1、高效液相色譜儀基本原理、應(yīng)用及常見故障（概要）1 高效液相色譜儀的系統(tǒng)組成、工作原理&c l#a-k8W6c-eP  高效液相色譜儀的系統(tǒng)由儲液器、泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測器、記錄儀等幾部分組成。儲液器中的流動相被高壓泵打入系統(tǒng),樣品溶液經(jīng)進(jìn)樣器進(jìn)入流動相,被流動相載入色譜柱(固定相) 內(nèi), 由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數(shù), 在兩相中作相對運動時, 經(jīng)過反復(fù)多次的吸附- 解吸的分配過程, 各組分在移動速度上產(chǎn)生較大的差別, 被分離成單個組分依次從柱內(nèi)流出, 通過檢測器時, 樣品濃度被轉(zhuǎn)換成電信號傳送到記錄儀,數(shù)據(jù)以圖譜形式打印出來。&O_A

2、6?0J Q5)b"t'g" k-r) U' U.d$J'O 2 高效液相色譜儀的應(yīng)用T8m9f:P  高效液相色譜法只要求樣品能制成溶液, 不受樣品揮發(fā)性的限制,流動相可選擇的范圍寬,固定相的種類繁多,因而可以分離熱不穩(wěn)定和非揮發(fā)性的、離解的和非離解的以及各種分子量范圍的物質(zhì)。Mk%t.NB+D   與試樣預(yù)處理技術(shù)相配合,HPL C 所達(dá)到的高分辨率和高靈敏度, 使分離和同時測定性質(zhì)上十分相近的物質(zhì)成為可能,能夠分離復(fù)雜相體中的微量成分。隨著固定相的發(fā)展, 有可能在充分保持生化物質(zhì)活性的條件下完成其分離。h

3、1z Lz#Tqo1m   HPL C 成為解決生化分析問題最有前途的方法。由于HPL C具有高分辨率、高靈敏度、速度快、色譜柱可反復(fù)利用, 流出組分易收集等優(yōu)點,因而被廣泛應(yīng)用到生物化學(xué)、食品分析、醫(yī)藥研究、環(huán)境分析、無機(jī)分析等各種領(lǐng)域。高效液相色譜儀與結(jié)構(gòu)儀器的聯(lián)用是一個重要的發(fā)展方向。:fEq3n4I   液相色譜- 質(zhì)譜連用技術(shù)受到普遍重視, 如分析氨基甲酸酯農(nóng)藥和多核芳烴等; 液相色譜- 紅外光譜連用也發(fā)展很快,如在環(huán)境污染分析測定水中的烴類, 海水中的不揮發(fā)烴類, 使環(huán)境污染分析得到新的發(fā)展。jfD2Ib PpL6q.n O9lOZG 3 高

4、效液相色譜儀常見故障處理j7LC&O*_$D   L C - 10A T 高效液相色譜儀是日本島津公司1996 年的產(chǎn)品, 檢測器為可變波長紫外檢測器, 色譜柱為島津公司的ODS - C18 ,大連依利特的ODS -C18 。O%j V:IR  八年的日常工作中遇到了幾種故障,如故障1 經(jīng)咨詢島津公司的工程師后,得以解決;故障2、故障5 是頻繁碰到的問題等,特作總結(jié)如下:+xI0LR/Ny%S"L-M$dD oq'?! 故障1   流動相內(nèi)有氣泡, 關(guān)閉泵, 打開泄壓閥, 打開p urge鍵, 清洗脫氣, 氣

5、泡不斷從過濾器冒出, 進(jìn)入流動相, 無論打開p urge 鍵幾次,都無法清除不斷產(chǎn)生的氣泡。al k*mlMH  原因過濾器長期沉浸于乙酸銨等緩沖液內(nèi), 過濾器內(nèi)部由于霉菌的生長繁殖,形成菌團(tuán),阻塞了過濾器,緩沖液難以流暢地通過過濾器,空氣在泵的壓力作用下經(jīng)過濾器進(jìn)入流動相。.Q ?CUks   處理過濾器浸泡于5 %硝酸溶液中,超聲清洗幾分鐘即可;亦可將過濾器浸泡于5 %硝酸溶液中1236 小時, 輕輕震蕩幾次, 再將過濾器用純水清洗幾次, 打開泄壓閥, 打開p urge 鍵,清洗脫氣, 如仍有氣泡不斷從過濾器冒出, 繼續(xù)將過濾器浸泡于5 %硝酸溶液中

