導(dǎo)下，宿主可同時(shí)合成這兩種肽段，雖然它們各自都沒有酶活性， 但它們可以融

8、為一體形成具有酶活性的蛋白質(zhì)。實(shí)現(xiàn) 優(yōu)互補(bǔ)現(xiàn)象。由互補(bǔ)產(chǎn)生的代半乳糖甘酶（Lac Z能夠作用于生色底物（X -gal而產(chǎn)生藍(lán)色的 菌落，當(dāng)在載體的該基因編碼序列之間的多克隆位點(diǎn)，插入一個(gè)外源DNA片段時(shí)，會(huì) 造成Lac Z （基因的失活，破壞e互補(bǔ)作用，有重組質(zhì)粒的菌落為白色，而沒有重組質(zhì) 粒的菌落為藍(lán)色。130互補(bǔ)現(xiàn)象的檢查：1在一事先制備好的含相應(yīng)抗生素的LB瓊脂平板上加40ul X gal貯存液（以20mg /ml的濃度溶于二甲基甲酰胺中和 4ul （IPTG溶液（濃度為200mg /ml。溶液涂布在事先制備的瓊脂平板表面。X -gal貯存液的配法：將X -gal溶于二甲基甲酰胺中，配成

9、20mg /ml濃度的溶液，裝于玻璃或聚丙烯管中，裝溶液的管應(yīng)以錫柏包裹以防可見光使X -gal受到破壞，應(yīng)貯存于-20C保存。該溶液不必過濾除菌IPTG溶液的配法：將2g IPTG溶于8ml水中，用水調(diào)節(jié)體積到10mL 0用0.22um一次性濾器過濾除菌，分裝成1ml小份,貯存于-20C142將待檢細(xì)菌接種到平板上，用接菌環(huán)或牙簽劃線接種，也可將100ul細(xì)菌懸液涂 布在瓊脂培養(yǎng)基表面。倒置平板于 37c培養(yǎng)1216小時(shí)。3于4c將平板放置數(shù)小時(shí)，使藍(lán)色充分顯現(xiàn)。帶有 &半乳糖甘酶活性蛋白的菌 落中間為談藍(lán)色，外周為深藍(lán)色。白色菌落偶爾也在中央出現(xiàn)一個(gè)淡藍(lán)色斑點(diǎn)，但其 外周無色。a互

10、補(bǔ)藍(lán)白斑選擇15三、插入失活這種方法只能用于比較老的載體（如pBR322,這些載體帶有兩個(gè)或更多個(gè)抗生素抗性基因和分布適宜的限制酶切位 點(diǎn)。待插入的DNA及已純化的質(zhì)粒DNA都用限制酶消化，這些酶的識(shí)別位點(diǎn)只位 于一個(gè)抗生素抗性基因區(qū)內(nèi)。在適宜濃度下將兩個(gè)DNA連接后，用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，選擇對(duì)第二種抗生素有抗性的轉(zhuǎn)化體。1617在氨葦青霉素存在下生長的菌落，一些含有重組質(zhì)粒，而另一些可能含有無外 源DNA而在連接過程中自身環(huán)化的質(zhì)粒 DNA。為區(qū)別兩種轉(zhuǎn)化體，用兩種分別含 有氨葦青霉素和四環(huán)素的平板，在互相對(duì)應(yīng)的位置上，各自接入同一菌落。在四環(huán)素 平板中存活并生長的菌落沒有外源 DNA插

11、入。在四環(huán)素平皿中不生長而在氨葦青霉素平板中生長的菌落含有帶失活的terr基因的質(zhì)粒，這些質(zhì)粒可能帶有外源DNA 序列。18通過滅活質(zhì)粒所攜帶的抗生素抗性基因來篩選外源DNA的插入19?Figure 4.18. Recombinant selection withpBR322. See text for details. The inset shows how replica plating is performed.20四、雜交篩選一種在硝酸纖維素濾膜上原位裂解細(xì)菌菌落并使釋放出的DNA非共價(jià)結(jié)合于濾膜的方法，結(jié)合于濾膜上的DNA可與相應(yīng)的放射性標(biāo)記核酸探針進(jìn)行雜交。是鑒定含目的DNA的重組

