1、胸腺肽類藥物對體外誘導ES細胞分化為T細胞的作用【摘要】【目的】研究目前臨床常用的增強細胞免疫功能的胸腺肽，胸腺5肽和胸腺素a -1在小鼠胚胎干細胞向T淋巴細胞分化過程中的作用。 【方法】借助小鼠胚胎干細胞(ESC)體外自然分化形成的類胚體(EB)中含有三胚 層細胞的獨特細胞環境,加入多種細胞因子和胸腺多肽,體外誘導小鼠ESC向T 淋巴細胞分化。利用流式細胞儀檢測在三種不同胸腺多肽的誘導下，不同時間點 的小鼠ESC來源的細胞表面CD3分子的表達水平。并在相應時間點通過RT-PCR檢測與T淋巴細胞發育密切相關的Notch信號分子的轉錄水平。【結果】在加入 胸腺肽和胸腺素a 1誘導的實驗組，均有細

2、胞表達CD3分子,CD3+細胞的百分比隨 誘導時間的增加而增多；而加入胸腺五肽的實驗組無CD3+田胞出現。加入胸腺 素a 1和胸腺肽的實驗組,有Notchl及其配體delta-like-1 和delta-like-4 的轉錄;而加入胸腺五肽的實驗組的細胞無Notch1及其配體轉錄。【結論】 胸腺素a 1或胸腺肽可能通過影響Notch1信號途徑支持ES細胞向T細胞分化，而胸 腺五肽無此作用。【關鍵詞】胚胎干細胞；T淋巴細胞；胸腺5肽；胸腺素a 1;胸腺肽Abstract:【Objective 】 To pare the effects of three thymicpolypeptides in

3、cluding thymopentin-5 (TP5), thymosin-alpha1 (T a -1) and thymopeptides on the thymopoiesis of mouse embry onic stem (ES) cells in vitro.【Method EBs were obtained from spontaneously differentiatedEScells and were in duced in to T lymphocytes in vitro by utilizi ng three different inducing media, whi

4、ch contain TP5, Ta -1, and thymopeptides,respectively. The n the expressi on of CD3 on these differe ntiated cells were an alyzed by flow cytometry at differe nt time poi nts. At the corresp onding time-po int, the tran scripti on levels of Notch sig nal molecules were also detected by RT-PCR.【Resul

5、ts 】 The results showedthat inducing systems containing either Ta -1 or thymopeptides promotedthe emerge nee of CD3+ cells duri ng the observatio n period, and the perce ntage of CD3+cells in creased with a Ion ger in ducti on period. However, we never found CD3+cells in the inducing system containi

6、ng TP5throughout the in duci ng period. And Notch 1 receptor and its liga nds, involvingDelta-like-1 and Delta-like-4, expressed in in due ing systems containing either T a -1 or thymopeptides. However, neither Notchl nor its ligands were detected in the in duci ng system containing TP-5 duri ng the

7、 observation period.【Conclusion 】 T a -1 and thymopeptides may play arole in promoting T cells differentiation from ES cells by Notch1 signal pathway, while TP-5 may not.Key words: embry onic stem (ES) cells; T cells; thymope nti n-5(TP5); thymosin a -1 (T a 1); thymopeptides參與特異性免疫應答的T淋巴細胞來源于骨髓多能造血

8、干細胞，經過一 系列高度重組和復雜的過程分化成為成熟細胞。這一過程除了需要胸腺基質細胞 的輔助外,包括多種胸腺多肽分子和細胞因子在內的胸腺體液微環境也發揮至關 重要的作用。胸腺基質細胞和胸腺多肽都通過影響多種信號途發揮作用，近年來的研究結果顯示,其中最重要的是Notch信號途徑。胚胎干細胞(embryonic stem cells,ESC)又稱多能干細胞,是由受孕35 d的囊胚內細胞團經體外抑制分化培 養所得的一種高度未分化細胞，在適宜的條件下，可誘導分化為多種成體細胞。因 此,可以通過ES細胞建立體外分化模型，研究不同基因或細胞因子對不同類型細 胞或組織分化的作用2,3。本課題借助ES細胞自

9、然分化形成的EB中含有三胚 層細胞的獨特細胞環境，研究胸腺肽(thymopeptides)、胸腺素a 1(thymosin- a 1, T a -1)和胸腺五肽(thymopentin-5, TP5) 三種胸腺多肽對 T細 胞發育的作用。同時通過提取不同誘導時期的 RNA利用特異性引物及RT-PCF技 術,結合細胞的表型特點，分析這三種胸腺多肽是否通過 Notch信號途徑影響ES 細胞向T淋巴細胞分化。1 材料與方法材 料細胞系小鼠胚胎干細胞：建株自129sv(H-2b)雄性小鼠胚胎，由中山大學附屬第二醫院兒科黃紹良教授贈送。主要試劑高糖DME培養液、胎牛血清、青霉素鈉、鏈霉素為美國Gibco