6、,如沒有氣泡不斷從過濾器中冒出,說明過濾器內(nèi)部的霉菌菌團(tuán)已被硝酸破壞, 流動相可以流暢地通過過濾器。打開泄壓閥,打開泵,流速調(diào)至1. 03. 0ml/ min ,純水沖洗過濾器1 小時左右。即可將過濾器清洗干凈。關(guān)閉泄壓閥,純甲醇沖洗半小時即可。 f*ne)ot*ylN$u5wqym:pT)w-r 故障2   柱壓高原因(1) 緩沖液鹽分如(乙酸銨等) 沉積于柱內(nèi); (2) 樣品污染沉積。 N-pX4A6o!A _  處理對于第一種情況先用4050 的純水,低速正向沖洗柱子, 待柱壓逐漸下降后, 相應(yīng)提高流速沖洗, 柱壓大幅度下降后, 用常溫純水沖洗,

7、之后用純甲醇沖洗柱子30 分鐘; 對于第二種情況,由樣品的沉積引起污染的C18柱,和純水反向沖洗柱子, 然后換成甲醇沖洗, 接著用甲醇+ 異丙醇(4 + 6) 沖洗柱子(沖洗時間的長短由樣品污染的情況而定) , 再用換成甲醇沖洗, 然后用純水沖洗, 最后甲醇沖洗正向沖洗柱子30 分鐘以上。N-q Q6S%rn-x9cO!9kb$c i$h 故障3   既無壓力指示,又無液體流過1 >。 UP2nV E3?1UQ P  原因(1) 泵密封墊圈磨損; (2) 大量氣泡進(jìn)入泵體。*b,|/w3Cw   處理對于第一種情況,更換密封墊圈

8、;對于第二種情況,在泵作用的同時, 用一個50ml 的玻璃針筒在泵的出口處幫助抽出空氣。1Ti8|Kf0nTF(KF|F0O 故障4   壓力波動大,流量不穩(wěn)定. *CcJ$e"Q.uU  原因系統(tǒng)中有空氣或者單向閥的寶石球和閥座之間夾有異物,使得兩者不能密封。k|4sU Q!  處理工作中注意觀察流動相的量, 保證不銹鋼濾器沉入儲液器瓶底,避免吸入空氣,流動相要充分脫氣2 >。如為單向閥和閥座之間夾有異物, 拆下單向閥, 放入盛有丙酮的燒杯用超聲波清洗.%j Y3o9W6tD-K 故障5   出峰

9、不佳,峰分叉。(Y:J'b3A  原因(1) 色譜柱被污染; (2) 柱頭填料塌陷。f#Wj(h!M1D7P   處理對于第一種情況, 先用純水反向沖洗柱子, 然后換成甲醇沖洗, 接著用甲醇+ 異丙醇(4 + 6) 沖洗柱子(沖洗時間的長短由樣品污染的情況而定) , 再換成甲醇沖洗, 然后用純水沖洗,最后甲醇沖洗正向沖洗柱子30 分鐘以上。如沖洗后依然出峰不佳,則考慮第二種情況。對于第二種情況,擰開柱頭,檢查柱填料是否硬結(jié)或塌陷。去除硬結(jié)部分(污染的填料) ,裝入新填料, 滴一滴甲醇, 填料下陷, 再填, 用與柱內(nèi)徑相同的頂端平滑的不銹鋼桿壓緊,

10、 再填平, 滴甲醇, 再壓緊反復(fù)幾次, 直至裝滿填平2 >。柱頭用甲醇沖洗干凈, 擦凈柱外壁的填料, 擰緊柱頭,用純甲醇沖洗30 分鐘以上。pcSoJ)O9gxV8B S%yE#V a.u故障6   峰面積重復(fù)性不佳。z R6VJ2E65SN   原因(1) 進(jìn)樣閥漏液; (2) 加樣針不到位。(J+L3 P,j%T.n,f$q   處理對于第一種情況更換進(jìn)樣閥墊圈; 對于第二種情況保證加樣針插到底,注射樣品溶液后須快速、平穩(wěn)地從LOAD 狀態(tài)轉(zhuǎn)換到INJ EC T 狀態(tài),以保證進(jìn)樣量的準(zhǔn)確。日常工作中, 液相色譜儀的保養(yǎng)非常重

11、要, 如要注意不要讓空氣進(jìn)入輸液系統(tǒng)和高壓泵中, 儲液器內(nèi)的溶液如長時間未用應(yīng)清洗儲液器并更換溶液, 每次用完色譜儀后緩沖液要用純水沖洗干凈,防止無機(jī)鹽析出或沉積; 樣品的前處理也很重要,任何樣品都要盡可能地去除雜質(zhì), 完全溶解, 盡量減少對色譜柱的污染, 以延長色譜柱的使用壽命, 同時避免注射過濃的樣品溶液, 以免殘留液在進(jìn)樣閥內(nèi)析出固體引起堵塞; 色譜柱作好標(biāo)記,用于不同分析目的的色譜柱不要混用等。o-?H i6icq5"ZU（from url/thread-183-1-8.html/url）2007-05-18 19:27 sally208

