1、    長春花堿和細胞松馳素D 對肝癌細胞粘彈性的影響        用微管吸吮技術測定了正常肝細胞和肝實質細胞癌細胞的粘彈性，以三參數標準線性固體模型擬合實驗結果，進一步研究了兩種細胞骨架干擾劑處理后肝細胞和肝癌細胞粘彈性系數的變化。結果表明，肝癌細胞的彈性系數較肝細胞的相應值增高，藥物作用后肝癌細胞粘彈性系數較對照組均有顯著性下降，而正常肝細胞在長春花堿作用后，其彈性系數較對照組有顯著性上升，在細胞松馳素D作用下肝細胞粘彈性系數呈現與肝癌細胞相似的下降趨勢，作者

2、對這一結果進行了簡要的討論。關鍵詞： 肝實質細胞癌；肝細胞；粘彈性；長春花堿；細胞松馳素D分類號： R318.01; R333.4 EFFECT OF VINBLASTINE AND CYTOCHALASIN D ON VISCOELASTIC PROPERTIESOF HEPATOCELLULAR CARCINOMA CELLSZhang Gang, Wu Zezhi, Wang Hongbing, Long Mian, Song Guanbing, Cai Shaoxi(Bioengineering Research Institute, Chongqing University, Cho

3、ngqing 630044)ABSTRACTUsing micropipette aspiration technique, the authors investigated the viscoelastic properties of human hepatocytes and hepatocellular carcinoma (HCC) cells, and the experimental results were fitted with a three-element standard linear solid model. Further, the authors investiga

4、ted the change in viscoelastic properties of both hepatocytes and HCC cells by treatments with two drugs.Results showed: The elastic coefficients of HCC cells were obviously higher than the corresponding values of hepatocytes. After treatment with vinblastine and cytochalasin D, the viscoelastic coe

5、fficients of HCC cells were significantly lower than those of control. Under the action of vinblastine, the elastic coefficients of hepatocytes increased obviously than those of control, but the viscoelastic properties of hepatocytes treated with cytochalasin D had the same trend of decreasing as th

6、at of HCC cells. A breaf discussion was presented about these results.Key words:Hepatocellular carcinoma; Hepatocytes; Viscoelasticity; Vinblastine; Cytochalasin D0引言肝實質細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC，簡稱肝癌)的生長，浸潤與轉移是一個存在復雜的細胞流變學機制的病理過程，其浸潤性生長和穿透內皮細胞是以癌細胞運動和變形為基礎的過程，細胞粘彈性是與細胞運動和變形有關的重要生物物理特性，對腫瘤細胞而

7、言，它可能涉及細胞的浸潤與轉移特性，因此研究癌細胞的粘彈性并闡明其在腫瘤細胞發生、生長、轉移等過程的作用，是十分必要的。近年來，腫瘤細胞細胞骨架與其生物學特性的關系愈來愈受到重視1，以細胞骨架為靶細胞器的化療藥物(如長春花堿)已被廣泛地用于腫瘤的臨床治療，但有關腫瘤細胞細胞骨架結構與其流變特性的相關性，目前尚未見系統報道，本研究以正常肝細胞和肝癌細胞為研究對象，用微管吸吮技術(micropipette aspiration technique)研究了長春花堿(vinblastine, VBL)和細胞松馳素D(cytochalasin D,CD)對兩種細胞粘彈性的影響，旨在從細胞骨架角度研究并闡

8、明肝癌細胞粘彈性改變的基礎上，在亞細胞水平更好地認識癌細胞的粘彈特性。1材料與方法1.1細胞樣本的制備肝細胞由正常肝組織經0.05%膠原蛋白酶IV(Sigma產品)消化后用梯度離心的方法分離和純化制得2，人肝癌細胞(SMMC-7721)購自第二軍醫大學，兩種細胞均經0.02%EDTA/0.05%胰蛋白酶混合液消化后懸浮于RPMI1640細胞培養液中制成細胞懸液，濃度約5×106個細胞/毫升，CD的處理是在細胞懸液中加入0.255.0mg/ml的CD，37孵育30min后進行微管吸吮實驗；VBL的處理是在細胞培養的上清液中加入0.052.00mg/L的VBL，37孵育24h后再消化制樣

