1、第六章 食品中化學物質(zhì)的基礎(chǔ)毒性評價 毒理學是一門實驗科學。本章介紹最基本的毒理學試驗，包括系統(tǒng)毒性和局部毒性的研究。基礎(chǔ)毒性是與特殊毒性相對應的，特殊毒性主要是指致癌作用、致突變作用、致畸和生殖毒性等。基礎(chǔ)毒性研究是化學品安全性評價和危險性評價的重要組成部分。另一方面，對外源化學物系統(tǒng)毒性研究可能發(fā)現(xiàn)其毒作用的靶器官，為進一步的靶器官毒理學研究和中毒機制研究提供線索。第一節(jié) 急性毒性試驗 急性毒性試驗是毒理學研究中最基礎(chǔ)的工作，是我們了解外源化學物對機體產(chǎn)生的急性毒性的根本依據(jù)。1927年Trevan引入了半數(shù)致死量(LD50)的概念來評價急性毒性，此后，該指標得到廣泛應用，并成為急性毒性的

2、主要指標。化學物的急性毒性資料對于安全性評價及化學物管理方面非常重要。對急性毒性試驗程序國際上和我國已有一些法規(guī)。以下就試驗程序的基本原則和進展作一介紹。一、急性毒性和急性毒性試驗的目的 急性毒性是指實驗動物一次接觸或24小時內(nèi)多次接觸某一化學物所引起的毒效應，甚至死亡。對于上述定義中的“一次”接觸在經(jīng)呼吸道與皮膚染毒時，指在一個規(guī)定的期間內(nèi)使實驗動物持續(xù)接觸化學物的過程。而“多次”的概念是指當外源化學物毒性很低時，即使一次給予實驗動物最大染毒容量還觀察不到毒性作用，同時該容量還未達到規(guī)定的限制劑量時，便需要在24小時內(nèi)多次染毒，從而達到規(guī)定的限制劑量。 急性毒性試驗的目的： 1. 評價化學物

3、對機體的急性毒性的大小、毒效應的特征和劑量-反應(效應)關(guān)系，并根據(jù)LD50值進行急性毒性分級。 2. 為亞慢性、慢性毒性研究及其他毒理試驗接觸劑量的設計和觀察指標的選擇提供依據(jù)。 3. 為毒作用機制研究提供線索。 通過外源化學物的急性毒性試驗，可以得到一系列的毒性參數(shù)，包括：絕對致死劑量或濃度(LD100或LCl00)；半數(shù)致死劑量或濃度(LD50或LC50)；最小致死劑量或濃度(MLD，LD01或MLC，LC01)；最大耐受劑量或濃度(MTD，LD0或MTC，LC0)，或稱為最大非致死劑量(MNLD)。以上4種參數(shù)是外源化學物急性毒性上限參數(shù)，以死亡為終點。此外，還可以得到急性毒性下限參數(shù)

4、，即：急性毒性LOAEL(觀察到有害作用的最低劑量)；急性毒性NOAEL(未觀察到有害作用的劑量)。這兩個參數(shù)則是以非致死性急性毒作用為終點。因此，急性毒性試驗可以分為兩類。一類是以死亡為終點，以檢測受試物急性毒性上限指標為目的的試驗，這類試驗主要是求得受試物的LD50值。另一類急性毒性試驗檢測非致死性指標。二、經(jīng)典急性致死性毒性試驗OECD(1987)關(guān)于經(jīng)典急性毒性試驗規(guī)定如下。實驗動物首選大鼠。應設足夠的劑量組，至少3組，組間有適當?shù)膭┝块g距，產(chǎn)生一系列毒性和死亡率，以得到劑量-反應關(guān)系和求得LD50。每組至少同性別5只動物，如用雌性動物，應未產(chǎn)和未孕。限量試驗劑量為2000mg/kg體

5、重，用雌雄各5只動物進行試驗。觀察期14天，臨床觀察每天至少一次，觀察皮膚、被毛、眼睛和粘膜改變、呼吸、循環(huán)、自主和中樞神經(jīng)系統(tǒng)、四肢活動和行為方式的變化，特別要注意有無震顫、驚厥、腹瀉、嗜睡、昏迷等現(xiàn)象。準確記錄死亡時間。于染毒前、染毒后每周和死亡時測定體重。所有的動物均應進行大體尸體解剖，并記錄觀察到的全部病變，存活24小時以上的動物必要時進行組織病理學檢查。可用任何一種公認的統(tǒng)計學方法計算LD50的值及95的可信限范圍，如B1iss法，Litchfield和Wilcoxon法，F(xiàn)inney法，Weil法，Thompson法，Miller和Tainter法等。 有關(guān)經(jīng)典急性致死性毒性試驗的

6、要點如下： 1. 實驗動物選擇和處置 試驗要求健康成年實驗動物，一般是在小鼠、大鼠等動物中測半數(shù)致死量，并在狗中觀察毒性反應。一般嚙齒類動物年齡與體重相關(guān)，故可以用體重表示動物年齡。急性毒性試驗一般用大鼠180240g，小鼠1825g，家兔22.5kg，豚鼠200250g，狗1015kg。不同品系的同種動物年齡相同會出現(xiàn)體重不同，以小鼠為例，純系小鼠如C57BL6、BALB/C體重較小，而同年齡的昆明種小鼠則體重較大。試驗動物體重變異范圍不應超過平均體重的20。所用實驗動物應當是雌、雄各半，雌性實驗動物要求是未經(jīng)交配和受孕的。如果發(fā)現(xiàn)受試化學物急性毒性有性別差異時，應分別求出雌性與雄性動物的L

