1、羅氏（Roche）公司Tunel試劑盒操作說(shuō)明書(shū)（In situ cell death detectio n kit-POD法）一、原理：TUNEL（ TdT-mediated dUTP nick end labeli ng）細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒是用來(lái)檢測(cè)組織細(xì)胞在凋亡早期過(guò)程中細(xì)胞核DNA勺斷裂情況。其原理是熒光素（fluorescein ）標(biāo)記的dUTP 在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT Enzyme的作用下，可以連接到凋亡細(xì)胞中斷裂DNA的3 -OH末端，并與連接辣根過(guò)氧化酶（HRP horse-radish peroxidase ）的熒光素抗體 特異性結(jié)合，后者又與 HRP底物二氨基聯(lián)

2、苯胺（DAB反應(yīng)產(chǎn)生很強(qiáng)的顏色反應(yīng)（呈深棕 色），特異準(zhǔn)確地定位正在凋亡的細(xì)胞，因而在光學(xué)顯微鏡下即可觀察凋亡細(xì)胞；由于正 常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒(méi)有 DNA斷裂，因而沒(méi)有3 -OH形成，很少能夠被染色。本試 劑盒適用于組織樣本（石蠟包埋、冰凍和超薄切片）和細(xì)胞樣本（細(xì)胞涂片）在單細(xì)胞水 平上的凋亡原位檢測(cè)。還可應(yīng)用于抗腫瘤藥的藥效評(píng)價(jià)，以及通過(guò)雙色法確定細(xì)胞死亡類(lèi) 型和分化階段。二、器材與試劑器材：光學(xué)顯微鏡及其成像系統(tǒng)、小型染色缸、濕盒（塑料飯盒與紗布）、塑料蓋玻片或 封口膜、吸管、各種規(guī)格的加樣器及槍頭等；試劑：試劑盒含：1 號(hào)（藍(lán)蓋）Enzyme Solution 酶溶液：TdT 1

3、0X、2號(hào)（紫蓋）Label Solution 標(biāo)記液：熒光素標(biāo)記的 dUTP 1X、 3號(hào)（棕瓶）Converter-POD:標(biāo)記熒光素抗體的HRP 自備試劑：PBS雙蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、70%、DAB工作液（臨用前配制，5 卩 I 20 X DAB+V L 30%H2O2+94卩 I PBS ）、Proteinase K 工作液（10-20 v g/ml in 10 mMTris/HCI , pH 7.4-8 ）或細(xì)胞通透液（0.1%Triton X-100 溶于0.1%檸檬酸鈉，臨用前配制）、蘇木素或甲基綠、DNase 1 （3000 U/ml - 3 U/

4、ml in 50 mM Tris-HCl , pH 7.5 , 10 mMMgCI2, 1 mg/ml BSA）等。三、實(shí)驗(yàn)步驟操作流程圖：制作石蠟切片-脫蠟、水合一細(xì)胞通透一加TUNEL反應(yīng)液一加 converter-POD 與底物DAB反應(yīng)顯色光學(xué)顯微鏡計(jì)數(shù)并拍照。具體操作步驟（石蠟包埋切片的檢測(cè)）：1. 用二甲苯浸洗2次，每次5min；2. 用梯度乙醇（100、95、90、80、70%各浸洗1次，每次3min；注：上面兩步是針對(duì)石蠟切片樣本的處理4. 用Proteinase K 工作液處理組織15-30 min在21 - 37 C （溫度、時(shí)間、濃度均需摸索）如果凋亡細(xì)胞染色較弱時(shí)，可用

5、高濃度的Proteinase K （400 v g/mL）處理5分鐘。其它替代方法：石蠟切片的預(yù)處理也可根椐實(shí)際情況可采用下述三種替代方法之一，即 蛋白酶K處理的步聚改用下述方法，其余步聚均相同:替代方法1:將脫蠟及水合好的切片浸入通透液中8-10 min （通透液：0.1%TritonX-100 溶于0.1%檸檬酸鈉，需新鮮配制）替代方法2 :將脫蠟及水合好的切片浸入胃蛋白酶或胰蛋白酶中8-10 min （胃蛋白酶：0.25%-0.5%溶于 HCI PH2,胰蛋白酶 0.25%-0.5%溶于 0.01N HCI）替代方法3:將脫蠟及水合好的切片浸入含 200ml 0.1 M的檸檬酸緩沖液 P

