1、    重組人生長激素基因的轉染和基因 表達產物的定量分析        摘要目的：定量分析基因表達產物人生長激素(hGH)，并確定基因表達期限。方法：我們利用磷酸鈣介導的方法將重組hGH基因導入培養的人胚皮膚成纖維細胞內，之后用Northern雜交證實轉染細胞能夠表達hGH基因。在此基礎上又采用放免法對hGH進行了定量測定。結果：從細胞轉染的第12天算起，hGH水平逐漸提高，到23天進入一穩定表達階段，到90天仍在進行穩定表達。此時每毫升培養液中的細胞數為1.3&

2、#215;106個，hGH含量為79.32±3.2663ng。結論：轉染細胞至少能持續表達hGH 90天。關鍵詞重組人生長激素基因基因轉染基因表達基因治療 Transplantation of the transfected cells with recombinant hGH gene VI:gene transfection and quantitative analysis of gene expression productHu Zhiqiang, Dai Qinshun, Yu Kangzhen, et al. Department of Neurosurgery, Fir

3、st Clinical College, Harbin Medical University, 150001AbstractObjective: To quantitative analyze the gene expression product-hGH, and determine expression time limit. Methods: we use Northern blotting to prove the human fetal skin fibroblasts (hSF), which were transfected with recombinant hGH gene b

4、y calcium phosphate transfection system, could express the foreign hGH gene. On the basis of above researches, we adopted radioimmunoassay (RIA) for quantitative analyze of hGH. Results: hGH content gradually increased on the 12th day after transfection. The gene expression began to enter the steady

5、 expression stage on the 23rd day, and still expressed sustainedly hGH on the 90th day. During the stage, there were 1.3×106 hSF in a milliliter medium, hGH content was 79.32±3.2663ng/ml. Conclusions: The transfected hSF can express hGH sustaintedly for at least 90 days.Key wordsRecombinan

6、t hGH geneGene transfectionGene expressionGene therapy目前，體細胞基因治療面臨三個主要問題，(1)有效的基因轉染，(2)持續穩定的基因表達，(3)細胞移植后的免疫排斥。本研究在對人胚皮膚成纖維細胞進行成功轉染的基礎上，利用放免法和Northern雜交對hGH基因的表達進行定性定量分析，以便從中了解基因表達情況，為實現自體移植治療垂體性侏儒癥的理想目標奠定實驗基礎。材料與方法1.pNMG3質粒構建：質粒pNMG3(加拿大Drchang提供)含有鼠金屬硫蛋白啟動子(mMT-I)驅動的hGH基因及猴病毒40早期啟動子(SV40)控制的選擇性標記基

7、因新霉素磷酸轉移酶(neo)基因。它是通過連接pxGH5的3.9Kb，EcoRI片段，即完整的mMT-I/hGH融合基因片段到質粒pSV2 neo的EcoRI位點上構成的，見1。1質粒pNMG32.磷酸鈣介導的基因轉染：在無菌條件下，從一自然流產的死胎上取約3厘米2的皮片，剪碎，進行消化培養(2)。當培養的人胚皮膚成纖維細胞進入對數增殖階段時將細胞按15傳代。將傳代的細胞于轉染前重新培養24小時，此時每毫升培養液中含4.5×105個細胞。轉染前3小時更換一次培養液。之后制備1.5ml磷酸鈣(GIBCO)-DNA復合物，其中pNMG3質粒為7l，相當于31.5g。3ml培養瓶中復合物加

8、入量見附表。轉染后的細胞用G418進行篩選，每毫升培養液中G418的有效劑量是400g。然后對篩選后的細胞進行克隆化。當細胞增殖至107108時進行RNA和蛋白質分析。附表培養瓶中磷酸鈣-DNA復合物的含量培養瓶編號磷酸鈣-DNA復合物含量(l)注1100215032004250530063507-G418對照8-空白對照注：G418對照：為加G418進行篩選的細胞空白對照：為正常培養的成纖維細胞3.Northern雜交：采用J.Sambrok分子克隆上標準技術分析轉染細胞和未轉染細胞總RNA，探針為3.9Kb EcoRI片段，并利用地高辛標記和檢測試劑盒(GIBCO)進行分析。4.用放免法動

9、態監測基因表達產物：當培養瓶中細胞形成單層時，每毫升培養液中含有1.3×106個細胞，換下的培養液-20保存，待測hGH，人血清生長激素放免試劑盒購于天津醫學生物工程有限公司。結果1.基因轉染：轉染后第一天，成纖維細胞表面有許多顆粒沉著，細胞在形態上仍保持梭形，但細胞明顯“消瘦”。轉染后7天，2號瓶中開始有極少量細胞恢復了成纖維細胞原有的形態特點，二天后細胞克隆擴大，細胞數量增多，對細胞進行克隆化。另外，除2號瓶內細胞轉染獲成功外，其它均未成功。表明在每毫升培養液中加150l磷酸鈣DNA復合物轉染人胚皮膚成纖維細胞是最佳劑量，此時每毫升培養液中含轉染細胞4.2×105個。同