7、D50值。如果試驗是為致畸試驗作劑量準備，也可僅做雌性動物的LD50試驗。 實驗動物應進行檢疫，檢疫期一般為57天，剔除異常的動物。檢疫期與實驗期間雌、雄動物必須分籠飼養(yǎng)。實驗動物根據(jù)實驗設計的方法隨機分組。染毒途徑應模擬人可能的接觸途徑。經(jīng)口灌胃染毒，要求試驗前要對動物禁食。大鼠應過夜禁食，小鼠應禁食4小時。 大動物則在每日上午喂食前給以受試化學物。染毒后繼續(xù)禁食24小時。但在禁食時要保障飲水的供應。 2. 實驗設計 在進行劑量設計之前，首先要了解受試外源化學物的結(jié)構(gòu)式、分子量、常溫常壓下的狀態(tài)(液態(tài)、固態(tài)或氣態(tài))、生產(chǎn)批號、純度、雜質(zhì)成分與含量、溶解度、揮發(fā)度、pH值(可測時)等等。然后根

8、據(jù)該受試物有關(guān)的測試規(guī)范要求，決定實驗設計。對于一個新的受試化學物，我們可以先查閱文獻找到與受試化學物的化學結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)相近的化學物毒性資料，取與本實驗相同動物物種或品系，相同染毒途徑的LD50值作為參考值，選擇劑量系列。例如，要測定氯乙酸的大鼠經(jīng)口LD50，查文獻可知乙醇大鼠經(jīng)口LD50為10.8gkg體重，乙酸為3.4gkg體重，氯乙醇為71mg/kg體重。故氯取代可增強毒性，推測氯乙酸的大鼠經(jīng)口LD50應與氯乙醇相近，實測結(jié)果為78mg/kg體重。 劑量選擇是否恰當是急性毒性試驗能否成功的基礎(chǔ)。就嚙齒類動物而言，總的原則是先用少量動物，以較大的劑量間隔(一般是按幾何級數(shù))給藥，找出10

9、90(或0100)的致死劑量范圍，然后在這個劑量范圍內(nèi)以合適的間距設幾個劑量組。在利用不同的方法計算化學物LD50時，實驗設計中對劑量設計和動物數(shù)的要求不同。急性致死性毒性試驗可以不設陰性對照組。 3. 觀察 染毒后一般要求觀察14天。觀察實驗動物的中毒癥狀，對于獲得受試化學物的急性毒性特征十分重要，有助于了解該化學物的靶器官。還應注意觀察記錄發(fā)生每種癥狀的時間、癥狀表現(xiàn)程度、各癥狀發(fā)展的過程及死亡前特征和死亡時間。臨床中毒反應和死亡時間可提供中毒機制的線索。如染毒后立即出現(xiàn)驚厥、共濟失調(diào)和死亡可能是神經(jīng)毒性。經(jīng)一段潛伏期后的遲發(fā)性死亡可能提示對腎或肝的作用。腹瀉和或豎毛，可能為植物神經(jīng)興奮。

10、 有些化學物(如有機磷類化合物)中毒癥狀發(fā)展迅速且很快死亡。而有些化學物的中毒癥狀發(fā)展緩慢，甚至出現(xiàn)癥狀緩解，此后再發(fā)生嚴重癥狀而死亡。如碳基鎳染毒早期先出現(xiàn)上呼吸道癥狀，當日即可緩解，23日后或更晚些才出現(xiàn)嚴重的肺水腫，呼吸困難而死亡。 實驗動物個體對受試化學物的反應性快慢也有差異，如過氧化二碳酸二環(huán)已酯給小鼠腹腔注射后，在同一劑量組中最早死亡的可在染毒后7小時，而最遲的可達染毒后150小時。對于速殺性化學物也可僅根據(jù)24小時的死亡數(shù)計算LD50。有些速殺性化學物(如久效磷)，其24小時的LD50與14天的LD50沒有差別。若是報告24小時的LD50，則應在試驗結(jié)果中加以說明。在實際工作中，

11、應該根據(jù)受試物的有關(guān)測試規(guī)程的要求來確定觀察期的長短。當然，對于特殊的化學物不能完全固定觀察期限。 化學物給實驗動物染毒后，動物往往出現(xiàn)興奮抑制死亡，或者抑制死亡的現(xiàn)象。如以含有氰基的氰氫酸和丙烯腈對大鼠和小鼠染毒后，都很快出現(xiàn)興奮。染毒丙烯腈的動物首先出現(xiàn)活動增加、騷動、竄跑、甚至跳躍，之后出現(xiàn)呼吸困難，耳與尾青紫色；而氰氫酸呈一過性興奮，呼吸加快、加深，之后呼吸困難，耳與尾則為桃紅色。可見同為氰化物，其中毒機制有所不同。有的化學物給動物染毒后不久，動物先出現(xiàn)抑制現(xiàn)象，直至死亡。例如N-苯甲酰基-N-(3，4-二氯苯基)-2-氨基-丙酸乙酪，給大鼠或小鼠灌胃致死劑量，動物很快表現(xiàn)為閉目靜臥、

12、四肢無力、站立不穩(wěn)、步態(tài)蹣跚、呼吸減慢，最后缺氧、口鼻青紫死亡。有的化學物給予動物后，動物先出現(xiàn)刺激癥狀，如碳基鎳吸入染毒在大、小鼠先出現(xiàn)前肢反復搔鼻等呼吸道刺激癥狀。小鼠吸入染毒某些餾溫段的冷油后，大汗淋漓，被毛全濕，表現(xiàn)為神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。 在觀察期內(nèi)還需多次測量動物體重，體重改變可以反映動物染毒后的整體變化。實驗動物染毒后的死亡時間也應記錄、分析，有時死亡時間的分析可以提供一些重要信息。例如久效磷小鼠經(jīng)口與腹腔注射染毒，均呈現(xiàn)隨染毒劑量增加，死亡時間縮短。以死亡時間與染毒劑量作圖，可呈直線負相關(guān)，提示實驗動物致死是可能由于化學物原形所致。而過氧化二磷酸二環(huán)己酯給大鼠腹腔注射后呈現(xiàn)明顯的染毒劑