10、BRL公司產品。白血病抑制因子(LIF):Chemicon 公司小鼠干細胞因 子(Stem cell factor, SCF)、小鼠白細胞介素-3(1 nterleukin-3, IL-3)、小鼠白細胞介素-7(Interleukin-6,IL-7)、小鼠 Flt-3 配體(Flt-3 ligand, Flt-3L)為美國Perprotech公司產品。注射用胸腺肽為北京賽生藥業有限公司產品，日達 仙胸腺素?琢 1為Sciclone公司產品，胸腺5肽為海南中和藥業有限公司產品。 大鼠抗小鼠CD3e-Cy5熒光標記抗體，大鼠抗小鼠CD3e-Cy5熒光標記抗體為 eBioscienee 公司。逆轉錄

11、試劑盒 :Fermentas 公司。引物由上海生物工程公司合成Notch1:GGAGCGGTGTGAGGGTGATG,ATCTGCGG TGGGGGAATCTC; Jagged-1:TCTCTGACCCCTGC CATAAC, TTTTACAGGGGTTGCTCTCG; Jagged-2:GCAAAGAAGCCGTGTGTAAA,TAATAGCCGCCA ATCAGGTT; Delta-like-1:CCTCGGGATCACGC CTTTG, AGACCACCACAGCAGCACAG; Delta-like-4:GCACCAACTCCTTCGTCGTC, TCACAAAA CAGACCTCCS

12、ATGACGATATCGCTGCGCTG, GTACGACCAGAGGCATAC.培養液的配制ES培養液:在10%S臺牛血清的高糖DME完全培養液著中加入LIF,使其 終濃度為1 U/L LIF 。EB培養液：為含15%臺牛血清的高糖DME培養液。制備合適的類胚體取生長狀態好的ES細胞,經胰酶消化成單細胞，用EB培養液制成單細胞 懸液,轉入60 mm Petri dish 中培養。誘導細胞分化待EB生長57d后,轉入誘導分化液中繼續培養,體外誘導EB內細胞向 T細胞分化。首先參照常規ES誘導分化為造血細胞的方法設立對照組，將篩選后 的EB轉入含SCF,IL-3,IL-7 和Flt-3L 的EB

13、培養液內培養。實驗分為3組:第1 組在常規加入SCF,IL-3,IL-7 和Flt-3L的基礎上，添加了胸腺5肽50卩g;第2 組在加入常規細胞因子的基礎上添加胸腺素a 1 10卩g;第3組在加入常規細胞因子的基礎上添加胸腺肽50卩g。在誘導分化培養的過程中，常規換液,去除死 細胞等影響EB生長的不利因素，定期在顯微鏡下觀察EB的狀態。誘導細胞的表型檢測分別在誘導分化后第8 15、22天收集誘導分化培養液中的EB，用磷酸 鹽緩沖液(PBS)洗滌后，加入適量胰酶消化成單細胞,經臺盼藍染色后顯微鏡下計 數活細胞,并用4%勺多聚甲醛固定細胞。加入大鼠抗小鼠 CD32/16單克隆抗體, 以封閉非特異性

14、結合位點。再分別加入 1卩g大鼠抗小鼠CD3e-Cy5熒光標記抗 體,利用流式細胞儀檢測EB中表達T細胞表型的細胞。RNA抽提分別收集誘導分化后第 8 15、22天的胚體,常規抽提RNA將抽提RNA, 并用DNA酶處理。37 C處理30 min,酶解基因組DNA樣品中加入1卩L 25 mmol/L EDTA,65 C處理 10 min 滅活 DNase I。預變性 94 C 3 min , 變性 94C 30 s, 退火60 C 1 min,延伸72 C 1 min,30 個循環后,72 °C再延伸10 min。反應 結束后,取10卩L產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，鑒定PCR產物。2

15、結 果誘導分化三周內細胞表型變化在誘導分化第8天檢測對照組和實驗組EBs中的細胞表型，結果顯示沒 有CD3+田胞出現。第15天時，再檢測不同誘導體系中EB中細胞表型，結果顯示 加入胸腺素a 1和胸腺肽的EB中的細胞出現T細胞特異性的CD3分子的表 達,CD3+細胞分別占總細胞數的6箱口%至誘導分化的第22天，流式細胞儀檢測 的結果顯示，加入胸腺素a 1誘導的EB,CD3+勺T細胞為，而加入胸腺肽誘導的 EB中,CD3+的T細胞為而加入胸腺五肽的實驗組和對照組一樣,均無CD3鈿胞 出現（圖1）。不同誘導時間細胞內Notch及配體轉錄水平誘導分化的第8天和第15天,加入胸腺素a 1和胸腺肽的EB中

