1、一、目的要求一、目的要求1、鞏固顯微鏡的使用方法；、鞏固顯微鏡的使用方法；2、掌握細菌的簡單染色和革蘭氏染色的原、掌握細菌的簡單染色和革蘭氏染色的原 理和方法。理和方法。第1頁/共20頁二、基本原理二、基本原理第2頁/共20頁 用于生物染色的染料主要有堿性染料、酸性染用于生物染色的染料主要有堿性染料、酸性染料和中性染料三大類。料和中性染料三大類。 堿堿性染料的離子帶性染料的離子帶正正電荷，能和帶負電荷的物質電荷，能和帶負電荷的物質結合。因細菌蛋白質等電點較低，當它生長于中結合。因細菌蛋白質等電點較低，當它生長于中性、堿性或弱酸性的溶液中時常帶負電荷，所以性、堿性或弱酸性的溶液中時常帶負電荷，所

2、以通常采用堿性染料（如美蘭、結晶紫、堿性復紅通常采用堿性染料（如美蘭、結晶紫、堿性復紅或孔雀綠等）使其著色。或孔雀綠等）使其著色。 酸酸性染料的離子帶性染料的離子帶負負電荷，能與帶正電荷的物質電荷，能與帶正電荷的物質結合。當細菌分解糖類產酸使培養基結合。當細菌分解糖類產酸使培養基pH下降時，下降時，細菌所帶正電荷增加，因此易被伊紅、酸性復紅細菌所帶正電荷增加，因此易被伊紅、酸性復紅或剛果紅等酸性染料著色。或剛果紅等酸性染料著色。 中性染料是前兩者的結合物又稱復合染料，如伊中性染料是前兩者的結合物又稱復合染料，如伊紅美蘭、伊紅天青等。紅美蘭、伊紅天青等。第3頁/共20頁簡單染色法簡單染色法是只用

3、一種染料使細菌著色以顯示其形態，簡單染色不能辨別細菌是只用一種染料使細菌著色以顯示其形態，簡單染色不能辨別細菌細胞的構造。細胞的構造。革蘭氏染色法革蘭氏染色法是是1884年由丹麥病理學家年由丹麥病理學家C.Gram所創立的。革蘭氏染色法可將所創立的。革蘭氏染色法可將所有的細菌區分為革蘭氏陽性菌（所有的細菌區分為革蘭氏陽性菌（G+）和革蘭氏陰性菌（）和革蘭氏陰性菌（G-）兩大類，是細）兩大類，是細菌學上最常用的鑒別染色法。該染色法所以能將細菌分為菌學上最常用的鑒別染色法。該染色法所以能將細菌分為G+菌和菌和G-菌，是由菌，是由這兩類菌的這兩類菌的細胞壁結構和成分的不同細胞壁結構和成分的不同所決定

4、的。所決定的。第4頁/共20頁革蘭氏陽性和陰性菌細胞壁成分比較革蘭氏陽性和陰性菌細胞壁成分比較成分成分 占細胞壁干重的占細胞壁干重的% 革蘭氏陽性菌革蘭氏陽性菌 革蘭氏陰性菌革蘭氏陰性菌肽聚糖肽聚糖 含量很含量很高高（50-9050-90） 含量很含量很低低（1010）磷壁酸磷壁酸 含量較高（含量較高（5050） 無無類脂質類脂質 一般一般無無（ 2 2） 含量較高（含量較高（2020）蛋白質蛋白質 無無 含量較高含量較高第5頁/共20頁v G-菌菌的細胞壁中含有較多易被的細胞壁中含有較多易被乙醇乙醇溶解的類脂質，而且肽聚糖層較薄、交溶解的類脂質，而且肽聚糖層較薄、交聯度低，故用乙醇或丙酮脫色

5、時溶解了類脂質，增加了細胞壁的通透性，聯度低，故用乙醇或丙酮脫色時溶解了類脂質，增加了細胞壁的通透性，使使結晶紫和碘的復合物結晶紫和碘的復合物易于滲出，結果細菌就被脫色，再經易于滲出，結果細菌就被脫色，再經沙黃沙黃復染后就復染后就成紅色。成紅色。v G 菌菌細胞壁中肽聚糖層厚且交聯度高，類脂質含量少，經脫色劑處理后反細胞壁中肽聚糖層厚且交聯度高，類脂質含量少，經脫色劑處理后反而使肽聚糖層的孔徑縮小，通透性降低，因此細菌仍保留初染時的顏色。而使肽聚糖層的孔徑縮小，通透性降低，因此細菌仍保留初染時的顏色。第6頁/共20頁三、實驗器材三、實驗器材1、材料、材料 培養培養12-16h的枯草桿菌（的枯草

6、桿菌（Bacillus subtilis），），培養培養24小時的大腸桿菌（小時的大腸桿菌（Escherichia coli）2、染色液和試劑、染色液和試劑 草酸銨結晶紫、碘液、草酸銨結晶紫、碘液、95%乙醇、沙黃、乙醇、沙黃、二甲苯、香柏油二甲苯、香柏油3、器材、器材 廢液缸、洗瓶、載玻片、接種環、酒精燈、廢液缸、洗瓶、載玻片、接種環、酒精燈、擦鏡紙、顯微鏡等。擦鏡紙、顯微鏡等。第7頁/共20頁四、實驗方法及步驟四、實驗方法及步驟1、簡單染色、簡單染色（1）涂片）涂片 取干凈載玻片一塊，在載玻片的左、取干凈載玻片一塊，在載玻片的左、右各加一滴蒸餾水，按無菌操作法取菌涂片，右各加一滴蒸餾水，按

