1、犬瘟熱、犬細小病毒二重 TaqMan MGB熒光定量 PCR檢測方法河南省地方標準編制說明犬瘟熱( Canine distemper， CD )是世界范圍內廣泛發 生的一種犬的急性、高接觸性傳染病，其病原為犬瘟熱病 毒(CDV )，于 1905 年首次報道，其自然宿主包括大部分 的食肉目動物。該病傳染性強，易繼發細菌和其他病毒的 混合感染或繼發感染，發病率高達80%，康復后易出現麻痹、抽搐、癲癇樣發作等后遺癥。該病無特效藥物治療， 成為危害養犬業的主要疫病之一。 CDV 屬于副粘病毒科麻 疹病毒屬、負鏈單股不分節的 RNA 病毒，基因組全長為 15 616bp。病毒的蛋白主要有核衣殼蛋白 (

2、Nucleocapsid protein, N) 、磷蛋白 (Phosphoprotein, P) 、基質膜蛋白 ( Matrix protein, M) 、 融 合 蛋 白 ( Fusion protein, F) 、 附 著 或 血 凝 蛋 白 (Attachment protein or Hemagglutinin protein, H) 、大蛋白 ( the large virus specificied RNA directed RNA polymerase protein, L) 6 種，編碼基因在基因組的位置從它的3'端到 5'端依次為 3c 端前導序列、 N、P

3、、M 、F、H 和 L 基因以及 5c 端前導序列，其中 H 蛋白是 CDV 與細胞受體結合的蛋 白，并決定著病毒感染的細胞嗜性， H 蛋白基因常作為診斷 檢測所用的靶基因。犬細小病毒病是由犬細小病毒(Canine parvovirus ，CPV)引起犬的一種急性接觸性傳染病，病犬主要以劇烈嘔 吐、出血性腸炎、嚴重脫水、白細胞減少和心肌炎等為主 要特征，犬細小病毒于 1978 年從患有腸炎的病犬體內首次 分離獲得，幼犬對 CPV 的易感性較高，并可以發生心肌 炎。發病率高達 50%100% ，病死率為 10%50% ，對養犬 業、犬科經濟動物養殖和犬科野生動物危害巨大。 CPV 是 細小病毒科

4、、細小病毒屬成員，具有細小病毒屬病毒典型 形態和結構。基因組為單股 DNA ， 病毒粒子有 VP1、 VP2 和 VP3 三種多肽，其中 VP2 為衣殼蛋白主要成分，為主要 抗原基因，常作為檢測 CPV 的主要靶基因。臨床上 CDV 、CPV 多混合感染，是當前嚴重危害犬、 貓健康的主要疫病，防控難度大，對養犬業危害嚴重，每 年均造成巨大的經濟損失。由于二者引起的臨床癥狀相 似，單憑臨床癥狀和剖檢病變難以確診，因此必須借助實 驗室檢測進行確診。目前已有的 CDV/CPV 的檢測方法主要 有病毒分離鑒定、免疫熒光法 ( IF) 、免疫組織化學技術 ( IHT) 、免疫電鏡法 ( IEM) 、血凝

5、 / 血凝抑制試驗( HA / HI )、中和試驗和酶聯免疫吸附試驗( ELISA )等方法，這 些方法存在操作繁瑣、技術要求和試驗條件要求高、試驗 周期長等缺點，難以滿足快速、大量檢測的需要，并且是 針對某一種病毒的單一 PCR 或 FQ-PCR 檢測方法。因此急 需建立一種快速、高效、特異、敏感的檢測方法，且同時對 CDV 和 CPV 兩種病毒核酸進行快速鑒別檢測。2013 年 5 月，農業部下發了關于進一步加強犬和貓 產地檢疫監管工作的通知（農醫發2013 16 號），要求對所有跨省調運的犬、貓進行 CDV 、CPV 實驗室病原學 檢測，實驗室檢測結果作為出具檢疫證明和是否許可調運 的重

6、要依據。單就河南省而言，每年需要對CDV 、CPV 檢測量至少在 5000萬頭份以上，這要求實驗室必須對CDV 、CPV 進行快速、準確、大量檢測。目前國內外已報道的 CDV 、CPV 病原學快速檢測方法有針對該病原的單一 PCR 或 FQ-PCR 檢測方法，但未見有針對 CDV H 基因和 CPV VP2 基因設計了特異性引物對和 TaqMan MGB 探針建立 CDV/CPV 熒光定量 PCR 方法。本標準所建立的犬瘟熱、犬 細小病毒二重 TaqMan MGB 熒光定量 PCR 檢測方法反應可 在 1h2h 內完成，減少了電泳環節的時間和污染， TaqMan MGB 探針能區分目的基因中

