1、DOC格式論文，方便您的復制修改刪減羊痘病毒研究綜述（作者:_單位: _郵編: _） 作者：王家鵬 唐靜 劉柳 楊正梅 吳通奎 殷俊磊摘要羊痘病毒能引起山羊痘、綿羊痘和牛的結節性疹塊病,是所有動物痘病毒中最為重要的一種,嚴重影響養羊業和國際貿易的發展。從病原學、分子生物學、檢測和預防控制等方面對羊痘病毒進行綜述,以促進對羊逗病的進一步研究。 關鍵詞羊痘病毒;山羊痘;綿羊痘;P32蛋白;診斷 羊痘又名羊“天花”,是由羊痘病毒引起的一種羊急性、熱性、接觸性傳染病。其特征是發熱、無毛或少毛部位皮膚黏膜發生丘疹和皰疹,是所有動物痘病中最為嚴重的一種,被世界動物衛生組織(OIE)列為A類重大傳染病,我國

2、將其列為一類動物疾病1-4。此外,該病在公共衛生方面也受到密切關注,中國、瑞典、印度依據流行病學和臨床癥狀都有人類感染羊痘病毒的報道2。世界各國都高度重視該病,感染該病的國家和地區的易感動物及其有關的產品被世界各國列為嚴格限制進出口的對象。羊痘是所有動物痘病中最為嚴重的一種,據不同毒株的毒力差異,易感羊群的致死率可達10%58%或75%100%不等,羔羊致死率高達100%,妊辰母羊極易流產3。受感染的羊群生產力大大降低,毛品質也極大下降,造成巨大的經濟損失,嚴重影響國際貿易和養羊業的發展1-8。 1病原的分類及形態特征 羊痘病原為羊痘病毒,可引起山羊痘(Variola caprina;Goat

3、 pox;GPV)、綿羊痘(Variola caprina;Sheep pox;SPV)和牛的結節性疹塊病(Lumpy skindisease;LSD)7,已分離到的肯尼亞和也門毒株既可感染綿羊又可感染山羊,它們同屬痘病毒科(poxiridae)、脊椎動物痘病毒亞科(chodopoxvirdae)羊痘病毒屬(Capripoxvirus)的成員7。該屬包括山羊痘病毒(Goatpox virus;GTPV)、綿羊痘病毒(Sheeppox virrus,SPPV)和疙瘩皮膚病病毒(Lumpy skin disease virus;LSDV)3個成員,是惟一在細胞漿內復制的有囊膜的雙股DNA 病毒。不

4、同的羊痘病毒間在血清上呈交叉反應,但LSDV一般不感染山羊和綿羊。在電鏡下觀察,初期的病毒粒子呈卵圓形,大小約為250350 nm;成熟的病毒粒子多呈卵圓形,大小約為150180 nm×150180 nm7。在感染細胞內,可形成胞漿包涵體,多呈橢圓形。病毒粒子外層為層管狀構造的脂蛋白膜,包圍著2個功能不清的側體以及啞鈴型的核酸芯髓9。核酸是由雙股DNA構成,其分子質量約為130×106240×106 ku。 羊痘病毒是一種親上皮性的病毒,大量存在于病羊的皮膚、黏膜及痂皮肉內,病羊血液和鼻黏膜分泌物內也含有該病毒。羊痘病毒在細胞內繁殖,且大部分以裸露的形式留在細胞內

5、,為胞內裸病毒(intracellular naked virus;INV),有少部分釋放到胞外,成為胞外帶衣殼病毒(extracellu larenve-loped virus;EEV)。 羊痘病毒對直射陽光、酸、堿和大多數常用消毒藥(酒精、紅汞、碘酒、來蘇爾、福爾馬林、石炭酸等)均較敏感,對醚和氯仿也較為敏感。該病毒耐干燥,在干燥的痂皮內能成活數月至數年,在干燥羊舍內可存活68月。不同毒株對熱敏感程度不一,一般55 下持續30 min即可滅活。放線菌素-D和溴脫氧尿苷可抑制該病毒復制4。 2分子生物學特性 綿羊痘病毒(SPPV)和山羊痘病毒(GTPV)基因組約有150 kb,彼此十分相似,