13、量對數(shù)值與死亡時間呈負相關(guān)關(guān)系，但給小鼠腹腔注射后，染毒劑量或染毒劑量對數(shù)與死亡時間無明顯相關(guān)。這可能是與該化學物在大鼠和小鼠體內(nèi)代謝不同有關(guān)。 急性毒性研究中，應注意觀察非致死指標及其可復性，從而能夠?qū)瘜W物的急性毒性作全面的了解。可復性毒效應是指隨著化學物從體內(nèi)消失而逐漸減小以至消失的毒效應。毒作用的可復性與作用器官和系統(tǒng)、化學物本身的毒作用特點、化學物接觸時間、特定時間內(nèi)機體接觸化學物的總量、動物的年齡及一般狀況有關(guān)。化學物引起機體激素失衡常常是一種可復性的反應，比如化學物對甲狀腺的影響，如果沒有超過導致甲狀腺組織損傷的閾值，則常常是一種可復性的毒效應。發(fā)生在組織再生能力迅速的器官(如肝

14、)的損傷比發(fā)生在沒有再生能力的組織(如神經(jīng))的損傷更可能是可復性的。在動物研究中觀察到的不可復性的毒效應，在外推到人時比可復性毒效應更為重要。 對中毒死亡的實驗動物應及時解剖作大體尸檢，觀察各器官有無充血、出血、水腫或其他改變，必要時對肉眼觀察有變化的臟器進行組織病理學檢查。實驗結(jié)束時存活與對照組的動物也應作病理學檢查。死亡動物的大體尸檢或組織病理學檢查有時可得到有價值的資料。 4. LD50計算 LD50是經(jīng)統(tǒng)計學計算得到的毒性參數(shù)，并可報告其95可信限。LD50(LC50)值是一個統(tǒng)計量，較少受實驗動物個體易感性差異的影響，較為準確，因此是最重要的急性毒性參數(shù)，也用來進行急性毒性分級。對于

15、非致死性指標的量化問題，可以利用ED50(median effective dose)和相應的劑量-反應關(guān)系曲線來解決。ED50是指一次給予實驗動物某種化學物引起動物群體中50的個體出現(xiàn)某種特殊效應的劑量，該指標也是通過統(tǒng)計學計算處理得到的。圖 6-1 急性毒性的劑量-反應曲線關(guān)系曲線模式圖 由圖6-1可以看到在以對數(shù)劑量為橫軸，死亡率為縱軸的圖中，隨劑量增加，累積死亡率也增加，呈“S”形曲線；如果以死亡頻率為縱軸時，則不同劑量下死亡頻率的分布呈正態(tài)分布，為典型的“鐘罩”型；而將累積死亡率轉(zhuǎn)換為概率單位后作為縱軸時，則對數(shù)劑量與死亡率(概率單位)的圖形則表現(xiàn)為直線。因此我們可以將劑量對數(shù)值與死

16、亡率(概率單位)的關(guān)系，進行直線回歸，用最小二乘法求出a、b值。代入直線方程：ya十bX。式中，X為劑量對數(shù)值，y為死亡率的概率單位。利用此式即可求得受試化學物的LD50及其95可信區(qū)間。 對數(shù)劑量-反應曲線的斜率在進行危險性評價時比LD50的數(shù)值更重要。Finney(1978)曾指出斜率是LD50標準差的倒數(shù)，反映了群體對此受試物反應的差異性。平行的劑量-反應關(guān)系曲線可能提示這兩種化學物的毒作用機制、動力學特征類似。 利用LD50來比較不同外源化學物急性毒性大小見圖6-2。化學物A、B、C的劑量反應關(guān)系曲線(已用劑量對數(shù)和死亡率(概率單位)轉(zhuǎn)換成直線)的斜率相同，而LD50 ABC，因此，急

17、性毒性大小的次序為CBA。而化學物D的LD50與C相同。但斜率比C大，可見在低于LD50的劑量時急性毒性CD，即在低于LD50的劑量時化學物C引起實驗動物的死亡率高于化學物D。圖6-2 四種不同外源化學物的LD50及劑量/反應(死亡)關(guān)系曲線 最小致死劑量(MLD)。如果急性毒性試驗得到較好的劑量-反應關(guān)系，則可直接計算LD0l(使一組實驗動物1死亡的劑量)，并以LD0l作為MLD的估計值。實際上，即使得到很好的劑量-反應關(guān)系曲線，LD0l的可信限將是相當寬的，并包含了MNLD(最大非致死劑量)。 5. 經(jīng)典的急性致死性毒性試驗的局限性 對經(jīng)典的急性毒性試驗和LD50的意義，多年來一直有不同的

18、意見：消耗的動物量大，按經(jīng)典法的要求測LD50，一次實驗需要60100只動物。獲得的信息有限，LD50的值又不能等同于急性毒性，死亡僅僅是評價急性毒性的許多觀察終點之一。化學物單次大劑量急性中毒，動物多死于中樞神經(jīng)系統(tǒng)及心血管功能障礙，并不能很好地顯示出各自的毒作用特征，另外，由于死亡迅速，各種器質(zhì)性變化尚未發(fā)展，不能顯示出靶器官的病變。測得的LD50值實際上僅是近似值，1977年歐洲共同體組織了13個國家的100個實驗室，統(tǒng)一主要的實驗條件對5種化學物的LD50進行測定。根據(jù)收集到的80個實驗室的結(jié)果分析，結(jié)果仍然存在相當大的差別，可達2.448.38倍(表6-1)。在安全性評價中僅評價動物

19、死亡和簡單的癥狀觀察是不夠的，更需要的是生理學、血液學及其他化驗檢查所提供的深入詳細的毒性信息。ICH(1991)規(guī)定在新藥的報批材料中，不必準確地測定LD50，只需了解其近似致死量和詳細觀察記錄中毒表現(xiàn)即可。為此，已發(fā)展了一些急性毒性試驗的方法。表6-l 五種化合物的LD50值的實驗室間變異化合物 范圍(mg/kg) 比值(最大值最小值)五氯酚 74620 8.38 水楊酸鈉 9302328 2.50 苯胺 4791169 2.44 乙酰苯胺 7233060 4.23 氯化鎘 105482 4.59三、急性毒性分級 目前國際上對外源化學物急性毒性分級的標準不統(tǒng)一。世界衛(wèi)生組織的毒性分級標準可