6、H 6的塑料盒中，置于微波爐中350W（低檔）處理5 min。5. PBS漂洗2次；6. 制備TUNE反應(yīng)混合液：處理組用50卩l(xiāng) 1號(hào)液+450卩l(xiāng) 2 號(hào)液混勻；而陰性對(duì)照組僅加50卩I 2號(hào)液，陽(yáng)性對(duì)照組先加入100卩I DNase 1 ,反應(yīng)在1525Cx 10min,后面步驟同處理組。7. 玻片干后，加50卩I TUNEL反應(yīng)混合液（陰性對(duì)照組僅加 50卩I 2 號(hào)液）于標(biāo)本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應(yīng) 37TX 1h。8. PBS漂洗3次；9. 可以加1滴PBS在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞（激發(fā)光波長(zhǎng)為450500nm檢測(cè)波長(zhǎng)為 515565nn);10. 玻片干后加50卩l(xiāng)

7、3號(hào)液（converter-POD ）于標(biāo)本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中 反應(yīng) 37 CX 30min。11. PBS漂洗3次；12. 在組織處加50100卩l(xiāng) DAB底物，反應(yīng)1525CX 10min；13. PBS漂洗3次；14. 拍照后再用蘇木素或甲基綠復(fù)染，幾秒后立即用自來(lái)水沖洗。梯度酒精脫水、二甲苯 透明、中性樹(shù)膠封片。15. 加一滴PBS或甘油在視野下，用光學(xué)顯微鏡觀察凋亡細(xì)胞（共計(jì)200500個(gè)細(xì)胞）并拍照。可結(jié)合凋亡細(xì)胞形態(tài)特征來(lái)綜合判斷（未染色細(xì)胞變小，胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，晚期出現(xiàn)凋亡小體，貼壁細(xì)胞出現(xiàn)鄒縮、變圓、脫落；而染色細(xì)胞呈現(xiàn)染色質(zhì)濃縮、 邊緣化，核膜裂解，染色

8、質(zhì)分割成塊狀/凋亡小體）對(duì)于培養(yǎng)細(xì)胞的預(yù)處理： 在載玻片上鋪一層薄薄的多聚賴(lài)氨酸，干燥后在去離子水中漂洗，干燥后4 C保存； 適當(dāng)方法誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時(shí)設(shè)未經(jīng)誘導(dǎo)的對(duì)照組，各組離心收集約1X 106個(gè)細(xì)胞，PBS洗一次，重懸，加到鋪好的多聚賴(lài)氨酸載玻片上，自然干燥，使細(xì)胞很好的吸附到載玻片上； 將吸附細(xì)胞的載玻片在4多聚甲醛中固定25min； PBS浸洗二次，每次5min； 將吸附細(xì)胞的載玻片在 0.2%的Triton X-100 中處理5min； PBSS洗二次，每次5min； 后續(xù)操作如同石蠟包埋切片的 6-15四、注意事項(xiàng)1. 進(jìn)行PBS清洗時(shí)，每次清洗5 min。2. PBS清洗后，為

9、了各種反應(yīng)的有效進(jìn)行，請(qǐng)盡量除去PBS溶液后再進(jìn)行下一步反應(yīng)。3. 在載玻片上的樣本上加上實(shí)驗(yàn)用反應(yīng)液后，請(qǐng)蓋上蓋玻片或保鮮膜，或在濕盒中進(jìn) 行，這樣可以使反應(yīng)液均勻分布于樣本整體，又可以防止反應(yīng)液干燥造成實(shí)驗(yàn)失敗。4. TUNEL反應(yīng)液臨用前配制，短時(shí)間在冰上保存。不宜長(zhǎng)期保存，長(zhǎng)期保存會(huì)導(dǎo)酶活性的 失活。5. 如果20 X DAB溶液顏色變深成為紫色，則不可使用，需重新配制。6. 用甲基綠(Methyl Green )染液(3-5%甲基綠溶于0.1M醋酸巴比妥PH4.0 )染色后，請(qǐng)用滅菌蒸餾水清洗多余的甲基綠。然后進(jìn)行洗凈(100%醇)、脫水(二甲苯)透明、封片后通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察操作。

