1、專題五 DNA和蛋白質技術課題1 DNA的粗提取與鑒定課題2 多聚酶鏈式反應擴增DNA片斷課題3 血紅蛋白的提取和分離課題1 DNA的粗提取與鑒定1、提取生物大分子的基本思路、提取生物大分子的基本思路 （1） 選用一定的選用一定的_或或_方法分離具有方法分離具有 不不同物理或化學性質的生物大分子。同物理或化學性質的生物大分子。 （2） DNA的粗提取就是利用的粗提取就是利用DNA與與_、_和和_等在物理或化學性質方面的差異，提取等在物理或化學性質方面的差異，提取DNA，去除其他成分。，去除其他成分。物理物理化學化學RNA蛋白質蛋白質脂質脂質（1）利用）利用DNA的溶解性的溶解性 DNA的溶解度

2、的溶解度2、提取、提取DNA分子的基本原理分子的基本原理 DNA不不_酒精溶液，但是細胞中的某些酒精溶液，但是細胞中的某些蛋白質則蛋白質則_酒精。利用這一原理，可將酒精。利用這一原理，可將DNA與蛋白質進一步分離。與蛋白質進一步分離。溶于溶于溶于溶于 蛋白酶能水解蛋白質，但對蛋白酶能水解蛋白質，但對_沒有影響。沒有影響。 大多數蛋白質不能忍受大多數蛋白質不能忍受_的高溫，而的高溫，而 DNA在在80以上才會變性。以上才會變性。 洗滌劑能夠瓦解洗滌劑能夠瓦解_，但對，但對_沒沒 有影響。有影響。溫度溫度洗滌劑洗滌劑DNA60-80細胞膜細胞膜DNA（2 2）利用）利用DNADNA和蛋白質對酶、和

3、蛋白質對酶、_和和_的耐受性不同的耐受性不同 （3）DNA的鑒定：的鑒定： DNA在沸水浴的條件下，遇在沸水浴的條件下，遇_反應會反應會 呈現呈現_二苯胺二苯胺藍色藍色本實驗中，本實驗中，要往雞血中加入抗凝劑要往雞血中加入抗凝劑(1)先將新鮮的雞血離心，獲得雞血細胞先將新鮮的雞血離心，獲得雞血細胞(2)在雞血細胞中加入一定量的蒸餾水，同時用玻璃棒攪在雞血細胞中加入一定量的蒸餾水，同時用玻璃棒攪 拌，過濾后收集濾液即可拌，過濾后收集濾液即可實驗材料：實驗材料：1 1、雞血細胞液（、雞血細胞液（510ml510ml）；）；2 2、體積分數為、體積分數為95%95%的冷酒精溶液（實驗前置于冰的冷酒精

4、溶液（實驗前置于冰箱內冷卻箱內冷卻24h24h）；）；3 3、蒸餾水；、蒸餾水；4 4、質量濃度為、質量濃度為0.10.1g/ml的檸的檸檬酸鈉溶液（抗凝劑）檬酸鈉溶液（抗凝劑）5 5、物質的量濃度分別為、物質的量濃度分別為2mol/L2mol/L和和0 0015mol/L015mol/L的的NaClNaCl溶液；溶液；6 6、二苯胺試劑、二苯胺試劑攪拌攪拌目的目的第一次第一次 攪拌加蒸餾水的雞血細胞液，加速細胞破裂攪拌加蒸餾水的雞血細胞液，加速細胞破裂第二次第二次 攪拌含攪拌含DNADNA的高濃度鹽溶液，加速的高濃度鹽溶液，加速 _第三次第三次 攪拌加蒸餾水的攪拌加蒸餾水的NaClNaCl溶

5、液，溶液， _第四次第四次 攪拌含攪拌含DNADNA的高濃度鹽溶液，加速的高濃度鹽溶液，加速 _第五次第五次 攪拌含攪拌含DNADNA的酒精溶液，提取的酒精溶液，提取 _第六次第六次 攪拌含攪拌含DNADNA白色絲狀物的鹽溶液，加速白色絲狀物的鹽溶液，加速 _DNADNA的溶解的溶解均勻稀釋以析出更多均勻稀釋以析出更多DNADNADNADNA的溶解的溶解含雜質較少的含雜質較少的DNADNADNADNA的溶解的溶解NoImage一些微小多孔的球體（內含許多貫穿的通道，由多一些微小多孔的球體（內含許多貫穿的通道，由多糖類構成如葡聚糖、瓊脂糖，具多孔的凝膠就叫分糖類構成如葡聚糖、瓊脂糖，具多孔的凝膠