20、見表6-2。歐洲共同體的急性口服毒性分級標準為：高毒(Very Toxic，LD5025mg/kg)、有毒(Toxic，LD50為25200mg/kg)、有害(Harmful：LD50為2002000mg/kg)、不分級(UncIassified，LD502000mg/kg)等四個等級。除了參考國際上的幾種分級標準外，我國于1978年提出了農(nóng)藥及工業(yè)毒物急性毒性分級標準及農(nóng)藥急性毒性分級暫行標準。目前我國食品毒理則沿用了國際上六級標準，即極毒、劇毒、中等毒、低毒、實際無毒、無毒(表6-3)。表6-2 外源化學物急性毒性分級(WHO) 6只大鼠吸入4小時毒性分級 大鼠一次經(jīng)口LD50 死亡24只

21、 兔經(jīng)皮LD50 對人可能致死劑量 (mg/kg) 的濃度(ppm) (mg/kg) g/kg (g/60kg)劇毒 1 10 5 0.05 0.1高毒 1 10 5 0.05 3中等毒 50 100 44 0.5 30低毒 500 1000 350 5 25微毒 50000 10000 2180 15 1000表6-3 我國食品毒理急性毒性分級法1994急性毒性分級 大鼠經(jīng)口LD50(mg/kg) 大致相當于體重為70kg人的致死劑量6級(極毒) 1 稍嘗，7滴5級(劇毒) 150 7滴1茶匙4級(中等毒) 51500 1茶匙35克3級(低毒) 5015000 35350克2級(實際無毒)

22、500115000 3501050克1級(無毒) 15000 1050克四、急性毒性試驗的其他方法 1. 近似致死劑量的研究 在確定近似致死劑量的研究中，僅用6只動物，每只動物給以不同劑量的受試物，每個劑量間距為l.5倍。這種實驗設計可以得到近似最小致死劑量。利用該方法測試了87種化學物，發(fā)現(xiàn)83的化學物近似致死劑量都位于用經(jīng)典的急性毒性試驗方案所得到的LD50的正、負30范圍以內(nèi)。 另一種確定近似致死劑量的方法是先選擇一個劑量給予2只動物，24小時后，觀察動物的情況，然后再根據(jù)動物反應確定下一個給藥劑量；如果動物未死亡，以第一次給藥劑量的1.5倍劑量再次給予2只動物;如果動物死亡，則以第一次

23、給藥劑量的23再次給予2只動物。重復操作一直到確定最大非致死劑量和最小致死劑量。 2. 固定劑量法(fixed dose Procedure) 固定劑量法是由英國毒理學會1984年提出，OECD于1992年正式采用。這種方法與以往方法不同的是它不以動物死亡作為觀察終點，這個方法可以利用預先選定的或固定的一系列劑量染毒，從而觀察化學物的毒性反應來對化學物的毒性進行分類及分級。實驗選擇的劑量范圍是5、50和500mg/kg，而最高限量是2000mg/kg。首先用50mg/kg的受試物給予10只實驗動物(雌、雄各半)。如果存活率低于100，則再選擇一組動物給予5mg/kg的受試物。如果存活率仍低于1

24、00，則將該受試物歸于“高毒”類，反之歸于“有毒”類。如果給予50mg/kg受試物后存活率為100，但有毒性表現(xiàn)，則不需進一步試驗而將其歸于“有害”類。如果給予50mg/kg后存活率為100，而且沒有毒性表現(xiàn)，繼續(xù)給另外一組動物500mg/kg的受試物，如果存活率仍為100，而且沒有毒性表現(xiàn)時，則給予2000mg/kg受試物進行觀察，如果仍然100存活，將受試物歸于“無嚴重急性中毒的危險性”類。對于固定劑量法的結(jié)果評價可見表6-4。 OECD組織了對固定劑量法國際性的驗證(Van Den Heuvel l990)，11個國家的33個實驗室用固定劑量法和OECD(1981)規(guī)定的經(jīng)典急性毒性試驗

25、法進行實驗。實驗結(jié)果表明，毒性分級：比較了30個化合物的兩種試驗法所得結(jié)果，根據(jù)歐共體急性口服毒性的分級標準，516次固定劑量法試驗中，有414次實驗結(jié)果的毒性分級與LD50的分級相同，一致性為80.2。毒性反應：從毒性反應的類別、出現(xiàn)和持續(xù)的時間、消失的時間等方面分析，兩種試驗方法未顯出明顯差別。實驗所用動物數(shù)：LD50經(jīng)典急性毒性試驗，平均每個化合物用大鼠24.2只，固定劑量法平均用大鼠14.8只，明顯比前者少。表6-4 單次口服固定劑量法試驗結(jié)果的評價劑 量（mg/kg）試 驗 結(jié) 果存活率100% 100%存活，毒性表現(xiàn)明顯 100%存活，無明顯中毒表現(xiàn) 5.0 高毒LD5025mg/

26、kg 有毒 用50mgkg試驗 50.0 有毒或高毒 有害 用500mg/kg試驗 用5mg/kg試驗 LD502002000mg/kg 500.0 有毒或有害 LD502000mg/kg 用2000mg/kg試驗 用50mg/kg試驗 2000.0 用500mg/kg試驗 該化學物無嚴重急性中毒的危險性 3. 急性毒性分級法(acute toxic class method)傳統(tǒng)的急性毒性試驗方法以死亡為終點，而固定劑量法以明顯的毒性體征作終點。OECD(1996)急性經(jīng)口毒性分級法是分階段試驗法，每階段3只動物，根據(jù)死亡動物數(shù)，平均經(jīng)24階段即可判定急性毒性。所用動物少，仍可得到可接受的結(jié)