12、液相色譜儀色譜柱使用及維護(hù)每天用足夠的時間來平衡色譜柱，您就會在處理問題方面獲得最大的"補(bǔ)償"，而且您的色譜柱的壽命也會變得更長！- 一定得做！ W,UVS8y            新的色譜柱在使用之前應(yīng)該在您自己的液相色譜儀上進(jìn)行性能測試，即使用色譜柱附帶的檢驗報告上測試條件和樣品來測定該色譜柱的柱效。并且，在以后的使用中，應(yīng)時常對色譜柱進(jìn)行測試。 0AQ hH vgB P-W          平衡色譜柱 ZA B&LX9

13、e            反相色譜柱在經(jīng)過出廠測試后是保存在乙腈/水中的。請一定確保您所使用的流動相和乙腈/水互溶。由于色譜柱在儲存或運輸過程中可能會干掉，因此在用流動相分析樣品之前，應(yīng)使用1020倍柱體積的甲醇或乙腈平衡色譜柱；如果您所使用的流動相中含有緩沖鹽，應(yīng)注意用純水"過渡"。0te envTuC           硅膠柱或極性色譜柱在經(jīng)過出廠測試后是保存在正庚烷中的。如果該色譜柱需要使用含水的流動相，請在

14、使用流動相之前用乙醇或異丙醇平衡&iW M9d J            如何平衡色譜柱？ _8L&v-q yjpm/Q&L9            平衡過程中，將流速緩慢地提高I$           用流動相平衡色譜柱直到獲得穩(wěn)定的基線（緩沖鹽或離子對試劑度如果較低，則需要較長的時間來平衡）*$M3RU&Q i4;m M&

15、#160;          色譜柱的再生 進(jìn)行色譜柱再生時，應(yīng)使用一個謙價的泵，我們建議最好不使用您的高效液相色譜儀上的泵。 *s"/g'AjT7T            建議用來沖洗的溶劑體積)_L9u+b"l9d-G             注意：&W?q)m e6V       

16、60;      nC:Hd)d H            在對NH2改性的色譜柱進(jìn)行再生時，由于NH2可能成銨根離子的形式存在，因此應(yīng)該在水洗后用0.1M的氨水沖洗，然后再用水沖洗至堿溶液完全流出。   Kv sg nY0V    *如果簡單的有機(jī)溶劑/水的處理不能夠完全洗去硅膠表面吸附的雜質(zhì)，用0.05M稀硫酸沖洗非常有效。jw#pICg            色

17、譜柱的維護(hù) 3X"R)KoW T              1使用預(yù)柱保護(hù)分析柱（硅膠在極性流動相/離子性流動相中有一定的溶解度）DP R6s             2大多數(shù)反相色譜柱的pH穩(wěn)定范圍是27.5，盡量不超過該色譜柱的pH范圍4k,f qsW Rv Nh             3避免流動相組成及極性的劇烈變化8m hvFj:4r v

18、0H'g             4流動相使用前必須經(jīng)脫氣和過濾處理L0o'|yyX3H X)b5X              5如果使用極性或離子性的緩沖溶液作流動相，應(yīng)在實驗完畢柱子沖洗干凈，并保存大乙腈中(t2Sm i6E              6壓力升高是需要更換預(yù)柱的信號;EO3u4M      &

19、#160;       5C Udv?,S)F/L i3LE            卡套柱的安裝（不加預(yù)柱） $x5c i Z             1將卡套架套入柱芯| O_F A Cm44OG              2將兩片夾套片嵌入柱芯的凹槽，使柱芯高于夾套d j(c7d!mH&u   &

20、#160;          3將已套到柱芯上的卡套架向上推，直至高過夾套片UqC8w)cn              4將卡套帽和卡套架旋在一起，然后用手?jǐn)Q緊fDGI)dw              5然后依同樣的順序連接好柱子的另一端7v'bkq:G+U              6連接

21、到液相色譜儀，PEEK接頭手?jǐn)Q即可；若為不銹鋼接頭應(yīng)使用專用扳手yo)lF y!B r             注意：使用卡套柱時，兩端的卡套應(yīng)時刻連接在柱芯上。不管您是平衡色譜柱或是清洗，任何時候都不能將卡套取下來，否則會造成填料的流失。 hZ%fr cK.D            卡套柱的安裝 （加預(yù)柱）qvE#olu              1將卡套

22、架套入柱芯GB5m;Q4j/C8I(XU              2將兩片夾套片嵌入柱芯的凹槽，使夾套高于柱芯X3V#zAX!             3將已套到柱芯上的卡套架向上推，直至高過夾套片);K we9a r f7             4將"子彈頭"預(yù)柱放入卡套片內(nèi)cM bO5?Y              5將卡套帽和卡套架旋在一起，然后用手?jǐn)Q緊e$n4M4S9f ?,P b'nPP              6然后依同樣的順序連接好柱子的另一端X$x :owY&X              /KG:I             總而言之p Y _)W0A!OIdI)W Z &