6、就叫分子篩）子篩） 根據根據相對分子質量相對分子質量的大小分離蛋白質的的大小分離蛋白質的 有效方法有效方法，利用具有網狀結構的凝膠的分子篩作，利用具有網狀結構的凝膠的分子篩作 用用來進行分離。來進行分離。 相對分相對分子質量子質量直徑大小直徑大小運動方式運動方式運動運動速度速度運動運動路程路程洗脫洗脫次序次序大大_凝膠顆粒凝膠顆粒空隙直徑，被空隙直徑，被排阻在排阻在_垂直向下垂直向下移動移動_較短較短先從凝先從凝膠柱洗膠柱洗脫出來脫出來小小_凝膠顆粒凝膠顆粒空隙直徑，可空隙直徑，可以進入顆粒內以進入顆粒內部部垂直向下垂直向下移動，無移動，無規則擴散規則擴散進入凝膠進入凝膠顆粒顆粒_較長較長后從

7、凝后從凝膠柱洗膠柱洗脫出來脫出來洗脫：從色譜柱上端不斷注入緩沖液，洗脫：從色譜柱上端不斷注入緩沖液， 促使蛋白質分子的差速流動。促使蛋白質分子的差速流動。外界的酸或堿外界的酸或堿pHpH值值1-21-2比例比例在不同在不同pHpH范圍內范圍內在同一電場下，由于各種分子在同一電場下，由于各種分子帶電性質帶電性質（正電（正電荷或負電荷）的差異及分子本身荷或負電荷）的差異及分子本身大小、形狀大小、形狀，而使帶電粒子產生不同的，而使帶電粒子產生不同的遷移速度遷移速度。（2 2）原理：）原理：二二 、粗提取血紅蛋白、粗提取血紅蛋白蛋白質的提取和分離一般分為四步：蛋白質的提取和分離一般分為四步：血血液液血

8、漿血漿血細胞血細胞白細胞白細胞血小板血小板紅細胞紅細胞（最多）（最多）血紅血紅蛋白蛋白兩個兩個a a肽鏈肽鏈兩個兩個一肽鏈肽鏈樣品處理樣品處理粗分離粗分離純化純化純度鑒定純度鑒定(1)目的：去除目的：去除_1、紅細胞的洗滌雜質蛋白雜質蛋白(2)方法：方法：采集血樣：為防止血液凝固，需在采血器中加入采集血樣：為防止血液凝固，需在采血器中加入 抗抗凝血劑檸檬酸鈉凝血劑檸檬酸鈉 低速短時間離心低速短時間離心：500 r/min，離心，離心2min，這樣做，這樣做的目的是防止紅細胞與白細胞一同沉淀，達不到分離的目的是防止紅細胞與白細胞一同沉淀，達不到分離效果效果 吸去血漿吸去血漿：用膠頭吸管吸去上層黃

9、色血漿：用膠頭吸管吸去上層黃色血漿 生理鹽水洗滌：向盛有暗紅色紅細胞液體的燒杯中加入生理鹽水洗滌：向盛有暗紅色紅細胞液體的燒杯中加入五倍體積的生理鹽水，緩緩攪拌五倍體積的生理鹽水，緩緩攪拌10min 低速短時間離心低速短時間離心 重復重復步驟步驟3次次：直至上清液中沒有黃色，表明紅細：直至上清液中沒有黃色，表明紅細胞已經洗滌干凈，否則需重復洗滌胞已經洗滌干凈，否則需重復洗滌（1）方法：加）方法：加_到原血液體積，再加到原血液體積，再加40體體 積的甲苯，置于磁力攪拌器上充分攪拌積的甲苯，置于磁力攪拌器上充分攪拌10分鐘。分鐘。（2）目的：使紅細胞吸水）目的：使紅細胞吸水_，血紅蛋白釋放，血紅蛋