16、有 Notch1及其配體delta-like-1轉錄。第22天時,EB中不僅有Notch1及其配體delta-like-1 轉錄，還有delta-like-4 轉錄。而加入胸腺五肽誘導的EB和對照 組的細胞則無Notch1及其配體轉錄（圖2）。3 討 論胸腺肽、胸腺素a 1和胸腺五肽是目前臨床廣泛應用于免疫功能低下所 致疾病的治療藥物4-7。胸腺肽是由動物胸腺提取物制成，主要成份是胸腺素 a 1和一些小分子多肽；胸腺素a 1是人工合成的含28個氨基酸的多肽分子；胸 腺五肽是人工合成的胸腺生成素U的免疫活性中心的一個五肽片段。藥理學研究發現這些胸腺肽均可增強外周血淋巴細胞的反應性，產生白細胞介素

17、-2增多,受有絲分裂原刺激后，轉化能力增強等，但其作用機制尚未完全明了。由于胸腺多肽 主要在胸腺內產生，因而考慮它們也可能在T細胞胸腺發育期發揮作用，通過影 響T細胞的發育成熟來調節機體的免疫功能，也有少量的研究表明胸腺肽有這樣 的作用。但由于以往研究的模型必須依賴胸腺器官培養體系或使用有正常胸腺的 動物，因此,還沒有直接的證據顯示這些胸腺肽是否影響T細胞的胸腺發育過程以及作用的時期。ES細胞具有無限增殖和多向分化的潛能，在去處抑制其分化的因素如 LIF后,能在體外自然分化形成具有三個胚層細胞的EB在此基礎上添加誘導細胞定向分化的細胞因子，可誘導細胞在體外分化為多種成體細胞。本研究利用ES 細

18、胞的這種特性，通過添加胸腺多肽體外誘導 ES細胞分化為T淋巴細胞，提供了 直接研究胸腺多肽對T淋巴細胞發育的作用的模型。胸腺素a 1和胸腺肽能在SCF,IL-3和IL-7等細胞因子的輔助下,體外誘導ES細胞分化為表達T細胞特征 性表面分子的細胞。而胸腺五肽不能在細胞因子的輔助下，體外誘導ES細胞分化 為表達T細胞特征性表面分子的細胞。這一結果提示，胸腺多肽是一組復雜的體 液調節因子,T a -1和胸腺肽對T細胞成熟的作用與TP5促進T細胞成熟的作用是不同的。在造血干細胞向各種血細胞發育過程中，基質細胞和體液因子都通過細 胞內的不同信號途徑影響細胞的分化，Notch是影響T細胞分化的一個重要的信

19、 號途徑。現在已知Notchl通過提供直接信號促進CLP向T細胞分化，同時抑制其 向B細胞的分化來調節T細胞發育成熟的起始階段。HSCs若失去Notchl功能將 抑制T細胞的分化，導致胸腺內未成熟B細胞大量聚集。相反，若Notchl功能過 強將抑制B細胞發育,導致骨髓中出現大量的T細胞。Notch途徑還在維持HSC 細胞、調節胸腺細胞表達 TCRx B或TCFY S以及促進CD4或CD8鈿胞成熟方 面發揮作用9-13 o Notch的不同配體與Notch受體結合后也影響T細胞的發育 過程14,其中delta-like-1的作用最為明顯。Zuniga-Pflucker 的實驗組就是通過在培養體系

20、中提供delta-like-1配體激活Notch信號,首次在體外不依賴胸腺組織細胞從HSCs誘導出成熟的有功能的T細胞15。盡管現在Notch介導T/B 細胞分化的細胞和分子基礎還有許多疑問存在，如相關前體細胞的特性,Notch 配體的在T細胞發育過程中具體的作用，其它的Notch家族成員的功能，下游信號 途徑和相關的靶基因等。但 Notch在造血細胞生成的許多階段發揮關鍵性作用， 對造血干細胞和相關細胞群的自我更新和分化具有潛在調節作用，影響發育中的淋巴細胞中的許多下游分化物質等作用是毋庸置疑的。本實驗中我們分別檢測了細胞因子加上胸腺素a 1、胸腺肽或胸腺五肽誘導條件下，不同誘導時間的細胞內

21、Notch1信號的轉錄水平。結果顯示加入胸腺 素a 1和胸腺肽的誘導環境中，不僅誘導出表達T細胞表型的細胞，而且這些細胞 均有Notch1分子及其配體delta-like-1 和delta-like-4的表達。而加入胸腺五肽的誘導環境下，既無表達T細胞表型的細胞出現，也未檢測到Notch1分子及 其配體的轉錄。這一結果說明細胞因子加上胸腺素a 1或胸腺肽的共同作用，在EB中激活了 Notch1信號途徑,并通過Notch1的作用在體外誘導出具有T細胞表 型的細胞。而細胞因子和胸腺五肽的組合不能激活Notch1信號途徑,不能在體外誘導ES細胞分化為T細胞表型的細胞。【參考文獻】DANIEL H D

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