7、無菌操作法取菌涂片，左邊涂枯草桿菌，右邊涂大腸桿菌左邊涂枯草桿菌，右邊涂大腸桿菌，做成濃，做成濃菌液。再取干凈載玻片一塊將剛制成的枯草菌液。再取干凈載玻片一塊將剛制成的枯草桿菌液挑桿菌液挑2-3環涂在左邊制成薄的涂面，將大環涂在左邊制成薄的涂面，將大腸桿菌的濃菌液取腸桿菌的濃菌液取2-3環涂在右邊制成薄涂面。環涂在右邊制成薄涂面。亦可直接在載玻片上制薄的涂面，注意取菌亦可直接在載玻片上制薄的涂面，注意取菌不要太多。不要太多。第8頁/共20頁第9頁/共20頁（2）晾干）晾干 讓涂片自然晾干或者在酒精燈火焰上方讓涂片自然晾干或者在酒精燈火焰上方文文 火烘干。火烘干。（3）固定）固定 手執玻片一端，

8、讓菌膜朝上，通過火焰手執玻片一端，讓菌膜朝上，通過火焰2-3 次固定（以不燙手為宜）。次固定（以不燙手為宜）。（4）染色）染色 將固定過的涂片放在廢液缸上的擱架上，將固定過的涂片放在廢液缸上的擱架上， 加加沙黃沙黃染色染色1-2min。（5）水洗）水洗 用水洗去涂片上的染色液。用水洗去涂片上的染色液。（6）干燥）干燥 將洗過的涂片放在空氣中晾干或用吸水將洗過的涂片放在空氣中晾干或用吸水紙紙 吸干。吸干。（7）鏡檢）鏡檢 先低倍觀察，再高倍觀察，并找出適當先低倍觀察，再高倍觀察，并找出適當的的 視野后，將高倍鏡轉出，在涂片上加視野后，將高倍鏡轉出，在涂片上加香柏香柏 油一滴，將油鏡頭浸入油滴中仔

9、細調油一滴，將油鏡頭浸入油滴中仔細調焦觀焦觀 察細菌的形態。察細菌的形態。第10頁/共20頁涂片涂片干燥干燥固定固定染色染色水洗水洗鏡檢鏡檢簡單染色方法簡單染色方法干燥干燥第11頁/共20頁2、革蘭氏染色、革蘭氏染色（1）涂片）涂片 與簡單染色涂片相同；與簡單染色涂片相同；（2）晾干）晾干 與簡單染色法相同；與簡單染色法相同；（3）固定）固定 與簡單染色法相同；與簡單染色法相同；（4）初染）初染 將玻片置于廢液缸玻片擱架上，加適量（以蓋滿細菌涂面）的將玻片置于廢液缸玻片擱架上，加適量（以蓋滿細菌涂面）的結晶紫結晶紫染色液染色染色液染色1min；（5）水洗）水洗 傾去染色液，用水小心地沖洗；傾去

10、染色液，用水小心地沖洗；第12頁/共20頁（6）媒染）媒染 滴加滴加碘液碘液，媒染，媒染1min；（7）水洗）水洗 用水洗去碘液；用水洗去碘液；（8）脫色）脫色 將玻片傾斜，連續滴加將玻片傾斜，連續滴加95%乙醇乙醇脫色脫色2 0-25s至流出液無色，立即水洗；至流出液無色，立即水洗；（9）復染）復染 滴加滴加沙黃沙黃復染復染5min；（10）水洗）水洗 用水洗去涂片上的沙黃染色液；用水洗去涂片上的沙黃染色液；（11）晾干）晾干 將染好的涂片放空氣中晾干或者用吸將染好的涂片放空氣中晾干或者用吸 水紙吸干；水紙吸干；（12）鏡檢）鏡檢 鏡檢時先用低倍，再用高倍，最后用鏡檢時先用低倍，再用高倍，最

11、后用油油 鏡觀察，并判斷菌體的革蘭氏染色鏡觀察，并判斷菌體的革蘭氏染色反應反應 性。性。第13頁/共20頁第14頁/共20頁五五 注意事項注意事項1、革蘭氏染色成敗的關鍵是、革蘭氏染色成敗的關鍵是酒精脫色酒精脫色。如脫。如脫色過度，革蘭氏陽性菌也可被脫色而染成陰色過度，革蘭氏陽性菌也可被脫色而染成陰性菌；如脫色時間過短，革蘭氏陰性菌也會性菌；如脫色時間過短，革蘭氏陰性菌也會被染成革蘭氏陽性菌。脫色時間的長短還受被染成革蘭氏陽性菌。脫色時間的長短還受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影響，難涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影響，難以嚴格規定，需要多加練習；以嚴格規定，需要多加練習；2、選用、選用幼齡的細菌幼齡的細菌。G+菌培養菌培養12h-16h，E.coli培養培養24h。若菌齡太老，由于菌體死亡。若菌齡太老，由于菌體死亡或自溶常使革蘭氏陽性菌轉呈陰性反應。或自溶常使革蘭氏陽性菌轉呈陰性反應。第15頁/共20頁六六 思考題及作業題思考題及作業題1、