27、論，此法基于生物統(tǒng)計學，并經(jīng)過OECD組織的國際證實研究(Schlede等，1994)。此法應用于嚙齒類，首選大鼠，利用3個固定劑量25、200、2000mg/kg體重其中之一開始進行試驗，根據(jù)實驗結(jié)果：不需要進一步試驗進行分級；下一階段以相同劑量的另一種性別試驗；下一階段以較高或較低的劑量水平進行(從200mg/kg體重開始的程序見圖6-3)。于確認染毒動物存活后，進行下一個性別或下一個劑量的實驗。動物觀察14天，染毒當天觀察體征和死亡至少兩次，之后每日觀察一次。染毒前和每周測體重，所有動物均進行大體解剖，必要時進行組織病理學檢查。圖6-3 急性毒性分級法:以200mg/kg體重開始的試驗方

28、案 4. 上、下移動法(updown method)或階梯法，該法可用于觀察不同的終點，第二個動物接受化學物的劑量由第一只動物染毒后的反應決定，如果動物死亡，則下一個劑量降低；如果動物存活則下一個劑量增高，但是實驗需要選擇一個比較合適的劑量范圍，使得大部分的動物所接受的化學物劑量都會在真正的平均致死劑量左右。如果劑量范圍過大，則需要有更多的動物來進行觀察。對于該法進行改進以后，上、下移動法則只需要69只動物。Lipnick等(1995)比較了上下法、固定劑量法和經(jīng)典LD50法，根據(jù)EEC分級系統(tǒng)對化學品急性毒性分級，上下法和經(jīng)典法一致性為2325，上下法與固定劑量法一致性為1620。上下法需一

29、個性別610只動物，少于另兩種方法。 5. 金字塔法(“pyramiding”study) 利用本設計觀察動物急性毒性，動物用量最少。典型的金字塔法研究在整個觀察期內(nèi)都給動物受試物，一般是隔天染毒，但劑量是逐漸增加的。例如l、3、10、30、100、300、1000和3000mg/kg劑量系列或者是10、20、40、80、160、320、640和1280mg/kg劑量系列。給予動物的劑量一直按上述系列增加，直到一只動物或兩只動物死亡，或者達到劑量上限。對于藥物，非嚙齒類動物一般很少超過1000mg/kg，嚙齒類動物則很少超過3000mg/kg。金字塔法常用于非嚙齒類的動物的急性毒性研究。試驗組

30、4只，對照組4只均雌雄各半，共8只狗。試驗組于實驗第0、2、4、7、9天染毒，每次染毒后24h內(nèi)進行臨床體檢，包括觸診，行為觀察，脊髓反射檢查、瞳孔光反射、呼吸率，心電圖、直腸溫度、臨床實驗室檢查，于實驗第10天處死試驗組動物，并進行尸體解剖。 通過金字塔研究獲得的資料可以得到三種結(jié)論：如果沒有動物死亡，則最小致死劑量和LD50均大于極限劑量或?qū)嶒炈米罡邉┝俊Ｈ绻袆游锼烙谕粍┝浚瑒tLD50和最小致死劑量在實驗所用最后兩個劑量之間。如果一只動物死于某一個劑量，而另一只死于高一個劑量，則最小致死劑量位于出現(xiàn)第一只動物死亡的劑量與前一個劑量之間，LD50則位于出現(xiàn)第一只動物死亡的劑量與所有動

31、物死亡的劑量之間。此法的缺點為：此法得不到死亡曲線，也無法計算LD50；本法無法確定遲發(fā)的死亡，比如，第二次給藥后動物出現(xiàn)死亡，則無法確定是由于第一次給藥引起的遲發(fā)死亡，還是第二次給藥引起的死亡；對于有些半衰期特別長的化學物，由于蓄積作用可能會導致得到的急性致死劑量偏低，而由于適應性的存在，可使得到的急性致死劑量偏高。 6. 限量試驗 如受試物的毒性很低，可用限量試驗。一般嚙齒類(大鼠或小鼠)20只，也有用10只，雌雄各半。單次染毒劑量不必超過5gkg體重，也有認為劑量一般不超過2gkg體重，對于食品毒理學試驗限量可為15gkg體重。可能的結(jié)果為：如果實驗動物無死亡，結(jié)論是最小致死劑量(MLD

32、)大于該限量；如果死亡動物數(shù)低于50，結(jié)論是LD50大于限量；如果死亡動物數(shù)高于50，則應重新設計，進行常規(guī)的急性毒性試驗。根據(jù)二項分布，20只動物死亡5只，死亡百分率的95可信區(qū)間為949。因此，保守的觀點認為如果死亡動物數(shù)為5只或5只以下，結(jié)論是LD50大于限量；如死亡為6只或6只以上，即應重新設計試驗。用10只大鼠或小鼠進行試驗，如無死亡或死亡動物數(shù)僅為1只，才可認為LD50大于限量。 7. 急性系統(tǒng)毒性試驗 此試驗的設計是為了更全面地確定藥物的急性毒性。共有3種，即最低急性毒性試驗、完全急性毒性試驗和補充的急性毒性試驗。 在劑量設計上應注意，一般設3個劑量組和1個溶劑對照組。最高劑量應

33、有明顯的毒性(包括死亡)，但不需要使全部動物死亡。如果受試物毒性很低可僅設1個限量組和1個對照組。每組10只大鼠或小鼠，雌雄各半。最高劑量超過3gkg體重幾乎不會得到更多的毒性資料，最高劑量不應大于人臨床擬用劑量的100300倍，劑量間距應較大(如310倍)。 最低急性毒性試驗：在染毒當天(0天)測體重后染毒，染毒后多次(如每小時1次，共4次)觀察臨床體征，此后每天1次觀察體征和死亡率，于第7天和第14天測體重，第14天處死。對觀察期死亡和試驗結(jié)束處死的動物進行尸體解剖。 完全急性毒性試驗：目的是發(fā)現(xiàn)靶器官，每組20只大鼠或小鼠、雌雄各半，除最低急性毒性試驗的要求之外，于第0、1、2、3、4天