10、白釋放出來。出來。漲破漲破蒸餾水蒸餾水2、血紅蛋白的釋放（3）原理：滲透作用）原理：滲透作用3、分離血紅蛋白溶液：將攪拌好混合液轉移到離心、分離血紅蛋白溶液：將攪拌好混合液轉移到離心管內，以管內，以2000r/min的速度離心的速度離心10 min ，試管中的溶，試管中的溶液分為液分為4層層:第第1 1層層 無色透明甲苯層無色透明甲苯層第第2 2層層 脂溶性物質沉淀層，白色薄層固體脂溶性物質沉淀層，白色薄層固體第第3 3層層 紅色透明液體（紅色透明液體（血紅蛋白水溶液血紅蛋白水溶液） 第第4 4層層 其他雜質的暗紅色沉淀其他雜質的暗紅色沉淀4、透析(1)原理：原理：_能使小分子自由進出，能使小

11、分子自由進出，而將而將大分子保留在袋內。大分子保留在袋內。(2)過程：取過程：取1mL的血紅蛋白溶液裝入透的血紅蛋白溶液裝入透析袋析袋中，將透析袋放入盛有中，將透析袋放入盛有300 mL的物質的量濃的物質的量濃度為度為20 mmol/L的磷酸緩沖液中的磷酸緩沖液中(pH為為7.0)，透，透析析12 h。透析袋透析袋三、純化蛋白質三、純化蛋白質1、凝膠色譜柱的制作、凝膠色譜柱的制作取長取長40厘米，內徑厘米，內徑1.6厘米的玻璃管，厘米的玻璃管， 兩端需用砂紙磨平。兩端需用砂紙磨平。底塞的制作：打孔底塞的制作：打孔 挖出凹穴挖出凹穴 安裝移液管頭部安裝移液管頭部 覆蓋尼龍網，再用覆蓋尼龍網，再用

12、 100目尼龍紗將橡皮塞上部包好。目尼龍紗將橡皮塞上部包好。頂塞的制作：頂塞的制作：插入安裝了玻璃管的橡皮塞插入安裝了玻璃管的橡皮塞組裝：將上述三者按相應位置組裝成一個整體。組裝：將上述三者按相應位置組裝成一個整體。2、凝膠色譜柱的裝填(1)(1)計算：根據色譜柱的內體積計算所需計算：根據色譜柱的內體積計算所需 凝膠量凝膠量(2)(2)凝膠凝膠溶脹溶脹：凝膠用蒸餾水充分溶脹后，配：凝膠用蒸餾水充分溶脹后，配 成凝膠懸液成凝膠懸液(3)(3)固定固定：將色譜柱垂直固定在支架上：將色譜柱垂直固定在支架上(4)(4)裝填裝填：將凝膠懸液一次性裝填入色譜：將凝膠懸液一次性裝填入色譜 柱內柱內(5)(5

13、)洗滌平衡洗滌平衡：用：用20 mmol/L20 mmol/L的磷酸緩沖液的磷酸緩沖液(pH(pH7.0)7.0)洗滌平衡凝膠洗滌平衡凝膠12 h12 h，使凝膠裝填緊，使凝膠裝填緊密密3、樣品加入與洗脫a a、加樣前、加樣前 打開下端出口，使柱內凝打開下端出口，使柱內凝膠面上的膠面上的_緩慢緩慢下降到與下降到與_平齊，關平齊，關閉出口閉出口緩沖液緩沖液凝膠面凝膠面b b、加透析樣品、加透析樣品調整緩沖液面：與凝膠面平齊調整緩沖液面：與凝膠面平齊滴加透析樣品：用吸管將滴加透析樣品：用吸管將1ml透析液的樣品加到色透析液的樣品加到色譜柱的頂端譜柱的頂端樣品滲入凝膠床：樣品滲入凝膠床：_在調整緩沖液面：關閉出口，小心加入在調整緩沖液面：關閉出口，小心加入20 mmol/L的磷酸緩沖液到適當高度的磷酸緩沖液到適當高度洗脫：打開下端，用磷酸緩沖液洗脫洗脫：打開下端，用磷酸緩沖液洗脫收集：待收集：待_接近色譜柱底端時，用接近色譜柱底端時，用試管收集流出