12、質(zhì)粒最常用的技術(shù)。很容易同時(shí)篩選數(shù)十萬個(gè)細(xì)菌 菌落,從中找出帶有含靶序列的重組質(zhì)粒的菌落，最后，小量制備質(zhì)粒DNA進(jìn)行限制 酶切分析和Southern雜交以證實(shí)這些質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)。21固體支持體及其特點(diǎn)：1尼龍膜:最耐用，可以承受幾輪雜交及高溫洗膜操作，可用于不同的探針依次篩 選的情況。2Whatman 541濾紙:有很高的濕強(qiáng)度，主要用于篩選一些基因文庫。（保存在微，用于雜交量滴定板各個(gè)孔內(nèi)的單菌落復(fù)印菌落轉(zhuǎn)移到濾紙上。裂解、固定3硝酸纖維素濾膜：與Whatman 541濾紙相比雜交信號(hào)較強(qiáng)，更適合常規(guī)的細(xì)菌 篩選。22?現(xiàn)有許多方法可用于放射性探針在溶液中與固定在濾膜上的核酸的雜交，這些方法在

13、以下方面有所不同：1所用的溶劑和溫度（如于68c在水溶液中或于42c在50%甲酰胺中。2溶劑的體積和雜交的時(shí)間（體積大時(shí)可長達(dá)3天,或體積最小時(shí)，短至4小時(shí)。3振搖的程度和方法（持續(xù)搖動(dòng)或固定。4阻斷探針對(duì)固相基質(zhì)表面的非特異性吸附的試劑，如Denhardt試劑或BLOTID。5標(biāo)記探針的濃度及其比活度。6可增進(jìn)核酸重締合率的化合物，如葡聚糖硫酸酯或聚乙二醇的使用情況。7雜交后洗膜的嚴(yán)格程度。23（一將少數(shù)菌落轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上適用于對(duì)分散在若干個(gè)瓊脂平板上的少數(shù)菌落 （100200進(jìn)行篩選。將這些菌 落歸并到一個(gè)瓊脂主平板，和第二個(gè)瓊脂平板表面的一張濾膜上。培養(yǎng)一段時(shí)間后 對(duì)菌落進(jìn)行原位

14、裂解。主平板貯存于 4 C直至得到篩選結(jié)果。1在含有選擇性抗生素的瓊脂平板上放一張濾膜。2用無菌牙簽將各個(gè)菌落先 轉(zhuǎn)移至濾膜上，再轉(zhuǎn)移至含有選擇性抗生素但未放濾膜的瓊脂主平板上。按一定的格子進(jìn)行劃線接種（或打點(diǎn),劃出長23mm的短線。每一菌落應(yīng)分別劃線于兩個(gè)平板的相同位置上。在濾 膜和主平板上同時(shí)劃一個(gè)含有非重組質(zhì)粒（如pBR322的菌落。（陰性對(duì)照以區(qū)分放 射性標(biāo)記探針與重組質(zhì)粒的特異性退火和非特異性的雜交背景。243倒置平板，于37c培養(yǎng).直至劃線的細(xì)菌生長達(dá)到0.51.0mm的寬度。4用針頭穿透濾膜直達(dá)其下的瓊脂，在硝酸纖維素濾膜3個(gè)以上的不對(duì)稱位置作 標(biāo)記。在主平板相同的位置上也作上標(biāo)