34、測體重和飼料消耗，于第3天和第14天各處死50動物進行尸體解剖、臨床實驗室檢查及收集器官(腦、心、肝、脾、腎、胃、胸腺、睪丸)進行組織病理學檢查。補充急性毒性試驗較少進行，主要是有特殊的目的，如毒物動力學研究、靶器官毒性的特殊研究等。上述三種急性系統(tǒng)毒性可能得到的毒性資料見表6-5。表6-5 急性系統(tǒng)毒性試驗可得到的資料(Gad，1995)致死死亡率LD50及其可信限致死曲線的形狀和斜率最大非致死劑量或最小致死劑量，以LD01估計死亡時間臨床體征發(fā)生和恢復時間急性LOAEL和NOAEL瀕死體征或非瀕死體征特異的或一般的毒效應劑量反應曲線與致死曲線的間隔體重改變體重下降或增長降低恢復飼料消耗改變

35、死亡和存活動物體重變化靶器官鑒定尸體解剖組織學檢查臨床化學和血液學改變特定的功能試驗免疫功能神經(jīng)肌肉篩查行為篩查毒物動力學不同染毒途徑的毒性差別受試物血漿濃度，曲線下面積、分布體積，半衰期受試物代謝譜在關(guān)鍵器官的分布血漿濃度與臨床體征發(fā)生的關(guān)系第二節(jié) 亞慢性和慢性毒性試驗 急性毒性試驗主要是研究外源化學物急性毒作用的特征和上限參數(shù)，即LD50，并據(jù)此可進行急性毒性分級。由于人體接觸外源化學物往往是長期的反復的接觸，利用急性毒性試驗的資料難以預測慢性毒性。這是因為：外源化學物在長期重復染毒時可產(chǎn)生與急性毒性試驗完全不同的毒作用。如苯急性中毒引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制，而長期反復接觸可引起粒細胞缺乏及白

36、血病。隨著動物的衰老，有些因素如組織易感性改變、代謝和生理功能的改變，以及自發(fā)性疾病等均可影響毒作用的性質(zhì)和程度。某些重要的疾病例如心臟病、慢性腎衰、腫瘤等均與年齡的增長有關(guān)。基于上述原因，進一步研究外源化學物的慢性毒性是很有必要的； 毒理學動物試驗按染毒期限可分為四種，即急性、亞急性、亞慢性和慢性毒性試驗，后三種可統(tǒng)稱為重復染毒毒性試驗。急性毒性試驗和慢性毒性試驗分別代表了人一次染毒和長期反復染毒這兩種暴露特征的毒性試驗方法。由于慢性毒性試驗耗費大量的人力、物力和時間，亞急性、亞慢性毒性試驗就具有預備或篩選試驗的性質(zhì)。當外源化學物在亞急性、亞慢性毒性試驗中有嚴重的毒作用時，此受試物就應考慮放

37、棄，只有在必要時才進行慢性毒性試驗。Parkinson等(1995)報告117種藥品狗亞慢性(90天)和慢性(24月)毒性試驗結(jié)果與大鼠(短期或長期毒性試驗)的結(jié)果比較，幾乎沒有發(fā)現(xiàn)新的毒性資料。因此，Parkinson等認為，動物毒性試驗長于6個月是沒有必要的，除非是研究致癌作用。這與Lumley等(1985)的報告及日本Igarashi(1993)對90個藥品的比較研究結(jié)果相似。WeiI等(1969)報告，112種受試物中，大鼠染毒90天后才出現(xiàn)毒性效應的只有3種(占2.5)，其他受試物均在90天內(nèi)已出現(xiàn)毒性效應，故認為大鼠90天毒性試驗即可確定受試物的未觀察到有害作用水平(NOAEL)。

38、盡管還有爭論，亞慢性毒性試驗(特別是90天亞慢性試驗)已成為比較常用的重復染毒毒性試驗；而從科學上和經(jīng)濟上考慮，慢性毒性試驗就傾向于和致癌試驗合并進行。 由于亞慢性毒性試驗和慢性毒性試驗在實驗設計和方法上較相似，故一并介紹。一、亞慢性和慢性毒性試驗的概念和目的 亞慢性毒性(subchronic toxicity)是指實驗動物連續(xù)(通常13個月)重復染毒外源化學物所引起的毒性效應；慢性毒性(chronic toxiciy)是指實驗動物長期染毒外源化學物所引起的毒性效應。 亞慢性和慢性毒性試驗的目的： 1. 確定受試物亞慢性和慢性毒性的效應譜，對在急性及亞急性毒性試驗中發(fā)現(xiàn)的毒作用提供新的信息，并

39、發(fā)現(xiàn)在急性及亞急性毒性試驗中未發(fā)現(xiàn)的毒作用； 2. 研究受試物亞慢性和慢性毒作用的靶器官； 3. 研究受試物亞慢性和慢性毒性劑量-反應(效應)關(guān)系，確定其觀察到有害作用的最低劑量(LOAEL)和未觀察到有害作用的劑量(NOAEL)，提出此受試物的安全限量參考值； 4. 研究受試物亞慢性和慢性毒性損害的可逆性； 5. 亞慢性毒性試驗為慢性毒性試驗的劑量設計及觀察指標選擇提供依據(jù)； 6. 確定不同動物物種對受試物亞慢性和慢性毒效應的差異，為將毒性研究結(jié)果外推到人提供依據(jù)。二、亞慢性和慢性毒性試驗方法 1. 實驗動物選擇和染毒期限 亞慢性和慢性毒性試驗一般選擇兩種實驗動物。一種是嚙齒類，一種是非嚙齒

40、類，常用大鼠和狗。選擇兩種實驗動物是為了降低外源化學物對不同物種動物的毒作用特點不同所造成的將實驗結(jié)果外推到人的偏差。在亞慢性經(jīng)皮毒性試驗時，也可考慮用兔或脈鼠。 一般情況下，亞慢性和慢性試驗選用雌雄兩種性別，如某種藥物臨床上只用于一種性別，此時可選用單性別的動物。慢性毒性試驗的目的是使實驗動物壽命的大部分時間染毒該受試物，因此在生命的早期開始染毒是很重要的，美國FDA要求嚙齒類動物在研究開始時應小于6周齡。 同樣的染毒期限對不同的試驗動物，其意義不同。一般地講，慢性毒性試驗對哺乳類應為兩年的時間，對嚙齒類相當于終生染毒，但對兔只相當于生命期的36，狗為20，見表6-6。表6-6 動物研究期限

