1、酪氨酸激酶抑制劑逆轉黏附誘導的骨髓瘤細胞的耐藥性         08-03-10 11:02:00     編輯：studa20     作者：潘耀柱，陳協群，高廣勛，顧宏濤，張永清，董寶俠，白慶咸，朱華峰  【摘要】  為了探討酪氨酸激酶抑制劑STI571對RPMI8226細胞黏附、黏附誘導耐藥以及靶細胞Rac1 mRNA表達的影響，本研究采用結晶紫染色法分析了RPMI8226細胞與纖連蛋白（fibronecti

2、n，FN）的黏附率，用MTT法檢測瘤細胞的增殖性，并用半定量RT-PCR研究Rac1 mRNA水平的變化。結果顯示：RPMI8226細胞與FN黏附1、6、12小時，其黏附率分別為(43.71±2.18)%、(55.63±1.56)%、(63.42±2.46)%；用20 mol/L STI571處理1、6、12小時后黏附率分別降為(15.12±1.04)%、(17.58±1.32)%、(17.24±1.59)%；組間差異顯著（P0.05）；阿霉素作用后，FN黏附組細胞IC50值（1.46±0.04）mol/L顯著高于BSA組（

3、0.78±0.03）mol/L(P0.05)；FN聯合STI571組IC50值(0.81±0.05)mol/L與BSA聯合STI571組（0.74±0.02）mol/L相比無顯著性差異（P0.05），但卻低于FN組(P0.05)；半定量RT-PCR顯示，Rac1 mRNA水平在20 mol/L STI571處理14小時后明顯下降。結論：STI571能降低RPMI8226細胞與FN的黏附率、逆轉黏附介導的阿霉素耐藥，并且可以下調其Rac1 mRNA水平。 【關鍵詞】  骨髓瘤細胞Tyrosine Kinase Inhibitor Reverses Adri

4、amycin Resistance Mediated by Cell Adhesion in RPMI8226 CellsAbstract    To study the effects of tyrosine-kinase inhibitor STI571 on the adhesion of RPMI8226 cells to fibronectin(FN)，cell adhesion mediated adriamycin-resistance and the Rac1 mRNA expression，the adhesion of RPMI8226 cel

5、ls to fibronectin and drug resistance mediated by cell adhesion were determined by means of crystal violet staining and MTT assays respectively，Rac1 mRNA levels in RPMI8226 cells were examined by semi-quantitative RT-PCR.The results showed that STI571 could inhibit the adhesion of RPMI8226 cells to

6、fibronectin.When RPMI8226 cells had been adhe-red to FN or BSA-coated wells for 1，6 and 12 hours，the adhesion rates were (43.71±2.18)%，(55.63±1.56)%，and (63.42±2.46)%  respectively.After treatment with  STI571 20 mol/L，the adhesion rates decreased to (15.12±1.04)%，(17.5

7、8±1.32)% and (17.24±1.59)%  respectively (P0.05).The experiment revealed that growth of  RPMI8226 cells adhered to FN-coated plates had a significant  advantage over  growth on BSA-coated plates when exposed to adriamycin (Adr) for 1 hour followed by a 24-hour culture p

8、eriod，and the mean IC50 value for FN-adhered cells was (1.46±0.04) mol/L  while mean IC50 value for  BSA control  was (0.78±0.03)mol/L (P0.05).Following treatment with  20 mol/L STI571，the mean IC50 values for FN and BSA adhered cells were (0.81±0.05)mol/L，(0.74

9、77;0.02)mol/L respectively，there was no significant difference between them（P0.05）.RT-PCR demonstrated  that the relative Rac1 mRNA level (Rac1/GAPDH) in RPMI8226 cells was downregulated following being treated with 20mol/L STI571.It is  concluded that  STI571 can inhibit the adhesion

10、 of RPMI8226 cells to fibronectin，reverse  cell adhesion mediated adriamycin-resistance，and downregulate Rac1 mRNA level.Key words  tyrosine-kinase inhibitor; STI571; myeloma cell; RPMI8226 cell; adhesion; drug resistance多發性骨髓瘤（MM）至今之所以被認為是一種難以治愈的漿細胞惡性腫瘤，是因為瘤細胞最終會產生多藥耐藥，其中MM細胞與細胞外基質（extrac

11、ellular matrix，ECM）間黏附在耐藥中占有重要的地位，作為細胞與ECM之間作用的主要介導分子整合蛋白（integrin）與纖連蛋白（fibronectin，FN)結合對凋亡抑制、 細胞存活具有重要作用。 Damiano等1發現，經阿霉素（adriamycin，Adr）處理后，與FN黏附的骨髓瘤細胞比不黏附者具有明顯的生長優勢和較低的凋亡率，他們稱這一現象為細胞黏附介導的耐藥（cell adhesion  mediated  drug resistance，CAM-DR），采用封閉性抗體阻斷整合蛋白與FN間的相互作用后，瘤細胞與FN間的黏附率明顯下降，CAM-D

