1、實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn) 雙縮脲法測定蛋白質(zhì)濃度雙縮脲法測定蛋白質(zhì)濃度實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康?.學(xué)習(xí)分光光度法測定的原理和方法2.學(xué)習(xí)蛋白質(zhì)含量測定的常見方法及原理3.掌握雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量的方法一、分光光度法測定的原理和方法一、分光光度法測定的原理和方法一、分光光度法的基本原理一、分光光度法的基本原理 根據(jù)物質(zhì)對光的選擇性吸收（吸收光譜），對物質(zhì)進(jìn)行定性定量分析。二、吸收光譜二、吸收光譜主要分為： 紅外吸收光譜：紅外吸收光譜：分子振動光譜，吸收光波長范圍2.5-1000m，主要用于有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)鑒定。 紫外吸收光譜：紫外吸收光譜：電子躍遷光譜，吸收光波長范圍200-400nm，可用于結(jié)構(gòu)鑒定和定量分析。 可見

2、吸收光譜：可見吸收光譜：電子躍遷光譜，吸收光波長范圍400-750nm，主要用于有色物質(zhì)的分析。三、分光光度法的主要研究方式三、分光光度法的主要研究方式1. 比較吸收光譜曲線比較吸收光譜曲線2. 比較最大吸收波長比較最大吸收波長蛋白質(zhì)的最大吸收波長為280nm，核酸的最大吸收波長為260nm。3. 比較吸光度的比值比較吸光度的比值純DNA8 . 1280260nmnmAA四、分光光度儀的工作原理四、分光光度儀的工作原理五、分光光度儀進(jìn)行定量的原理五、分光光度儀進(jìn)行定量的原理Beer-Lambert（比爾）定律： T=I/I0A=lg1/T=lgI0/IA=CL其中：T為透光率；A為吸光率；I0

3、為入射光強(qiáng)度；I為透射光強(qiáng)度；為摩爾消光系數(shù)；C為溶液濃度；L為溶液光程的厚度六、定量的常用方法六、定量的常用方法（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線法）標(biāo)準(zhǔn)曲線法 標(biāo)準(zhǔn)曲線與樣品的測定條件必須一致。（2）標(biāo)準(zhǔn)管法）標(biāo)準(zhǔn)管法 CX/AX=CS/AS，已知CS，測定AS、AX，可求得CX。（3）摩爾吸光系數(shù)法）摩爾吸光系數(shù)法C=A/（為L=1cm，C為1 mol/L時的吸光系數(shù)，也稱為摩爾吸光系數(shù)。二、蛋白質(zhì)含量測定的常見方法及原理二、蛋白質(zhì)含量測定的常見方法及原理微量凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)總含量微量凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)總含量 被測的天然含氮化合物與濃硫酸共熱時分解出氨，氨與硫酸反應(yīng)生成硫酸銨。消化后在凱氏定氮儀中加入

4、強(qiáng)堿堿化消化液，使硫酸銨分解出氨。用水蒸汽蒸餾法將氨蒸入無機(jī)酸溶液中，然后再用標(biāo)準(zhǔn)酸溶液進(jìn)行滴定，滴定所用無機(jī)酸的量(mol)相當(dāng)于被測樣品中氨的量(mol)，根據(jù)所測得的氨量即可計(jì)算樣品的含氮量。 因?yàn)榈鞍踪|(zhì)含氮量通常在16 %左右，所以將凱氏定氮法測得的含氮量乘上系數(shù)6.25，便得到該樣品的蛋白質(zhì)含量。 紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)濃度紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)濃度 由于蛋白質(zhì)分子中酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，因此蛋白質(zhì)具有吸收紫外線的性質(zhì)，吸收高峰在280 nm波長處。在此波長范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)溶液的光吸收值(OD280)與其含量呈正比關(guān)系，可用作定量測定。 利用紫外吸收法測定蛋白質(zhì)含量

5、的優(yōu)點(diǎn)是迅速、簡便、不消耗樣品、可回收利用、低濃度鹽類不干擾測定。 缺點(diǎn)在于對測定哪些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)酪氨酸和色氨酸含量差異較大的蛋白質(zhì)，有一定誤差；而樣品中如果含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外線的物質(zhì)，會出現(xiàn)較大干擾。雙縮脲法測定蛋白質(zhì)雙縮脲法測定蛋白質(zhì)* 蛋白質(zhì)含有兩個以上的肽鍵(CONH)，因此可以發(fā)生雙縮脲反應(yīng)： H2N-CO-NH2 + NH2-CO-NH2 H2N-CO-NH-CO-NH2 NH3 在堿性溶液中，雙縮脲能與Cu2+形成紫紅色絡(luò)合物，其顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比。雙縮脲法測定蛋白質(zhì)范圍1-10mg。 雙縮脲法測定蛋白質(zhì)雙縮脲法測定蛋白質(zhì)* 雙縮脲顯色反應(yīng)僅和蛋白質(zhì)中肽鍵數(shù)成正比關(guān)