7、1 個堿基的差別，因此該方法 具有快速、特異、敏感、高通量等優點，能滿足大批量、 快速診斷 CDV 、CPV 的要求，對及早快速確診 CDV 、CPV 病，有效防控疫病的發生，防止病原傳播擴散，維護養犬 業、經濟動物養殖業和寵物養殖的健康發展，保障公共衛 生安全和社會穩定，保護寵物飼養者權益等具有重要意 義。該技術標準具有實用性和可操作性，若采納、頒布實 行后，將為我省 CDV 、CPV 的臨床快速確診和跨省調運工作提供技術保障。一、工作簡況，包括任務來源、起草單位、主要工作 過程、主要起草人及其所做的工作：1、任務來源 根據河南省質量技術監督局文件河南省質量技術監 督局關于下達 2016 年

8、第一批河南省地方標準制修訂計劃的 通知（豫質監標發 2016 127 號）的要求，由河南省動 物疫病預防控制中心負責對河南省地方標準犬瘟熱、犬 細小病毒二重 TaqMan MGB 熒光定量 PCR 檢測方法的起 草、制定工作。2、起草單位：河南省動物疫病預防控制中心。3、主要工作過程標準的編制過程分三個階段進行： 第一階段：犬瘟熱、犬細小病毒二重 TaqMan MGB 熒 光定量 PCR 檢測方法的建立。1、引物設計由河南省動物疫病預防控制中心經大量比對 GenBank 中 CDV 、 CPV 基因序列，選取 CDV H 基因和 CPV VP2 基 因高度保守且特異性基因序列為模板，針對 CD

9、V H 基因設 計 1 對特異性引物和 1 條標記為 FAM 的 TaqMan MGB 探 針，針對 CPV VP2 基因設計 1 對 CPV 特異性引物和 1 條標 記為 VIC 的 TaqMan MGB 探針，其中 CDV 探針報告基團 為 FAM ，CPV 探針報告基團為 VIC ，淬滅基團均為 None。2、二重 TaqMan MGB FQ-PCR 檢測程序參數的優化 利用實驗室保存的樣品，根據引物的 Tm 值、擴增片段 的大小、 PCR 聚合酶的性質，優化了 CDV 、CPV 二重 FQ- PCR 方法的退火溫度、循環數、 CT 值等參數，確定了 FQ- PCR 方法檢測程序，包括所

10、使用的試劑規格、儀器參數 等。3. 確定建立檢測方法的靈敏性、特異性及重復性。對疑似 CDV 、 CPV 感染的患犬樣品提取核酸， FQ- PCR 擴增的陽性樣品再進行普通 PCR 擴增，對陽性擴增產 物分別克隆入 pGEM-T Easy 載體中，篩選陽性重組質粒進 行測序，制備含 CDV H 基因和 CPV VP2 基因的重組質粒作 為標準品，將標準品以 1.0 ×1001.0 ×109 倍倍比稀釋作為模 板擴增，建立標準曲線，與普通 CDV PCR 方法、普通 CPV PCR 方法比較驗證該方法的敏感性；采用 FQ-PCR 方法擴 增 I 型和 II 型犬腺病毒 （CA

11、V-1 、 CAV-2） 、狂犬病病毒 （ RV ）、犬副流感病毒（ CPIV ）、弓形蟲、犬傳染性肝炎 （ CIHV ）、 犬 鉤 端 螺 旋 體 ， 驗 證 該 方 法 的 特 異 性 ； 對 1.0 ×1061.0 ×103 個拷貝 /L 的標準品進行 3 次重復測定， 檢測其穩定性和重復性；將該方法檢測出的陽性樣品進行 目的基因的克隆測序和病毒分離試驗，驗證所建立方法的 準確性。試驗結果證明所建立的犬瘟熱病毒實時熒光定量PCR 檢測方法特異性好，敏感性強，可以作為確診CDV 、CPV 感染的實驗室快速檢測方法。4、用建立的犬瘟熱、犬細小病毒二重TaqMan MGB