6、約有96%的核苷酸完全相同。和其他痘病毒一樣,羊痘病毒基因組包括中間編碼區和兩端相同的反向末端重復序列(Inverted terminal repeat,ITR)。SPPV和GTPV基因組共有147個開放閱讀框(ORF),編碼密度為93%,所編碼的蛋白為532 027個氨基酸不等。基因組中間的區域(ORFs024-123)有與其他痘病毒同源的保守序列,編碼病毒復制所需的蛋白,其功能主要是負責病毒的轉錄,修飾RNA、病毒DNA的復制以及在胞內組裝成熟,在胞外被蛋白膜包裹成成熟的病毒粒子。羊痘病毒DNA的左側和右側10、27 kb的基因結構中包含重要的編碼功能的基因序列。兩端基因序列(ORFs00

7、1-23和ORFs124-156)包括1個基因家族(由8個基因組成)及其他與病毒修飾或逃避宿主免疫識別和反應相關的基因,負責編碼胞質分裂絲蛋白、表皮生長因子樣蛋白(EGF-like protein)、PKR阻遏蛋白、G2蛋白二聯趨化因子受體等,還有痘病毒所特有的致病基因和選擇宿主范圍基因。痘病毒基因組的末端有發夾環結構,這一序列的A+T約為75%,額外的末端重復序列和發夾環結構至少有200 bp。SPPV和GTPV基因組存在一些差異,如末端的ITRs,在SPPV為2 2132 349bp,而在GTPV為2 198 bp,其縱向重復序列也有差異,在最靠近末端(ORFs001和156)的區域,SP

8、PV含有46bp的ORFs,LSDV包含56bp的ORFs,但GTPV的基因組不含這一縱向末端重復序列。SPPV和GTPV與LSDV的基因組也非常相似,約有97%的核苷酸完全相同,所有的SPPV和GTPV基因在LSDV基因中都存在,在SPPV和GTPV基因組中,有9個與LSDV的毒力和宿主有關的基因缺失,其中包括LSDV獨有的基因LSDV 132和類似于編碼白介素-1受體的基因,黏液瘤病毒M003.2和M004.1,牛痘病毒F11L、N2L和K7L基因。這些基因的缺失對SPPV和GTPV的宿主范圍起很大的影響作用10。 3P32蛋白的特性 P32蛋白是目前世界各地分離鑒定的所有羊痘病毒株所共有

9、的且特異性很強的結構蛋白,P32蛋白的體外表達是目前國際上羊痘研究的熱點11-20。羊痘病毒P32蛋白與晚期H3L基因編碼的痘苗病毒的P35蛋白相類似,在成熟胞內病毒粒子的膜上表達,P35蛋白在病毒吸附、成熟病毒粒子的組裝、病毒毒力、免疫原性方面發揮著重要作用。GPV P32基因包含969 bp的開放閱讀框,編碼322個氨基酸;SPV P32基因包含972 bp的開放閱讀框,編碼323個氨基酸。推導的氨基酸序列表明P32蛋白是高度保守的。P32基因包含1個與膜相關的靠近羧基末端的跨膜區,能被去污劑溶解,在ELISA檢測抗體試驗中能被用做捕捉抗原21-29。免疫印跡研究顯示,P32蛋白包含1個重

10、要的抗原決定簇,誘導的抗體反應比其他結構蛋白超前并且優越,不但可以用于診斷技術,還可以用于羊痘的預防。Hosamani M等16對幾株SPPV和GTPV的P32基因序列的分析結果表明,SPPV和GTPV同源性為97.5%,氨基酸同源性為94.7%。而SPPV P32蛋白的第55位點有1個額外的天冬氨酸,而山羊痘和牛的結節性疹塊病的P32蛋白沒有此氨基酸,另外,GTPV的P32蛋白的第77、275、403、552、867和964位點有6個特異的核苷酸,GTPV和LSDV也有類似的特異性核苷酸。 4檢測技術及基因工程苗的研究 該病僅羊感染發病,根據臨床癥狀,結合其流行病學特征,即可做出初步診斷。但