41、相當于壽命期()和人染毒的時間物種研究期限(月)相當于壽命期()研究期限(月)相當于人(月)13612241361224大鼠4.112.025.049.099.0 34 101202 404 808兔1.44.59.018.036.0 12 36 72 145 289狗0.822.54.99.820.06.5 20 40 81162豬0.822.54.99.820.06.5 20 40 81162猴0.551.6 3.36.613.04.5 13 27 61107 慢性毒性實驗的期限應依受試物的具體要求和實驗動物的物種而定，工業(yè)毒理學要求6個月，環(huán)境毒理學和食品毒理學要求一年以上，OECD要求

42、慢性毒性試驗大鼠染毒期限至少一年。如慢性毒性試驗與致癌試驗結(jié)合進行則染毒期限最好接近或等于動物的預期壽命。 在藥物臨床前毒性研究中，長期毒性試驗的期限主要取決于臨床擬用藥的期限(見表6-7)。最近，各種規(guī)范對染毒期限的要求也在逐漸趨向于縮短，如ICH(1998)規(guī)定嚙齒類臨床前長期毒性試驗為6個月，非嚙齒類為9個月。但是，一般來說至少有兩種器官(眼和心臟)和一種嚴重的疾病(癌)需要進行長期染毒才能有明顯的毒效應。此外，還發(fā)現(xiàn)如給嚙齒類動物正常飼料量的7080，其壽命可延長3540個月，故正常的生命周期有待進一步確定。表6-7 臨床前研究動物長期毒性試驗的期限臨床用藥時間 動物染毒期限 最多3次

43、 2 周 10天 1個月 1個月 3個月 未限制 1年(美國)，6個月(歐洲及日本) 在用非嚙齒類(狗，猴等)進行慢性毒性試驗時，染毒期限常不能持續(xù)整個生命期，仔細研究受試物的動力學和代謝狀況可彌補染毒期限的不足(如試驗終點不是致癌作用)。如果在穩(wěn)態(tài)動力學建立之后繼續(xù)較長時間的染毒，從臨床表現(xiàn)上或由間斷處死動物的病理變化未見到毒性作用的增強，則可部分代替全壽命期試驗，并使實驗結(jié)果的可信性增加。 2. 染毒途徑 外來化合物的染毒途徑，應當盡量模擬人類接觸受試化學物質(zhì)的方式(途徑)，并且亞慢性與慢性毒作用研究的染毒途徑應當一致。亞慢性和慢性毒性試驗常用經(jīng)胃腸道、經(jīng)呼吸道、經(jīng)皮膚染毒三種途徑，藥物臨

44、床前毒性試驗中，動物染毒途徑應盡可能與人的用藥途徑一致。經(jīng)胃腸道染毒毒物最好采用喂飼法，即將受試物與食物或飲水混勻，使實驗動物自然攝入。如果受試化學物質(zhì)有異味或易水解時，也可以用灌胃方式染毒。應注意對揮發(fā)性受試物及飼料粉塵的影響，盡量減少實驗人員及動物受污染的危險性。當用狗或猴進行長期實驗時，不常采用喂飼染毒，因浪費量太大，通常采用膠囊或插胃管染毒。 經(jīng)呼吸道吸入染毒，每天吸入時期依實驗要求而定，亞慢性毒性研究在工業(yè)毒理學可14小時不等，環(huán)境毒理學可為46小時。在慢性毒性研究中，工業(yè)毒理學要求每天吸入46小時，環(huán)境毒理學一般要求每天吸入8小時。凡需要在吸入期間喂食、喂水時，要注意防止受試化學物

45、質(zhì)污染食物、飲水及食具。 經(jīng)皮染毒的去毛部位面積一般不大于動物體表總面積的1015，大鼠約為2050cm2，每次染毒46小時，應防止動物舔食。 而且，為保證受試物在動物體內(nèi)濃度的穩(wěn)定，每天應在相同的時間及實驗室條件下染毒。每周至少染毒67天，有研究表明，相同毒物在相同劑量的情況下，每周5天染毒與7天染毒的毒性反應是不一致的。 按預定劑量水平，吸入染毒氣體和蒸氣以mg/m3表示其濃度(mgm3=（MW·ppm）22.4)，摻入飼料或飲水以或ppm(mg/kg，mg/L)表示其濃度。必須每周或每兩周調(diào)整飼料中受試物的濃度以維持恒定的劑量水平，因為單位體重的飼料消耗量隨動物年齡的增長而下降

46、。如在嚙齒類試驗中，從離乳到成年過程中飼料中受試物濃度保持恒定不變，則在整個實驗過程中的染毒劑量約減少至40。這可影響毒性反應的嚴重程度，并可能作出有耐受性的錯誤判斷。 3. 試驗分組和劑量設計 在亞慢性和慢性毒性試驗中，為了要得出明確的劑量-反應關(guān)系，一般至少應設3個劑量組和1個陰性(溶劑)對照組。高劑量組應能引起較為明顯的毒性，中劑量組應該為觀察到有害作用的最低劑量(LOAEL)，低劑量組應相當于未觀察到有害作用劑量(NOAEL)。亞慢性毒性試驗高劑量的選擇，可以參考兩個數(shù)值，一種是以急性毒性的閾劑量為該受試物的亞慢性毒作用的最高劑量，另一種是取受試物LD50的12015為最高劑量。高、中

