1、Mller細胞對大鼠視網膜微血管內皮細胞增生和遷移的影響 08-04-07 11:41:00 編輯：studa20 作者：郭斌，王應利，惠延年，王雨生，馬吉獻 【摘要】 目的：用免疫磁珠法原代培養大鼠視網膜微血管內皮細胞(RMEC)，觀察共培養Mller細胞對視網膜微血管內皮細胞增生和遷移的影響。方法：采用免疫磁珠的細胞分選法分離大鼠視網膜微血管內皮細胞，在條件培養基中培養生長，采用第因子抗體免疫組化染色方法鑒定細胞，采用流式細胞術和臺盼蘭染色分析傳代中的微血管內皮細胞純度以及細胞活性。傳統的方法培養并鑒定Mller細胞。采用不同孔徑微孔濾膜培養小室，進行大鼠視網膜微血管內皮細胞與Mller細

2、胞分離共培養，對照組培養環境中無Mller細胞。以細胞曲線描繪反映細胞增生，并用流式細胞儀測定細胞周期。相差顯微鏡下計算穿過微孔濾膜遷移貼附于背面的內皮細胞數量。結果：通過磁珠分離方法獲得了純度為97.13%大鼠視網膜微血管內皮細胞，細胞活力達92，第因子抗體染色呈陽性。與Mller細胞共培養的RMEC可早于正常培養23d進入生長平臺期。RMEC中S期和G2期比例增加，G1期比例相對減少。S、G2和G1期百分比，在共培養組24h分別為44.0，11.2和44.8，48h分別為42.3，10.9和46.8；對照培養組24h分別為41.3，4.9和53.8，48h分別為40.1，4.7和55.2。

3、遷移的細胞數增加，共培養6h移行至膜下的內皮細胞數12.22.5個，12h為51.723.4個，對照培養6h移行至膜下的內皮細胞3.32.5個，12h為14.77.0個，6h和12h兩組內皮細胞數差異具有統計學意義(P 0.05)。結論：免疫磁珠細胞分選方法可以獲得高純度的大鼠視網膜微血管內皮細胞，且對細胞活力無影響。Mller細胞可以促進視網膜內皮細胞的遷移，促進該細胞的增生。 【關鍵詞】 視網膜 0引言 視網膜血管形成包括血管發生（vasculoge- nesis）和血管生成（angiogenesis）形式，前者是視網膜形態功能發育過程中的重要環節1,2，后者與許多眼底病發病相關 3,4：

4、如早產兒視網膜病變、增生性糖尿病視網膜病變以及視網膜靜脈阻塞等。視網膜微血管內皮細胞（RMEC）是組成視網膜血管的結構單位之一，視網膜血管生成與該細胞所處狀態有關，如細胞增生、移行、分化等。從細胞水平來分析視網膜血管生成內環境，可以發現RMEC受到多種周圍細胞的調節，其中之一即是Mller細胞5。視網膜中Mller細胞是視網膜內最主要的大膠質細胞，它貫穿于視網膜各層，在調節營養神經元、排除代謝產物、維持血管穩態等方面起到重要作用5。目前多數文獻報道了正常條件下Mller細胞在RMEC分化和緊密連接通透性方面的作用6-8，而無涉及對于RMEC增生和遷移方面的影響。為避免細胞種屬間的干擾，我們原代

5、培養Wistar大鼠的RMEC和Mller細胞，采用微孔濾膜培養小室建立三維共培養模型，研究在非接觸情況下，Mller細胞對RMEC增生和遷移方面的影響。為進一步研究Mller細胞分泌作用對RMEC的部分生物學特性的影響奠定基礎。 1材料和方法 1.1材料 100mL/L 胎牛血清（Fetal Bovine Serum, FBS），杭州四季青的DMEM（Gibco），100g/L鏈霉素，100kU/L青霉素，55kU/L肝素（Sigma），75g/L內皮生長添加劑（endothelial cell growth supplement, ECGS），Sigma，小鼠IgG免疫磁珠（直徑4.50.