10、如果此時(shí)使用8090%勺乙醇洗凈時(shí)，甲基綠比較容易脫色，注意快速進(jìn)行脫水操作。7. 2號(hào)液含甲次砷酸鹽和二氯鉆等致癌物，可通過(guò)吸入、口服等途徑進(jìn)入機(jī)體，注意防 護(hù)。8. 試劑保存；未打開(kāi)的試劑盒貯存在 -20 C( -1525C)； 3號(hào)液(converter -POD )液 一旦解凍，以后就保存在 4C(28C)下，至少在6 m內(nèi)穩(wěn)定，避免再次凍存；TUNEL反 應(yīng)液臨用前配好后，放至冰上直至使用。現(xiàn)象可能原因建議結(jié)果分析或在 高度 增殖/代謝的 組織 細(xì)胞 中可DNA片斷，從而引起假陽(yáng)性結(jié)果；而有些類(lèi)型的凋亡性細(xì)胞死亡缺乏DNA斷裂或DNAS解不完全，以及細(xì)胞外的矩陣成分阻止TdT進(jìn)入胞內(nèi)

11、反應(yīng)，進(jìn)而產(chǎn)生假陰性結(jié)果。TdT酶的濃度過(guò)高用 TdT dilution buffer*作 1 :2 1 : 10稀釋TdT酶反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或TdT酶反應(yīng)過(guò)注意控制反應(yīng)時(shí)間，并確保TdT程中反應(yīng)液滲漏，細(xì)胞或組織表面不酶反應(yīng)液能很好地覆蓋樣品。能保持濕潤(rùn)。光照紫外線導(dǎo)致包埋試劑的聚合嘗試改用其它包埋材料或其它聚非特異（如：甲基丙烯酸會(huì)導(dǎo)致樣本 DNA的合試劑性染色斷裂）在固定組織時(shí)樣本DNA已斷裂（內(nèi)源確保樣品取樣后立即固定或通過(guò)核酸酶的作用）肝靜脈灌注固定使用了不適當(dāng)?shù)墓潭ㄒ海缫恍┧岵捎猛扑]的固定液性固定液固定后某些核酸酶活性依然較咼導(dǎo)致用含有dUTP和dAPT的溶液封閉DNA斷 裂如果以

12、乙醇或甲醇固定的樣本則標(biāo)記用溶于PBS PH7.4中的4多聚甲效率較低（因?yàn)樵诠潭〞r(shí)染色質(zhì)未能醛固定標(biāo)記率低與蛋白質(zhì)交聯(lián)，而在操作中丟失）或福爾馬林或戊二醛固定。固定時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，導(dǎo)致交聯(lián)程度過(guò)高減少固定時(shí)間，或用溶于PBSPH7.4的2%多聚甲醛固定熒光淬滅Fluoresce nee在普通光照10分鐘就會(huì)嚴(yán)重淬滅，需注意避光操作促滲條件不佳，以致于試劑不能到達(dá)靶分子或濃度過(guò)低1、增加通透劑促滲時(shí)間2、增加通透劑的作用溫度(15-25 C)3、優(yōu)化蛋白酶K的作用濃度和作用時(shí)間(如：以400ug/ml作 用 5min)4、0.1M的檸檬酸鈉 70 C作用30mi n。H、/、勻匕 熒光冃景很咼支原體污染請(qǐng)使用支原體染色檢測(cè)試劑盒檢測(cè)是否為支原體污染TdT酶的濃度過(guò)高或反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)用 TdT dilution buffer*作 1 :2 1 : 10稀釋或注意控制反應(yīng)時(shí)間紅細(xì)胞中血紅蛋白導(dǎo)致的自發(fā)熒光產(chǎn) 生嚴(yán)重干擾。宜選擇其它細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑 盒。高速分裂和增殖的細(xì)胞，有時(shí)也會(huì)出 現(xiàn)細(xì)胞核中的DNA斷裂。陽(yáng)性對(duì)照沒(méi)有信號(hào)DNase I的濃度過(guò)低1、冷凍切片使用3u/ml