47、、低3個劑量間組距以310倍為宜，最低不小于2倍。慢性毒性試驗劑量選擇，高劑量可以選擇亞慢性毒效應的NOAEL或其1512為慢性毒性研究的最高劑量；各劑量組間距以差25倍為宜，最低不小于2倍。慢性毒性試驗劑量間距應小于亞慢性毒性試驗。劑量選擇的一般步驟是從急性(單劑量)毒性試驗14天毒性試驗90天毒性試驗的程序，直接從急性毒性資料來確定慢性毒性試驗的劑量經(jīng)常有困難，可能高估或低估受試物的慢性毒性。如對劑量選擇沒有把握，則可在某項試驗中多設幾個劑量組，這要比重復整個試驗費用低得多。同時，如有性別差異，不同性別可選擇不同的劑量。 對于藥物而言，可用人擬用劑量的倍數(shù)來設計試驗劑量，亞慢性毒性試驗大鼠

48、可用人擬用劑量10、30和100倍，非嚙齒類可用5、15、50倍；慢性毒性試驗大鼠可用人擬用劑量5、15和50倍，非嚙齒類可用3、9、30倍(Traina,1983)。ICH對于藥品慢性毒性和致癌性研究的最高劑量已取得一致的意見，但對于農(nóng)藥、工業(yè)化學品、食品添加劑和其他非藥用化學物試驗劑量的選擇還有爭論。美國ILSI風險科學研究所由代表美國、加拿大、歐洲和日本的科學界、工業(yè)及政府的科學家組成關(guān)于嚙齒類慢性毒性試驗劑量選擇工作組，該工作組(1997)鼓勵不再唯一依照MTD原則(MTD主要由體重和組織病理學來確定)，并提出選擇最高劑量和較低劑量的如下5個原則。 根據(jù)毒理學原理，慢性毒性試驗劑量選擇

49、應使慢性毒性試驗的敏感性增加到最大程度。在合理的劑量范圍內(nèi)，提高劑量可能增加檢測毒效應的能力。在選擇劑量時，應考慮適當?shù)脑囼炘O計、作用機制及其他有關(guān)的資料。中、低劑量的選擇不應該僅按最高劑量的某個固定的比例，而應考慮毒作用的機制和模式、毒動學、以及下述的其他因素。而且中、低劑量的選擇應盡可能顯示劑量反應曲線的形狀，并且考慮人體的暴露水平。選擇劑量時應考慮之前進行的各項研究所評價的終點如組織病理學、毒動學、細胞增殖和凋亡、生理功能、臨床化學、血液學和尿分析、器官重量、體重等。應考慮理化因素、生物利用度、在飼料或飲水中的適口性等。 所選動物亞慢性毒性試驗一般大鼠68周齡(體重80100g)，每組大

50、鼠不少于20只；狗812月齡，每組68只，雌雄各半。于慢性毒性試驗中動物的年齡應低于亞慢性毒性試驗，大鼠應剛離乳，體重在5070克為宜，一般要求每組40只，雌雄各半。必須設置陰性對照組，必要時動物數(shù)可以再多些，以排除其他因素和自然死亡的干擾。以狗為實驗動物時，每個劑量組應各8只或以上，雌雄各半。在12年的長期實驗中，必須考慮某些意外事故，需增添額外的動物。如對照組大鼠在2年期間自然死亡可使動物數(shù)減少20。Homburer(1983)主張對照組的動物數(shù)等于每個染毒組的動物數(shù)乘以染毒組組數(shù)的平方根，如每組40只大鼠，共4個染毒組，則對照組應有80只大鼠，即40×只。 如果設計要求在染毒受

51、試物期間處死一部分動物，進行某些指標動態(tài)觀察(如病理組織學檢查或某些臟器的生化檢查)，則在試驗開始時應相應增加實驗動物數(shù)。 4. 觀察指標外來化學物亞慢性毒作用研究對毒性效應檢測流程圖見圖6-4。 圖6-4 亞慢性、慢性毒性試驗檢測各種毒性終點的流程圖 (1) 一般性指標 在實驗過程中，應仔細觀察動物的外觀(體表通道和毛色等)，社會行為(躁動、冷漠、探究活動)；刺激性(好斗等)及對周圍環(huán)境、食物、水的興趣，這些信息如單獨一項無太多的意義，但結(jié)合起來就有可能揭示出未觀察到毒性癥狀前的潛在毒性效應。 在亞慢性及慢性毒性研究中，動物體重是一個比較重要且比較敏感的指標，反映了受試物對實驗動物的生長發(fā)育

52、及一般狀態(tài)的影響。與對照組處于相同的喂飼條件下，如果受試組動物體重增長比對照組低10，就可以認為是由受試化學物所引起的毒效應。如果各劑量組體重增長改變有劑量-反應關(guān)系，就可以肯定這是一種綜合毒性效應。一般在亞慢性毒性試驗應每周測體重一次，對慢性毒性試驗，最初13周每周測體重一次，以后如動物健康狀況無明顯改變可每2周或每月測體重一次。 對各劑量組和對照組動物同期體重的統(tǒng)計和比較可有多種方式，可以用體重直接統(tǒng)計，也可用體重的增長重量，或用體重百分增長率(以染毒開始時體重為100)，進行統(tǒng)計。 除體重外，還應記錄動物的飼料消耗，并計算食物利用率(實驗動物每食入100克飼料所增長的體重克數(shù))。比較各染毒組與對照組實驗動物的食物利用率，有助于分析受試物對實驗動物的生物學效應。食物利用率可用于鑒別嚙齒類動物體重降低或增長減緩是由于受試物不適口，還是真正的毒作用。 (2) 實驗室檢查 在慢性毒性試驗中，必須評價受試物對各器官系統(tǒng)的功能影響。血、尿等體液的實驗室檢查的目的是發(fā)現(xiàn)受試物所致的器官功能紊亂。最主要的是評價解毒和排泄器官(即肝和腎)，因為在這兩個器官染毒受試物的濃度較高，另一個重要的靶器官是血液。血液學檢查包括紅細胞計數(shù)、血紅蛋白含量、白細胞計數(shù)及分類、血小板計數(shù)、凝血時間等。血液生化檢查主要為血清天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、