15、記。5用Para巾lm膜封好主平板，倒置貯放于4C ,直至獲得雜交反應(yīng)的結(jié)果。6裂解細(xì)菌，使DNA結(jié)合于硝酸纖維素濾膜。25（二將菌落影印在硝酸纖維素濾膜上？方法一：適用于必須通過雜交來篩選大量菌落時(shí)，如用質(zhì)粒載體構(gòu)建的cDNA文庫轉(zhuǎn)化細(xì)菌并鋪平板。這時(shí)直接用轉(zhuǎn)化混合物 將細(xì)菌鋪于一張無去污劑的硝酸纖維素濾膜上，然后通過濾膜與濾膜之間的接觸制 備影印濾股。26?方法二：適用于同時(shí)從瓊脂平板表面把許多細(xì)菌菌落轉(zhuǎn)到硝酸纖維濾素膜上。可用于任 意大小的菌落，但小菌落（0.10.2mm效果最佳，與較大的菌落相比，小菌落的雜交信息 更清晰，而彌散程度更低。可用此技術(shù)在每張 138mm濾膜上篩選多達(dá)2X0

16、4個(gè)菌落 或在每張82mm濾膜土篩選104個(gè)菌落。27操作：1、方法11用一支軟鉛筆或圓珠筆給干的無去污劑的硝酸纖維素濾膜編號(hào),然后用水浸濕，將其夾在于的Whatman 3mm濾紙中間，用錫箔包裹整 疊夾好的濾膜，高壓蒸氣滅菌151bf/in2（1.034x105Pa準(zhǔn)備足夠的濾膜以使用每個(gè) 平板制備1張主濾膜和2張影印濾膜。2用無菌平頭銀子把一張無菌濾膜放到前一 大制備的含相應(yīng)抗生素的LB（或SOB瓊脂平板上，編號(hào)的一面朝下，當(dāng)濾膜徹底濕潤 后,將濾膜從瓊脂平板上剝離，編號(hào)的一面朝上放到瓊脂表面上。283將懸于體積較小的液體中的細(xì)菌放到位于瓊脂平板表面的濾膜中央。用一無 菌的玻璃涂布器均勻地

17、將菌液涂布在濾膜表面，濾膜的邊緣留出23mm寬的無菌邊 界。平板（不倒置半開蓋幾分鐘使接種物蒸發(fā)，蓋好，倒置平皿。于37c培養(yǎng)至小菌 落（直彳至0.10.2mm出現(xiàn)（約810小時(shí)。4將濾膜（菌落面朝上轉(zhuǎn)到含相應(yīng)抗生素和 25%甘油的LB （或SOB瓊脂平板上, 于37c培養(yǎng)2小時(shí)。5用Para刊m膜封好平板，倒置裝在一密15的塑料袋內(nèi)，于-20C貯存。于室溫將 主平板（仍倒置融化，即可制備影印濾膜。296按下述方法制各影印濾膜:a.事先準(zhǔn)備一疊 Whatman 3MM濾紙（每張濾膜1張，略有富余，切成比濾膜稍大 一些，高壓下蒸氣滅菌10分鐘b .從貯存平板剝下主濾膜，菌露面朝上放在濕的無菌 3

18、mm濾紙上。c將一張濕的無菌硝酸纖維素濾膜編號(hào)，放在主濾膜上，注意防止兩張濾膜間留 有氣泡。避免濾膜間相互發(fā)生移位。但使它們不致恰好重疊，分離兩張濾膜時(shí)會(huì)容易些。d.用絲絨影印鋪板器或一個(gè)重玻璃平皿（在玻璃和濾膜之間有一張3mm濾紙 將兩張濾膜緊緊地壓在一起。30e.針頭在兩張濾膜上制作一系列定位標(biāo)記孔。f.分開兩張濾膜，把影印濾膜放到一新鮮的含相應(yīng)抗生素的 LB （或SOB瓊脂平 板上，于37c培養(yǎng)至出現(xiàn)菌落（46小時(shí)。g.將主濾膜重新放回一新鮮的合相應(yīng)抗生素和 25%甘油的LB （或SOB瓊脂平 板上。于37c培養(yǎng)1小時(shí)，然后按步驟5進(jìn)行凍存處理。7裂解細(xì)菌,釋放的DNA結(jié)合到影印濾股上。