6、2m，Dynal Biotech）100 L，用無血清的DMEM清洗3遍，然后加入小鼠抗大鼠PECAM-1 mAb（1g/L，Chemicon）10L 4包被過夜。包被后的磁珠用含有100mL/L FBS清洗36遍，懸浮磁珠。 1.2.1 RMEC的培養和鑒定 RMEC分離培養采用改良Hewitt等方法9-12 ，選擇15只Wistar大鼠（由第四軍醫大學實驗動物中心提供），體質量250300g，屈光介質清晰，眼底無異常。乙醚麻醉處死大鼠，迅速取出眼球，置于含有青霉素/鏈霉素的磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered solution, PBS)中浸泡5min取出，解剖顯微鏡（St

7、emi V6, Zeiss）下無菌操作取出30只視網膜。將視網膜收集在一起，用PBS沖洗，再置于培養皿中剪成小塊，再置于1g/L的型膠原酶（Sigma，采用無血清的DMEM配制）5mL中37消化30min，過雙層的53m尼龍篩網（上海德華金屬網帶有限公司），收集濾液離心（400g）10min，棄上清，使用含有100mL/L FBS中和，吹散細胞，400g離心10min，棄上清液。加入100mL/L FBS 1.5mL吹打使細胞懸浮，加入抗體包被的免疫磁珠，4孵育30min，緊密結合后，置于磁珠分離裝置（MCP-1, Dynal）上用100mL/L FBS洗滌結合磁珠的細胞6次，將細胞接種于明膠

8、包被的培養板中，加入培養液。細胞培養箱（Heraeus）環境為37、50mL/L CO2、950mL/L 空氣，細胞擴增傳代采用2.5g/L胰酶（Gibco）和0.2g/L 乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid, EDTA)（11）混合消化液(TE)。將已消毒的5mm蓋玻片置于30mm培養皿中，按1108/L細胞接種于培養皿中進行細胞爬片，待細胞貼壁牢固后，PBS清洗爬片，40g/L多聚甲醛固定20min，PBS清洗，30mL/L H2O2孵育 15min。PBS清洗，封閉血清孵育20min，兔抗大鼠因子抗體（Zymed）在37孵育（濕盒）180min

9、，陰性對照用PBS液代替一抗。PBS清洗，加入辣根過氧化物酶標記的多聚物連接兔IgG工作液37孵育（濕盒）30min。PBS清洗標本，DAB顯色（避光，鏡下觀察至棕色）約25 min，立體顯微鏡（Leica）觀察照相。顯色棕黃色為陽性表達。第6代RMEC使用含有0.4g/L EDTA的PBS溶液沖洗1次，與1mL細胞分離溶液孵育，分散細胞，細胞再用含有100mL/L FBS清洗，使用含有10mL/L山羊血清的三乙醇胺緩沖鹽溶液(triethanolamine-buffered saline, TBS)封閉 20min，后與小鼠抗大鼠PECAM-1抗體在冰盒中孵育30min。陰性對照采用DMEM

10、代替小鼠抗大鼠PECAM-1抗體。孵育后細胞用TBS/10g/L BSA清洗2次，再與FITC-小鼠IgG在冰盒中孵育30 min。染色后細胞使用TBS/10g/L BSA洗滌兩次，懸浮于0.5mL TBS/10g/L BSA，使用流式細胞儀（FACS，Becton-Dickinson）分析。取第6代RMEC懸液，以4g/L臺盼藍進行細胞染色，3min內在倒置相差顯微鏡（Axiovert 25，Zeiss）下計數拒染細胞數，每次至少計數100個細胞，計數3次，按活細胞率=拒染細胞數/（拒染細胞數+染色細胞數）的百分數計算平均細胞存活率。 1.2.2 Mller細胞培養及鑒定 參考Reichen

11、bach等13方法，將出生2d的Wistar新生鼠麻醉處死，取出眼球，剝離視網膜，用PBS沖洗，再置于培養皿中剪成小塊，用2.5g/L 胰酶消化，振蕩20min，加入100mL/L FBS終止消化，經53m尼龍篩網，得細胞懸液，離心洗滌后接種于培養板中，加入培養液。培養環境及傳代方法同RMEC。細胞爬片標本制作同前。PBS清洗，封閉血清孵育20min，一抗采用兔抗大鼠GFAP（Dako）和小鼠抗大鼠vimentin（Dako），在37孵育（濕盒）180min，陰性對照用PBS液代替一抗。PBS清洗，加入FITC-二抗工作液37孵育（濕盒）60min。PBS清洗標本，封片，熒光顯微鏡（Zeiss