9、進行微管吸吮實驗。微管吸吮實驗在3h內完成。1.2微管吸吮實驗系統及微管吸吮實驗微管吸吮實驗系統的結構我們已另文報道3，該系統由倒置顯微鏡(Axiovert 35, Zeiss Co.)，顯微操作器(MR1570，eppendort Co.)，壓力控制與記錄系統(本院自制)，電視攝像和磁帶錄像機(NV-HD100MC，Panasonic Co.)以及象處理儀(Vidas 21,Kontron Co.)等部分組成。其中，微管由普通國產毛細玻管在微管拉制器(P87, Sutter Instrument Co.)上控制而成，內半徑2.67±0.82m。系統連結完畢后，取細胞懸液約0.5ml

10、放入一特制圓形小室內，置于倒置顯微鏡載物臺上，在(×100)油鏡，(×10)目鏡下確定待實驗的細胞，利用顯微操作器引導微管尖端靠近細胞的表面，通過壓力控制系統產生一階躍負壓(CD 149.6±50.5Pa,n=234;VBL358.5±79Pa,n=230)，以吸吮細胞，使細胞的一小部分被吸入微管內。實驗中，以電視攝像磁帶記錄的方式記錄細胞進入微管的變形過程，經電視回放輸入象處理儀進行有關測量4。1.3計算與統計分析細胞在微管內的變形表現為一個初始的快速彈性響應和其后的一個蠕變過程，我們采用了三參數標準線性固體模型(Kelvin模型)擬合實驗結果5。該模

11、型由二條平行的“臂”組成，其中一“臂”為彈性系數為K1的彈性元件，另一“臂”由彈性系數K2的彈性元件和粘性系數為的粘性元件串聯而成，實驗結果表述中以K1、K2和作為標準細胞粘彈性的客觀物理量，在這里，彈性系數K1和K2與時間無關，它們反映了細胞的剛性，粘性系數描述了細胞變形時時間的依賴性，它反映了細胞的粘性，細胞的初始變形程度正比于1/(K1+K2)，最大變形程度正比于1/K1。細胞粘彈性系數是細胞本身的材料屬性，細胞小變形條件下通過Kelvin模型反映的細胞粘彈性主要是受胞質內細胞骨架結構和機能狀態的完整性所影響，為保證細胞在微管內的小變形狀態，我們對VBL和CD處理后的細胞采用了不同的負壓

12、吸吮，實驗結果統一采用了兩樣本均數的t檢驗進行顯著性分析。2結果長春花堿和細胞松馳素D作用下肝細胞和肝癌細胞粘彈性系數變化如表1和表2。表1長春花堿作用下肝癌細胞和肝細胞粘彈性系數(mg/L)肝細胞n肝癌細胞nK1(N/m2)K2(N/m2)(N.s/m2)K1(N/m2)K2(N/m2)(N.s/m2)087.5±12.133.3±10.35.9±3.024103.6±12.642.5±10.44.5±1.9300.05115.9±15.942.4±8.86.1±2.330118.4±19.7

13、23.1±6.05.6±2.3290.25128.7±2.454.0±6.39.8±1.62993.2±11.317.0±3.22.9±1.0280.75138.3±23.251.4±13.48.2±3.3?2984.5±6.215.2±3.12.6±0.8272.0117.0±9.143.9±7.76.2±2.33053.4±12.08.7±2.81.0±0.528與相應對照組比較：* P<

14、;0.05, P<0.01， P<0.001;n：所測細胞個數 表2細胞松馳素D作用下肝癌細胞和肝細胞粘彈性系數(mg/L)肝細胞n肝癌細胞nK1(N/m2)K2(N/m2)(N.s/m2)K1(N/m2)K2(N/m2)(N.s/m2)087.5±12.133.3±10.35.9±3.024103.6±12.642.5±10.44.5±1.9300.2537.7±7.112.9±3.32.0±0.83329.5±11.46.5±2.61.6±0.8280.539