10、時，G418對照組細胞經G418一周的篩選細胞逐漸退化，表面有許多顆粒沉著，最終死亡，脫落，由單層形成拉網。此時，正常對照細胞量呈過度生長。2.Northern雜交結果：生理狀態下，人皮膚成纖維細胞不能表達hGH基因，而本研究通過Northern雜交證實轉染后的成纖維細胞能夠表達外源性hGH基因，所獲雜交帶包含大約900個核苷酸，其中轉錄mMT-I順序的核苷酸為64個，hGH順序為817個，另外，還包括修飾片段。3.放免測定結果：從細胞轉染后的第12天算起，培養液中hGH含量逐漸增加，到23天進入一穩定表達階段，此時每毫升培養液中含有1.3×106個細胞，hGH含量為79.32

11、77;3.2663ng。到本實驗結束時，即細胞轉染后第90天，基因表達仍在穩定進行，見2。討論目前，用于重組蛋白傳遞系統的細胞有成纖維細胞(1)，肝細胞（2），成肌細胞（3，4），上皮細胞（1），其中以成纖維細胞應用比較廣泛，而且2用RIA檢測培養液中hGH含量具有明顯優勢：(1)便于取材，(2)體外易成活，并增殖傳代，(3)易于基因轉染，(4)易于皮下注射移植，(5)易于與注射部位皮下組織整合，(6)能有效傳遞重組蛋白質進入循環系統，參與機體代謝。當我們對培養的成纖維細胞進行基因轉染時，外源性目的基因可能不與宿主細胞基因組整合，形成瞬時轉染和表達(5)；也可能與宿主細胞基組整合(3，4，隨機

12、插入宿主細胞基因組中的任意位置，形成穩定轉染和表達。這樣外源性DNA的隨機插入，可能導致宿主細胞內源性有利基因結構的破壞和失活，或激活有害基因(如癌基因)。另外，導入人體細胞內的外源性目的基因，其表達水平也難以預測，所以，如何提高基因正常轉化效率，實現目的基因的定位整合一直是人們追求的目標。80年代初發展起來的基因定位整合技術或基因打靶，就是利用DNA體內同源重組的原理，將外源基因穩定地插入特定的位點，再經適當篩選，從而得到即定的轉化細胞。對于穩定轉染細胞，一方面可通過自體移植跨越組織相容性障礙，使其伴隨宿主終生；另一方面可通過其對外源性基因的穩定表達，實現基因治療的最終目標。而對瞬時轉染和表

13、達的細胞，可應用低溫保存技術，將細胞加以保存，以便不斷提供移植物來源，使基因治療得以延續。Seldon等人的研究指出，hGH基因在轉染細胞內進行瞬時表達時，基因表達產物可以在轉染24小時后的細胞培養液中測得，3天后快速增加，第二周時相對穩定，從第11天起，合成和分泌量逐漸減少，第三周hGH基因表達停止，偶爾表達時間超過6周。而我們的實驗結果表明，從細胞轉染的第12天算起，hGH量逐漸增加，到23天時進入一個穩定表達階段，持續到本實驗結束，即轉染后第90天仍在進行穩定表達，說明我們轉染并克隆后的細胞很可能在進行持續穩定的基因表達。當然，在將重組人生長激素基因應用于治療垂體性侏儒癥以前還有大量的工

14、作有待開展，包括如何提高基因的穩定轉染率，并向定位整合技術方向發展。選擇一種更加理想的重組蛋白細胞傳遞系統。通過大量動物實驗，證實基因治療的安全性，可靠性和可行性。采用基因槍或注射法將裸DNA直接導入宿主細胞內，將為人類采用“基因藥物”預防和治療疾病開辟更加廣闊的前景。參 考 文 獻1Tai IT, Sun AM. Microencapsulation of recombinant cells a new Delivery system for gene therapy. J FASEB, 1993，7:1061-1069.2胡志強，楊富明，劉恩重，等.腺垂體同種異體移植實驗研究 :新生大鼠腺

15、垂體細胞培養.功能性及立體定向神經外科雜志，1993，6(4):3-5.3Barr E, Leiden JM. Systemic delivery of recombinant protein by genetically modified myoblasts. Science,1991,254:1507-1509.4Dhawan J, Lydia CP, Grace KP,et al.Systemic delivery of hman growth hormone by injection of genetically engineered myoblasts. Science,1991,254:1509-1512.5Selden RF, Howte KB, Rowe ME,