19、維素濾膜上的細(xì)菌菌落用影印鋪板器復(fù)印生長在硝酸纖2.方法2 .方法2 1）直接將細(xì)菌懸液鋪于含相應(yīng)抗生素的 LB （或SOB）瓊）直接將細(xì) 菌懸液鋪于含相應(yīng)抗生素的LB （ SOB）脂平板培養(yǎng)表面。將平板半開蓋放在層流 式通風(fēng)櫥到瓊 脂表面完全干燥，蓋好平皿倒置放于 37c培養(yǎng)1214小脂表面完 全干燥，蓋好平皿倒置放于 37c培養(yǎng)1214小時(shí)。于4c放置3060分鐘。 時(shí)。于4放置3060分鐘。2）用鉛筆或圓珠筆將硝酸纖維濾膜編號(hào)。編號(hào)的一 面超下，將濾膜放到LB （或SOB）瓊脂培養(yǎng)基表面，與菌落 下，將濾膜放到LB（SOB）接觸直到膜完全濕潤。用針頭穿透濾膜和下面的瓊脂作3個(gè)或3個(gè)以上的

20、不對(duì)稱標(biāo)記。個(gè)或3 3）用平頭銀子剝離濾膜。31 32 4）有幾種方法選擇：a.使 粘在濾膜上的細(xì)菌立即裂解，釋放的 DNA結(jié)合于濾膜上。a.使粘在濾膜上的細(xì)菌 立即裂解，釋放的DNA結(jié)合于濾膜上。b.菌落向上使膜放在新配制的含相應(yīng)抗生 素的LB （或SOB）瓊脂平b.菌落向上使膜放在新配制的含相應(yīng)抗生素的 LB（SOB）板的表面。培養(yǎng)幾小時(shí)后細(xì)菌長到 23mm時(shí)可裂解菌落。板的表面。 培養(yǎng)幾小時(shí)后細(xì)菌長到2 mm時(shí)可裂解菌落。c.可將濾膜轉(zhuǎn)移至含氯霉素（170200ug/ml）的瓊脂平板上，于c.可將濾膜轉(zhuǎn)移至含氯霉素（170200ug/ml） 37c培養(yǎng)12小時(shí)（擴(kuò)增）。在正常情況下，不用

21、擴(kuò)增，就可以雜37c培養(yǎng)12小時(shí)（擴(kuò)增）。在正常情況下，不用擴(kuò)增，就可以雜交檢出克隆化的DNA序列。只有當(dāng)載體可進(jìn)行松弛型復(fù)制時(shí)，才 交檢出克隆化的DNA序列。只有當(dāng)載體可進(jìn)行 松弛型復(fù)制時(shí)，才 能進(jìn)行擴(kuò)增。d,可用濾膜來制備第二張影印濾膜，使帶菌落的 面朝上，將濾膜 放在新鮮的含相應(yīng)抗生素的LB （或SOB）瓊脂平板表面，然后小 放在新鮮的含相應(yīng)抗生素的LB （ SOB）心地將第2張干的硝酸纖維素濾膜放到第 1張濾膜上，并與之對(duì)準(zhǔn)。心地將第2張干的硝酸纖維素濾膜放到第1將濾膜夾層一起放于37c培養(yǎng)數(shù)小時(shí)。將濾膜夾層一起放于37c培養(yǎng)數(shù)小時(shí)。（三）菌落的 裂解及DNA結(jié)合于硝酸纖維素濾膜（三）

22、菌落的裂解及DNA結(jié)合于硝酸纖維素 濾膜介紹兩種方法，都應(yīng)盡力避免將任何溶液留在濾膜的上表面，盡力避免在濾膜下面留有氣泡。1.方法1: 1.方法1 1）切4張大小及形狀適宜的 Whatman 3mm 濾紙，端正地放）切4張大小及形狀適宜的 Whatman 3mm濾紙，端正地放于4 個(gè)玻璃盤或塑料盤的底部，每張 3mm濾紙用下面溶液 個(gè)玻璃盤或塑料盤的底部， 每張3 mm濾紙用下面溶液 中的一種飽和：a.10% SDS （可用可不用）。a.10% SDS （ b.變性液（0.5mol/L Na0H、1.5mol/L NaCl） 。 b.變性液（0.5mol/ Na0H、1.5mol/ NaCl）