6、系，與蛋白質(zhì)的種類、分子量及氨基酸的組成無明顯關(guān)系，各種蛋白質(zhì)的顯色程度基本相同；重復(fù)性好，干擾少，常見干擾大多可以避免；使用單一的穩(wěn)定試劑，操作簡便、快速，適于手工和自動化分析。 缺點(diǎn)是靈敏度較低。但檢出限為0.21.7mg蛋白質(zhì)/ml，這相當(dāng)于70g/L的血清324L，已能滿足臨床生化檢驗(yàn)的需要。因此，是臨床測定血清總蛋白質(zhì)首選的最方便、實(shí)用的常規(guī)方法。Folin-酚試劑法酚試劑法(Lowry法法)測定蛋白質(zhì)濃度測定蛋白質(zhì)濃度 Folin酚反應(yīng)是在雙縮脲反應(yīng)的基礎(chǔ)上，引進(jìn)Folin試劑(磷鉬酸磷鎢酸試劑)，蛋白質(zhì)銅絡(luò)合物能還原磷鉬酸磷鎢酸試劑，生成藍(lán)色物質(zhì)。在一定條件下，藍(lán)色強(qiáng)度與蛋白質(zhì)的

7、量成正比例。 本法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡便、靈敏度高、較紫外吸收法靈敏1020倍，較雙縮脲法靈敏100倍。 其不足之處是此反應(yīng)受多種因素干擾（Tris緩沖劑、蔗糖、硫酸銨、巰基化合物、酚、檸檬酸）。 Folin-酚試劑包括甲、乙試劑。其中乙試劑僅在酸性PH下穩(wěn)定，但上述還原反應(yīng)只在pH10的情況下發(fā)生，故乙試劑加到堿性的銅-蛋白質(zhì)溶液中時，必須立即混勻，以便磷鉬酸-磷鎢酸試劑被破壞之前，還原反應(yīng)能發(fā)生。考馬斯亮藍(lán)染色法測定蛋白質(zhì)濃度考馬斯亮藍(lán)染色法測定蛋白質(zhì)濃度 考馬斯亮藍(lán)在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)和染料結(jié)合符合比爾定律 ，因此可以通過測定染料在595nm處光吸收的增加量得到與其結(jié)合的蛋白質(zhì)量。該

8、法簡單、迅速、干擾物質(zhì)少、靈敏度高（比Lowry法靈敏4倍）。 強(qiáng)堿性緩沖劑和去污劑會有顏色干擾，可校正。但大量去污劑的影響不易消除。Coomassie Dye-Based 蛋白質(zhì)定量PROTEIN+Amax = 595nmBLUEAcidCoomassie G-250Protein - DyeComplexO CH2CH3NHCCH3CH3NCH2SO3-CH3CH2NCH2CH2CH3SO3Na+總蛋白定量分析總蛋白定量分析BCA（Bicinchoninic acid，二辛可寧酸、二羧基二喹啉）二辛可寧酸、二羧基二喹啉）準(zhǔn)確靈敏：BCA試劑的蛋白質(zhì)測定范圍是202000g/ml；Micro

9、 BCA試劑測定范圍是0.5-20g/ml快速：45分鐘內(nèi)完成測定，比經(jīng)典的Lowry法快4倍而且更加方便經(jīng)濟(jì)實(shí)用：除試管外，測定可在微孔板中進(jìn)行，大大節(jié)約樣品和試劑用量不受樣品中離子型和非離子型去污劑影響檢測不同蛋白質(zhì)分子的變異系數(shù)小于考馬斯亮藍(lán) 基本原理：基本原理：堿性條件下，蛋白將Cu2+還原為Cu+， Cu+與BCA試劑形成紫顏色的絡(luò)合物，測定其在562nm處的吸收值，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比，即可計(jì)算待測蛋白的濃度。三、雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量三、雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量一、操作步驟一、操作步驟1.取15支試管，按下表編號、加試劑管號0123456樣品牛血清白蛋白(mg)00.61.22.43.

10、64.86.02mg/mL牛血清白蛋白體積(mL)00.30.61.21.82.43.0待測液體積(mL)3.0*蒸餾水(mL)3.02.72.41.81.20.600OD5402.各管混勻后，加入雙縮脲試劑3.0mL,37oC反應(yīng)30min。3.以0號管調(diào)零，測定各管540nm光吸收值。二、結(jié)果處理二、結(jié)果處理1.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 以牛血清白蛋白含量為橫坐標(biāo)，OD540為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2.樣品的計(jì)算 根據(jù)樣品的OD540從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得樣品的蛋白質(zhì)含量（mg），再根據(jù)樣品的體積計(jì)算出樣品的濃度。三、注意事項(xiàng)三、注意事項(xiàng)1.須于顯色后30min內(nèi)測定，且各管由顯色到比色時間應(yīng)盡可能一致。2.*樣品蛋白質(zhì)含量應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)。3.比色杯的使用。四、分光光度計(jì)的使用儀器操作鍵介紹“方式設(shè)定”鍵（MODE）：用于設(shè)置測試方式 透射比（T）、吸光度（A）、已知樣品濃度值（C）、已知標(biāo)準(zhǔn)樣品斜率（F）“100%”鍵：用于自動調(diào)整100.0%T(100.0透射比)或0ABS(零吸光度)“0%”鍵：用于自動調(diào)整零透射比“波長設(shè)置”旋鈕：用于設(shè)置分析波長3.樣品測試操作 打開電源開關(guān)，使儀器預(yù)熱20分鐘 用“波長設(shè)置”按鈕將波長設(shè)置在您將要使用的分析波長位置上按“方式鍵”（MODE）將測試方式設(shè)置為透射比（T）將參比溶液和被測溶液分別倒入比色皿中打開樣品室蓋，