12、熒光定量 PCR 檢測方法檢測臨床樣品，并對部分結果進行測 序，以驗證該方法的實用性。第二階段：犬瘟熱、犬細小病毒二重 TaqMan MGB 熒 光定量 PCR 檢測方法的應用實驗 。本階段主要進 行 犬瘟熱、犬 細 小 病 毒 二 重 TaqMan MGB 熒光定量 PCR 檢測試劑盒的組裝及在河南省范圍內的 應用實驗。為了進一步驗證所建立的診斷方法的特異性、 敏感性和實用性，由河南省動物疫病預防控制中心組裝犬 瘟熱、犬細小病毒二重 TaqMan MGB 熒光定量 PCR 檢測方 法試劑盒，并由河南省 18 個省轄市和 2 個省直管試點縣 （市）動物疫病預防控制中心進行臨床樣品檢測應用試 驗

13、。共對來自全國 7 個?。ㄖ饕獦悠穪碜院幽鲜。┕灿?896 份疑似 CDV 感染樣品進行了應用檢測；對其中 12 份樣品 進行了病毒分離鑒定和陽性樣品的克隆測序對照試驗。 18 個省轄市和 2 個省直管試點縣（市）動物疫病預防控制中心 參與實驗人員對該診斷方法包括試劑盒的組裝、反應條件 的優化等提出了不同的修改意見和建議；對該方法的準確 性、特異性、敏感性等進行了充分實驗并得出了肯定意 見。第三階段：標準的起草、修改與制定。根據以上實驗資料及所有參與實驗人員意見，在系統 統計、科學分析的基礎上，組織有關專家起草了犬瘟 熱、犬細小病毒實時熒光定量 PCR 檢測方法河南省地方 標準草案，規定了診斷

14、范圍、樣品采集及處理方法、實驗 操作方法、結果判定標準等，并將標準草案送有關獸醫專 家征求意見，按照專家意見對標準草案進行多次修改完 善，制定了當前的犬瘟熱、犬細小病毒二重 TaqMan MGB 熒光定量 PCR 檢測方法的建立（草案） 。4、主要起草人及其所做的工作 項目主持人：閆若潛，河南省動物疫病預防控制中 心，主持本項地方標準的制定與編寫。參加者：班付國：河南省動物疫病預防控制中心，負責標準的 制定和試驗技術推廣。王華俊：河南省動物疫病預防控制中心，負責標準的 制定和檢測方法的優化。方先珍：河南省動物疫病預防控制中心，負責標準的 制定、校訂和檢測方法的建立。劉梅芬：河南省動物疫病預防控

15、制中心，負責標準的 制定和檢測方法的優化。趙明軍：河南省動物疫病預防控制中心，負責標準的制定、校訂和優化張代寶：鄭州市動物疫病預防控制中心，負責標準的 推廣。二、地方標準編制原則和確定地方標準主要內容（如技 術指標、參數、公式、性能要求、試驗方法、檢驗規則 等）的論據（包括試驗、統計數據） ：按照標準編制的有關要求，以河南省動物疫病預防控 制中心為主要組織者，以河南省 18 個省轄市和 2 個省直管 試點縣（市）動物疫病預防控制中心為主要參與單位，通 過對來自 7 個省的大量臨床疑似樣品進行檢測應用，結合臨 床癥狀及與其它方法的對照試驗，同時經征求國內相關專 家意見，對獲取的實驗數據進行科學統

16、計分析，力求標準 客觀公正、真實科學、易于操作、便于推廣，體現先進 性，增強其指導性。（一）引物設計 由河南省動物疫病預防控制中心經大量比對 GenBank 中 CDV 、 CPV 基因序列，因高度保守且特異性基因序列 ,選 取 CDV H 基因和 CPV VP2 基為模板，針對 CDV H 基因設 計 1 對特異性引物和 1 條 5' 端標記為 FAM 的 TaqMan MGB 探針，針對 CPV VP2 基因設計 1 對 CPV 特異性引物和 TaqMan MGB 探針，其中 CDV 探針報告基團為 FAM ，CPV 探針報告基團為 VIC ，淬滅基團均為 None，在國內首次建

17、立了犬瘟熱、犬細小病毒二重 TaqMan MGB 熒光定量 PCR 檢測方法的建立，該方法快速、特異、靈敏，可用于臨床 上快速檢測 CDV 、 CPV，適合于大規模群體檢測，特制定 本標準。（二）標準方法的特異性 利用本標準制定的犬瘟熱病毒實時熒光定量PCR檢測方法擴增 CDV 、CPV 、 I型和 II型犬腺病毒 （CAV-1 、 CA V-2） 、 狂犬病病毒（ RV）、犬副流感病毒（ CPIV ）、弓形蟲、犬傳 染性肝炎（ CIHV ）、犬鉤端螺旋體，驗證該方法的特異性。 結果顯示，該方法能特異性的擴增出 CDV 、 CPV標準曲 線，但對 CAV-1 、 CAV-2 、 RV 、 CP

