1、土壤中反硝化細菌的分離、純化鄧曉娟 查美玲 曹娟芳（江西師范大學生命學院 南昌 330022）摘要：關鍵詞：反硝化細菌，反硝化作用，硝酸鹽Abstract:Key words:氮素是水體污染中的一類重要的污染物，對人體健康和環(huán)境有極大的危害。近幾十年來，規(guī)模日益擴大的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成水體中積累大量的魚類糞便、殘餌和死亡的動植物尸體，導致水體氮素含量嚴重超標，養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境遭到破壞，魚蝦病害頻發(fā)，最終造成巨大的經(jīng)濟損失。硝化作用由亞硝酸鹽細菌和硝酸鹽細菌將氨化合物氧化為亞硝酸鹽和硝酸鹽；反硝化作用也稱脫氮作用，由微生物在厭氧或微厭氧條件下將硝酸鹽還原成氧化亞氮或氮氣，因此，硝化作用與反硝化作用在維持

2、自然界氨的平衡及氮的正常循環(huán)中扮演著非常重要的作用。具有反硝化能力的細菌就目前所知分布于50多個屬，約有150余種，絕大部分屬于變形細菌綱(Proteobacteria)中的和簇群。反硝化細菌能將硝態(tài)氮或亞硝態(tài)氮還原成含氮氣體或氮氣，不過并不是所有的反硝化細菌都能進行完全的反硝化過程，編碼亞硝酸鹽還原酶的基因才是反硝化細菌的關鍵功能基因，在進行反硝化的分子生態(tài)學研究中也主要以nirS或nirK基因作為分子標記。傳統(tǒng)上認為反硝化作用只有在厭氧或缺氧條件下發(fā)生，但是在水處理過程中也觀察到好氧反硝化現(xiàn)象。盡管有人將好氧反硝化現(xiàn)象的發(fā)生歸因于微環(huán)境中的厭氧條件，但是目前已有相當數(shù)量的好氧反2、Pseu

3、domonas aeruginosal4,15、Pseudomonas stutzeri 13,16,17 、Alcaligenes sp18,19。 被分離并進行了深入研究，證實好氧反硝化細菌確實存在。本實驗擬從花圃土壤中分離純化反硝化細菌，對菌株進行初步鑒定，并對菌株的反硝化能力進行研究，旨在分離得到反硝化能力高的菌株，為實際應用提供依據(jù)。1 材料1.1培養(yǎng)基 富集培養(yǎng)基(即反硝化選擇性培養(yǎng)基)：硝酸鉀2g、硫酸鎂0.2g、磷酸氫鉀0.5g、酒石豫鉀鈉20g、蒸餾水1000ml；pH約7.2。分離培養(yǎng)基：在富集培養(yǎng)基中瓊脂即可。純化培養(yǎng)基：采用LB培養(yǎng)基。胰蛋白胨10g ,酵母提取物5g/

4、L， 氯化鈉10g,瓊脂粉15g,NaOH調pH到7.2，加蒸餾水至1L。1.2實驗試劑濃硫酸，水楊酸，硝酸鉀，無菌水，革蘭氏染液等。1.3實驗儀器培養(yǎng)箱，超凈工作臺，可見分光光度計，移液管，試管，錐形瓶等。2.方法2.1分離純化土樣1g加入到100ml的富集培養(yǎng)基中，30靜置密閉培養(yǎng)2d后，l0倍稀釋涂分離培養(yǎng)基平板，挑取菌落進行多次分離，單菌落再經(jīng)多次LB平板劃線純化，轉入斜面保存。2.2形態(tài)鑒定對所篩選到的菌株進行鑒定，通過顯微鏡下菌體形態(tài)觀察、革蘭氏染色的方法進行了菌株的初步鑒定等。2.3反硝化能力鑒定采用濃硫酸-水楊酸比色法測定88。在濃酸條件下，NO3 與水楊酸反應，生成硝基水楊酸

5、。生成的硝基水楊酸在堿性條件下（pH>12）呈黃色，最大吸收峰的波長為410nm，在一定范圍內，其顏色的深淺與含量成正比，可直接比色測定。250 mg/LNO3標準液：準確稱取經(jīng)110 烘至恒重的KNO3 0.4078 g，用水溶解，定容至1000 mL，此溶液中含 NO3 250 mg/L。 顯色劑：準確稱取10.0 g水楊酸，再緩慢加入200 mL濃硫酸，不斷攪拌至水楊酸全部溶解，儲于棕色瓶，在4 條件下保存，至少可穩(wěn)定一個月。將250 mg/L NO3 標準液分別配制25 mg/L 、50 mg/L 、100 mg/L 、125 mg/L、200 mg/L、250 mg/L 的NO

6、3溶液。分別取上述溶液100 L加入25 mL試管中，接著加入0.4 mL 顯色劑并搖勻，室溫放置20 min,緩慢加入2 M NaOH 9.5 mL，冷卻至室溫，于410 nm下測定吸光值，空白樣含100 L去離子水。以NO3 濃度為縱坐標，吸光度值為橫坐標作圖，即為標準曲線，其相關系數(shù)R2=0.9963（如圖2.1 所示）。準確吸取1 mL 培養(yǎng)液于1.5 mL離心管中，在6000 rpm、10 min條件下離心，準確吸取0.1 mL上清液于25 mL 試管中，再加入0.4 mL 顯色劑并搖勻，室溫放置20 min,緩慢加入2 M NaOH 9.5 mL，冷卻至室溫，于410 nm下測定吸

7、光值，空白樣含100 L去離子水，NO3 的濃度根據(jù)標準曲線進行計算，并計算樣品中實際NO3的含量。單位時間內NO3的去除率表示反硝化速率。3 結果分析3.1菌株的篩選經(jīng)過多次分離純化，得到三種菌落形態(tài)不同的菌株，分別命名為A、B、C。其中菌株A為深黃色，BC3.2反硝化能力速率測定NO3-(mg/l)2550100125200250OD值0.0530.1030.2120.2630.3290.563菌株時間1d后4d后6d后AOD值0.4010.3660.332反硝化速率BOD值0.4420.3820.372COD值0.3910.3240.1754.討論反硝化作用對于控制水體富營養(yǎng)化，處理污水和凈化水域有著極大的利用價值。目前已發(fā)現(xiàn)某些植物、真菌和細菌都具有反硝化作用。已知有50屬以上的微生物能夠進