12、R得以完全逆轉。    肌動蛋白（actin）細胞骨架重構與細胞黏附密切相關，Abl酪氨酸激酶與RhoGTP酶Rac1是actin細胞骨架的重要調控分子。因此，Abl與Rac1極可能涉及MM細胞與細胞外基質(entracellular matrix，ECM)間的黏附過程以及靶細胞的CAM-DR形成。那么抑制Abl激酶活性能否逆轉黏附誘導的MM細胞耐藥呢？針對這一問題，我們以人骨髓瘤細胞株RPMI8226為研究對象，進一步探討Abl激酶抑制劑STI571對MM細胞CAM-DR的逆轉作用及其相關介導機理。材料和方法試劑STI571由諾華制藥公司惠贈，分子式為C29H3

13、1N7O·CH4SO3，分子量589.7。1粒膠囊含STI571 100 mg，用二甲亞砜（DMSO，Amrosco產品）充分溶解，離心去沉渣，以無菌注射用水稀釋至1 mmol/L，分裝，-20貯存。小牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司。四氮唑藍（MTT）、結晶紫（crystal violet）、阿霉素均為Sigma產品。纖連蛋白為Becton Dickinson公司產品，注射用水溶解，分裝，-20凍存。Taq酶購自大連TaKaRa公司；反轉錄試劑盒購Promega公司；RNA提取試劑TRIzoL購自Invitrogen公司；Rac1及內參照3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）引

14、物均由上海Sangon公司合成。細胞培養多發性骨髓瘤細胞系RPMI8226細胞來源于ATCC，由第四軍醫大學病理學教研室惠贈。細胞培養于含100 ml/L滅活胎牛血清的RPMI 1640培養液中，置5% CO2、飽和濕度、37培養箱中懸浮培養，2-3天傳代1次，實驗用細胞處于指數生長期。黏附實驗用無菌過濾的TSM buffer(20 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，1  mmol/L CaCl2，2 mmol/L MgCl2，pH 8.0 )2分別配制50 g/ml的FN及1% BSA，每孔50 l包被96 孔板，4過夜，用 1% BSA封閉2小時。實

15、驗分為4組：FN組：單純用FN  (50 g/ml)包被；對照組（BSA組）：單純用1% BSA包被；STI571+FN組；STI571+BSA組。RPMI8226細胞經無血清RPMI 1640培養12小時，并以20  mol/L 濃度的STI571(行細胞毒預實驗測得)預孵育2小時后，按2.0×104細胞/孔，種入96孔板，每組平行3孔。37、5% CO2分別培養1、6、12小時（期間不去除STI571）。用RPMI 1640 培養液洗板3次，70%甲醇固定10分鐘，洗板晾干。0.02%結晶紫染色10分鐘1，PBS 洗去多余染料，再以0.2% Triton X-

16、100溶解細胞，酶聯免疫儀上測定各孔570 nm OD值，以含2.0×104細胞/孔為總OD值（100%）。細胞黏附率(%) =實驗組OD值/總OD值×100%。MTT檢測實驗分4組，每組設3個復孔：FN+Adr組；BSA+Adr組；STI571+Adr+FN組；STI571+Adr+BSA組。FN包被及STI571處理同前。取指數生長期RPMI8226細胞按1.0×104細胞/孔種入96孔板，黏附12小時，每組分別加入以下濃度Adr：0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mol/L，作用1小時，離心棄上清，加完全RPMI 1640液培養24小時后，加

17、入MTT溶液（5  mg/ml）10 l，37孵育4小時，每孔加入100 l 10% SDS（含0.01  N  HCl），充分溶解結晶物3，570 nm波長測定各孔OD值，實驗重復3次，取平均值。生長抑制率()=(1-試驗組A值/對照組A值)×100。RT-PCR檢測取指數生長期細胞分為20 mol/L STI571處理組與空白對照組，1×106個細胞培養14小時后，采用TRIzoL試劑提取總RNA。RNA反轉錄按試劑盒說明書進行。將反轉錄產物cDNA于95變性5分鐘，開始PCR的熱循環：94變性40秒，51退火40秒，72延伸40秒，共28個循環，最后一個循環72延伸10分鐘，4保存。Rac1及GAPDH引物設計參照文獻4。Rac1上游引物為5-AGG AAG AGA AAA T