23、 。 c.中和液1.5mol/L Nacl 0.5mol/L Tris Cl c.中和液 1.5mol/ 0.5mol/ Tris （pH7.4） pH7.4） d. 2>SSC。SSC。倒掉任何多余的 液體34 5）于37c培養(yǎng)主平板57小時(shí)直到菌落再生，用）于37c培養(yǎng)主平板5 Para巾lm膜封好，倒置貯放于4C。Para巾lm膜封好，倒置貯放于4 33 2）用平頭 銀子把硝酸纖維素濾膜從平板上剝離下來，菌落面朝上放于浸過SDS的濾紙上，可以限制質(zhì)粒DNA在變落面朝上放于浸過SDS的濾紙上，可以限制質(zhì)粒 DNA在 變性和中和期間發(fā)生擴(kuò)散。3）第1張濾膜在SDS溶液中暴露3分鐘后將其

24、轉(zhuǎn)到 第2張用）第1張濾膜在SDS溶液中暴露3分鐘后將其轉(zhuǎn)到第2變性液飽和的濾 紙上。按順序進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，使之暴露于變 性75分鐘。性75 4）將濾膜轉(zhuǎn)到第3張 用中和液飽和的濾紙上，放置 5分鐘。）將濾膜轉(zhuǎn)到第3張用中和液飽和的濾紙 上，放置5 5）將濾膜轉(zhuǎn)到一張用2XSSC飽和的濾紙上，作用5分鐘。）將濾膜轉(zhuǎn) 到一張用2 SSC飽和的濾紙上，作用5 6）使菌落面朝上，將濾膜放到一張干的濾紙上，于室溫 干燥至少30分鐘。干燥至少30分鐘。7）將濾膜夾在兩張干的濾 紙之間，于80c干烤12小時(shí)，）將濾膜夾在兩張干的濾紙之間，于 80c干烤1 以固定DNA。以固定DNA 8）將固定好的膜與32P標(biāo)記

25、的探針雜交35 2.方法 2: 方法2 1）每一張濾膜，在一包裝膜上制作一個(gè)裝有 0.5mol/L ）每一張濾 膜，在一包裝膜上制作一個(gè)裝有 0.5mol/ NaOH的小洼（0.75ml）,使菌落面朝 上，將濾膜放到NaOH的小洼（0.75ml）,使菌落面朝上，將濾膜放到 小洼上， 展平Saran包裝膜，使濾膜均勻濕潤，讓濾膜 小洼上，展平Saran包裝膜，使濾膜 均勻濕潤，讓濾膜 留于原處23分鐘。留于原處2 2）用干的紙巾從濾膜的下方 吸干濾膜，用一張新的Saran）用干的紙巾從濾膜的下方吸干濾膜，用一張新的 Saran包裝和新配制的0.5mol/L NaOH重復(fù)步驟1）。包裝和新配制的0

26、.5mol/ NaOH重復(fù)步驟1 3）再次吸干濾膜，將濾膜轉(zhuǎn)移到新的帶有1mol/L ）再次吸干濾膜，將濾膜轉(zhuǎn)移到新的帶有1 mol/ TrisCl （pH7.4）的Saran包裝膜小洼上。5 分鐘后，Tris pH7.4） Saran包裝膜小洼上。5吸干濾膜，用一張新的Saran包裝 膜和新的1mol/L吸干濾膜，用一張新的Saran包裝膜和新的1 mol/ Tris Cl（pH7.4）重復(fù)該步驟。 Tris pH7.4） 36 6（四）雜交4）吸干濾膜，把它轉(zhuǎn)到新的帶有 1.5mol/L NaCL 0.5mol ）吸干 濾膜，把它轉(zhuǎn)到新的帶有1.5mol/L Tris C1 （pH7.4）