15、.5±6.413.8±3.42.6±1.12921.9±5.25.4±1.71.1±0.5282.542.4±5.916.1±3.32.9±1.43031.7±3.87.1±1.82.5±1.0275.044.9±7.516.1±3.02.6±1.33034.9±9.48.0±2.71.9±0.729與相應對照組比較：* P<0.05, P<0.01， P<0.001; n：所測細胞個數 3討論長春

16、花堿屬生物堿類抗微管藥物，主要阻止微管蛋白裝配成微管，細胞松馳素D是微絲的特效干擾劑，可引起微絲網架的解體7，從兩種細胞粘彈性系數數據上可看出，肝細胞和肝癌細胞存在明顯差異。無藥物對照組肝癌細胞的彈性系數K1、K2較肝細胞相應值明顯增高(P<0.01)，這表明在實驗條件下肝癌細胞較肝細胞剛性增加，這也預示著細胞癌變后由于其骨架結構和機能狀態的異常對其流變特性的影響。VBL在0.052.00mg/L的濃度范圍內引起肝細胞K1、K2和值均明顯增高，肝癌細胞K1值在0.05mg/L作用下明顯增高，濃度增高時呈濃度依賴性下降，K2和值則呈單調濃度依賴性下降。CD在0.255.00mg/L濃度范圍

17、內引起兩種細胞粘彈性系數均顯著性下降，相同濃度CD作用下，癌細胞粘彈性系數下降幅度較之肝細胞相應幅度大，比較兩種骨架干擾劑作用癌細胞的情況，CD作用下其粘彈性系數下降幅度亦為最大，這預示著微絲結構被破壞可能較微管對細胞粘彈性的影響更為顯著。細胞粘彈性是反映細胞流變特性的重要生物物理參數，本研究所用兩種骨架干擾劑對肝細胞及肝癌細胞粘彈性系數均有顯著性影響，這表明微管和微絲結構的完整性是維持肝細胞和肝癌細胞粘彈特性及相應被動變形要能的必要條件，骨架干擾劑對兩種細胞粘彈性系數的效應方式和效應強度明顯不同，這提示癌細胞較正常細胞在骨架結構和機能狀態上的差異，這與文獻報道1，8是一致的。兩種細胞在CD作

18、用時其粘彈性系數均大幅度減小，這可能是因為CD破壞了緊貼細胞膜下的含豐富肌動蛋白纖維的凝膠層，影響了其強度和韌性。VBL研究所用濃度的低劑量區是該藥開始抑制到100%地抑制了3T3細胞增強的濃度范圍9，高劑量區是該藥化療時在體內的理論分布濃度范圍10，VBL作用下肝癌細胞的粘彈性系數K1、K2和基本上單調濃度依賴性下降，這在一定程度上可能反映了該藥臨床化療時的細胞流變學效應。有關這一問題我們將從細胞粘附力學的角度作進一步深入研究。國家自然科學基金資助項目(39370198)張鋼,現為第三軍醫大學高原醫學系病理生理學教研室講師,博士生(400038)張鋼（重慶大學生物工程研究院，國家教委生物力學

19、開放實驗室，重慶 400044）吳澤志（重慶大學生物工程研究院，國家教委生物力學開放實驗室，重慶 400044）王紅兵（重慶大學生物工程研究院，國家教委生物力學開放實驗室，重慶 400044）龍勉（重慶大學生物工程研究院，國家教委生物力學開放實驗室，重慶 400044）宋關斌（重慶大學生物工程研究院，國家教委生物力學開放實驗室，重慶 400044）蔡紹皙（重慶大學生物工程研究院，國家教委生物力學開放實驗室，重慶 400044）參考文獻1Ben-Zeev A. The cytoskeleton in cancer cells. Biochim Biophys Acta, 1985,780:1972Braet F, Zanger RD. Assessment of a method of isolation, purification and cultivation of rat liver endothelial cells. Lab Invest, 1994,70:9943吳澤志，李志清