18、IV 、 CIHV 、弓形蟲、犬 鉤端螺旋體等病原擴增不出任何曲線，說明標準所規定的 診斷方法特異性好。整個實驗過程約需1 2h，操作步驟按常規 FQ-PCR 方法進行，說明標準規定的方法快速、簡便， 易于臨床檢測應用及大范圍推廣。（三 ） 標準方法的敏感性對疑似 CDV 、CPV 感染的患犬樣品提取核酸， FQ-PCR 擴增的陽性樣品再進行普通 PCR 擴增，對陽性擴增產物分 別克隆入 pGEM-T Easy 載體中，篩選陽性重組質粒進行測 序，制備含 CDV H 基因和 CPV VP2 基因的重組質粒作為標 準品，將標準品以 1.0 ×1001.0 ×109 倍倍比稀釋

19、作為模板擴 增，建立標準曲線。FQ-PCR 擴增的陽性樣品再使用 559bp 大小的特異性引 物對進行 PCR 擴增，對 PCR 產物進行克隆測序，制備含 CDV H 基因的重組質粒作為標準品，將標準品以1.0 ×1001.0 ×109 倍倍比稀釋作為模板擴增，建立標準曲線。對采用 FQ-PCR 擴增出的 CDV 陽性樣品基因片段進行 克隆，以已知濃度的 pGEM-T easy 重組質粒溶液作標準 品， 10倍系列稀釋成每微升 1.0 ×1081.0 ×100拷貝為模板， 同時設空 pGEM-Teasy 質粒為陰性對照，用標準規定的方法 進行敏感性檢測。

20、結果該 FQ-PCR 方法對 CDV 、CPV 重組 質粒檢測的最低極限均為 10個拷貝 / L。說明標準規定的方 法敏感度好，陽性檢出率高，適用于臨床樣品檢測應用。（四）應用范圍利用建立的方法對 896 份犬眼分泌物、淚液、唾液、咽 喉拭子、糞便、肺臟、淋巴結樣品進行檢測實驗，結果表 明，本標準所建立的方法對所有樣品均能進行有效檢測。（五）臨床應用實驗對來自全國 7個省的 896 份疑似 CDV/CPV 感染樣品進 行了應用檢測實驗，共檢測出 CDV/CPV 陽性樣品 107 份， 檢測結果與臨床發病癥狀、病理剖檢變化及部分樣品的病 原分離培養結果等具有較高的符合率，說明標準規定的方 法可以

21、進行大范圍的推廣應用。三、主要試驗（驗證）的分析、綜述報告，技術經濟論證，預期的經濟效果：由 CDV/CPV 引起的犬瘟熱 / 犬細小病毒疫病對養犬業、 寵物飼養危害嚴重，當前，缺乏快速敏感的鑒別診斷 CDV/CPV 感染的方法。 FQ-PCR 診斷方法具有快速、特 異、敏感等優點，已在疫病病原學診斷中得到廣泛應用， 成為動物疫病病原學快速診斷方法之一。本標準所建立的 CDV/CPV FQ-PCR 方法快速、特異、敏感，對于臨床上 CDV/CPV 的快速診斷具有重要意義。該標準具有實用性和 可操作性，若采納、頒布實行后，可對 CDV/CPV 進行快速 準確的鑒別診斷，從而及早進行對癥治療，及時

22、控制疾 病，降低經濟損失，具有重要意義。四、采用國際標準和國外先進標準的程度，以及與國 際、國外同類標準水平的對比情況，或與測試的國外樣 品、樣機的有關數據比對：經大量比對 GenBank 中 CDV H 基因和 CPV VP2 基因 序列，選取 CDV H 基因和 CPV VP2 基因高度保守且具有型 特異性基因序列為模板，設計 CDV/CPV 特異性引物對和 TaqMan MGB 探針，經反復試驗驗證后，建立了 CDV/CPV FQ-PCR 檢測方法。用建立的 FQ-PCR 診斷方法對 I 型和 II 型犬腺病毒 (CAV-1 、 CAV-2)等 5 種對照病原體核酸、已知 的 CDV/CPV 感染樣品、健康犬眼分泌物和組織樣品等樣品 為對照進行特異性檢測，證明了方法的特異性。敏感性試 驗表明該方法最低檢測極限