27、的包裝膜小洼上，5分鐘 后，吸Tris C1 （ pH7.4）的包裝膜小洼上，5干濾膜，把它轉(zhuǎn)移到一張干的濾紙 上，于室溫晾至少20干濾膜，把它轉(zhuǎn)移到一張干的濾紙上，于室溫晾至少2030分鐘，使濾膜干燥。30分鐘，使濾膜干燥。5）將濾膜夾在兩張干的濾紙之 問，于80干烤2小時(shí)，以固）將濾膜夾在兩張干的濾紙之間，于 80干烤2定 DNA。DNA 0 6）將固定在膜上的DNA與32P標(biāo)記的探針雜交。將固定在膜上 的DNA與該方案可用于30張直徑為82mm的圓形硝酸纖維素濾膜。可 該方案可 用于30張直徑為82mm的圓形硝酸纖維素濾膜。可根據(jù)雜交反應(yīng)中所用濾膜的數(shù) 量和大小適當(dāng)調(diào)整體積。37 1）盤

28、內(nèi)盛有2XSSC,將烤干的濾膜飄浮在液面上， 直到）盤內(nèi)盛有2 SSC,濾膜從下到上徹底浸濕。浸泡 5分鐘。濾膜從下到上徹 底浸濕。浸泡5 2）將濾膜轉(zhuǎn)到一個(gè)盛有200ml預(yù)洗液的玻璃皿中，將濾膜）將濾 膜轉(zhuǎn)到一個(gè)盛有200ml預(yù)洗液的玻璃皿中，將濾膜 一張張疊在一起，放于溶液中。用Saran包裝膜蓋住結(jié)一張張疊在一起，放于溶液中。用 Saran包裝膜蓋住結(jié) 品皿，放到位于培養(yǎng)箱內(nèi)的旋轉(zhuǎn)平臺(tái)上。在這一步及以后的所有步驟中，應(yīng)緩緩搖動(dòng)濾膜，防止它們粘在一起，于50c溫育30分鐘。50c溫育30分鐘。預(yù)洗液：5 冶SC 0.5%SDS 0.5% 38 1mmol/L EDTA （pH8.0） 1m

29、mol/ EDTA（pH8.0） 3）用泡過預(yù)洗液的紙輕輕地從膜表面拭去細(xì)菌碎片，這 樣可以降低雜 交背景而不影響陽性雜交信號(hào)的強(qiáng)度或清晰度。4）將濾膜轉(zhuǎn)到盛有150ml預(yù)雜 交液的玻璃皿中，在適宜溫）將濾膜轉(zhuǎn)到盛有150ml預(yù)雜交液的玻璃皿中，在適 宜溫度（即在水溶液中雜交時(shí)用 68c而在50%甲酰胺中雜交 度（即在水溶液中雜 交時(shí)用68c而在50%甲酰胺中雜交 時(shí)用42C）下，溫育12小時(shí)。時(shí)用42C） 下，溫育1 5）將32P標(biāo)記的雙鏈DNA探針于100c加熱5分鐘，使其變 標(biāo)記的 雙鏈DNA探針于100c加熱5性。迅速將探針放冰浴中冷卻。單鏈探針不必變 性。將探針加入覆蓋濾膜的預(yù)雜交液中，在適當(dāng)溫度下，溫育直至達(dá)到13>Cot1/2雜交期間，盛濾膜的容器應(yīng) 溫育直至達(dá)到1雜交期間，蓋嚴(yán)以防液體蒸 發(fā)。6）雜交結(jié)束后，去除雜交液，立即于室溫把濾膜放入大體積（ 300500ml）的 2XSSC和 0.1%SDS溶液中，輕 體積（300500ml） SSC和 0.1% SDS 溶液中，輕 輕振搖。在洗膜過程中，至少將濾膜