12、）觀察照相。顯示綠色熒光為陽性表達。 1.2.3 RMEC實驗 第56代RMEC生長接近70%時，換去血清培養液，加入無血清培養液，繼續培養24 h。取第34代生長狀態良好的Mller細胞，TE消化制成單細胞懸液，細胞密度為1107/L，接種于微孔孔徑0.4m Millicell（Millipore）或Transwell（Corning）小室內底面（用于增生實驗），或接種于微孔孔徑8m Millicell（用于遷移實驗），細胞鋪滿底面80%可用于進一步實驗。取第56代生長狀態良好的RMEC，TE消化制成單細胞懸液，細胞密度為2107/L，每孔約500L接種于24孔板(明膠預先包被)，共接種4個

13、24孔板，分成對照組（孔內放入未接種Mller細胞的Millicell小室）和共培養組（孔內放入接種Mller細胞的Millicell小室）。培養液為100mL/L FBS，每隔2d細胞換液1次。每天各組細胞取36孔細胞進行計數，并計算均值。共記數10d，以培養時間為橫軸，細胞數(對數)為縱軸，描繪曲線。將RMEC用無血清DMEM制成密度為1108/L細胞懸液，接種2mL于6孔板(明膠預先包被)，培養液為無血清DMEM，分成對照組（孔內放入未接種Mller細胞的Transwell小室）和共培養組（孔內放入接種Mller細胞的Transwell小室）；細胞培養24h和48h后，常規方法消化，收集

14、細胞，PBS洗滌后，加入10g/L RNA酶溶液200L，37水浴15min，加入碘化丙啶(PI，BD公司)，上流式細胞儀檢測DNA含量和細胞周期，資料均經軟件收集、貯存和分析。參考孫慧勤等14遷移實驗方法，將預先接種好Mller細胞的24孔板內放入相應規格的8m微孔孔徑 Millicell小室（12孔），對照組（12孔）在未接種Mller細胞的24孔板內進行相同操作。將RMEC用100 mL/L FBS的DMEM制成密度為1108/L細胞懸液，接種200L于Millicell小室內，下方24孔板內加入500L培養液搖勻，放入孵箱中，6,12 h后取6個Millicell小室，以棉簽拭去小室內

15、底面濾膜上的內皮細胞。PBS 洗后將小室置于950mL/L乙醇中固定10min，PBS洗后于高倍鏡（100）下隨機計數13個視野內的外底面細胞數。 圖1 微孔濾膜培養小室示意圖 統計學處理：數據以均數標準差(x s)表示，采用Microsoft Excel 2003軟件統計數據，進行t檢驗，P0.05表示數值差異具有統計學意義。 2結果 2.1大鼠RMEC培養及鑒定 原代RMEC可以結合46個磁珠(圖2A)，其中以結合4個磁珠的常見，也可以看到結合更多磁珠的細胞條索。RMEC一般在24h內貼壁，48h完全牢固貼壁，72h可見細胞伸展，開始增生，呈現克隆樣生長(圖2B)，14d左右細胞克隆融合呈

16、鋪路石樣外觀。貼壁后細胞多數呈扁平梭形，也有少數細胞形態不規則，細胞長度約為磁珠直徑2030倍，寬度約為磁珠直徑510倍。新生的細胞還可以結合培養液中游離的磁珠。細胞經歷傳代后(圖2C)，磁珠可自然脫落，細胞形態較原代更加規則，傳代周期縮短至912 d。RMEC第因子抗體染色陽性（圖3A）。流式細胞儀檢測樣品抗PECAM-1陽性細胞（圖3B）比例為97.1%。臺盼蘭染色活細胞率92%。 2.2大鼠Mller細胞生長 大鼠Mller細胞在接種后24h內即可貼壁，第1次換液可將漂浮的和貼壁差的細胞洗掉，剩下的細胞多數為Mller細胞，可能混雜神經元細胞，原代細胞一般714d即可長滿，按照13方式傳代，傳代后細胞周期縮短至57d，經過2次傳代后可獲純度相對較高的Mller細胞。細胞形態主要分為兩種：一種胞體較大，不規則片狀，折光性暗，胞質內原纖維較豐富，胞突的分支少而短（圖4A）；另一種胞體較小，蜘蛛狀，折光性強，胞突多而長（圖4B）。Mller細胞進行GFAP