11、遇非典型病例,實驗室確診就尤為重要。現已有一些對羊痘的實驗室檢測方法,但各有優缺點。病毒培養和分離雖有較高的特異性,但耗時長;因羊痘病毒和副痘病毒有相似的血清型,一些血清學的診斷方法如間接熒光免疫試驗、檢測抗體的ELISA等,因會出現抗體交叉反應而無法區分來源于牛、綿羊和山羊的羊痘病毒毒株,也不能區分疫苗免疫與自然感染。又因羊痘感染后主要引起細胞介導免疫,動物接觸病原后僅產生低水平的中和抗體,故而病毒中和試驗敏感性也不高。周碧君等7建立了山羊痘(GP)的5種血清學檢測方法并進行比較分析,結果表明,瓊脂擴散試驗適于基層獸醫開展山羊痘病例的診斷,對流免疫電泳能提高對抗原或抗體的分辨能力,熒光抗體試

12、驗能對感染細胞進行GTPV定位檢測,反向被動血凝試驗主要用于臨床痘疹痂皮和感染細胞中GTPV抗原的定量測定,正向間接血凝試驗(IHA)不失為一種GTPV抗體的最佳監測方法。郭巍等19依據P32基因和微管蛋白基因,初步建立了診斷山羊皮膚組織中GTPV的PCR方法;康文玉等18參照SPPV P32基因序列,建立了快速、特異、敏感、可定量、可同時檢測大量樣品的實時熒光定量PCR技術。郭巍等19、馬維民等20、陳軼霞等21進行山羊痘病毒P32基因的克隆與表達,為國內研制羊痘病毒診斷試劑和亞單位疫苗奠定基礎。 預防綿羊痘和山羊痘有多種弱毒疫苗和滅活疫苗,滅活疫苗免疫效果不佳,最多只能提供短暫的保護。綿羊

13、和山羊以1株羊痘病毒免疫后,可以抵抗所有毒株的感染,不論感染毒株來源于亞洲或非洲30-33。滅活的許多山羊痘病毒株均可作為滅活疫苗廣泛使用34-37。目前,正在開發新一代GTPV基因工程疫苗,因為GTPV的基因組較大,有表達多個外來基因的潛力,且將外來基因插在羊痘病毒的非編碼區,既不影響其復制也不會影響其抗原性,所以以山羊痘病毒基因組作為其他反芻動物病原基因的載體可生產重組疫苗。如將牛瘟病毒、小反芻獸疫病毒基因克隆于羊痘病毒載體,所研制的重組單一疫苗,將對羊痘、牛瘟、小反芻獸疫均有免疫作用38-41。 5展望 根據羊痘病毒的宿主特異性,研究病毒基因組與宿主特異性有關的基因序列,依此構建重組疫苗

14、,既可抗山羊痘,又可抗綿羊痘。羊痘病毒作為病毒載體,對傳遞和表達外來病原體的基因構建多種重組疫苗具有很大潛力。對山羊痘和綿羊痘不同毒株的抗原和基因組特性的研究,尤其對羊痘病毒P32蛋白的研究,為研制新的診斷試劑及羊痘的亞單位疫苗奠定了基礎,這將會為診斷、流行病學和有效預防控制該病開辟新的領域。 6參考文獻 1 CRAN V M.Control of capripoxvirus infection J.Vaccine,1993,11(3):1275-1279. 2 朱學亮,張強,楊帆,等.羊痘病毒載體研究進展J.中國畜牧獸醫,2009,36(5):98-101. 3 張前群,馬承俊.山羊痘暴發流

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