1、ppt課件課件.MSI診斷檢測的方法和應用診斷檢測的方法和應用ppt課件課件.主主 要要 內內 容容 微衛星不穩定的相關背景微衛星不穩定的相關背景MSI的檢測意義的檢測意義MSI檢測方法檢測方法MSI檢測試劑盒檢測試劑盒ppt課件課件.背背 景景 介介 紹紹 微衛星不穩定性微衛星不穩定性(microsatellite instability, (microsatellite instability, MSI)MSI)是指與正常組織相比，在腫瘤中某一微衛星由于重復是指與正常組織相比，在腫瘤中某一微衛星由于重復單位的插入或缺失而造成的微衛星長度的任何改變，出現單位的插入或缺失而造成的微衛星長度的任

2、何改變，出現新的微衛星等位基因現象。新的微衛星等位基因現象。 主要機制：主要機制： DNADNA多聚酶的滑動導致重復序列中多聚酶的滑動導致重復序列中1 1個或多個堿基的個或多個堿基的錯配錯配 MSMS同源重組導致堿基對的丟失和插入同源重組導致堿基對的丟失和插入ppt課件課件. 19931993年，年，AltonenAltonen等首次發現，在等首次發現，在HNPCCHNPCC細胞中存在高頻率細胞中存在高頻率的的MSIMSI。目前已發現。目前已發現MSIMSI的腫瘤主要有的腫瘤主要有3 3類：類： 一類為一類為HNPCCHNPCC病人發生的結直腸癌、子宮內膜癌以及卵巢病人發生的結直腸癌、子宮內膜

3、癌以及卵巢癌癌, ,這一類腫瘤幾乎都表現為這一類腫瘤幾乎都表現為MSIMSI； 另一類為散發性結直腸癌另一類為散發性結直腸癌, ,這一類腫瘤發生這一類腫瘤發生MSIMSI概率約概率約15 30； 第三類為包括肺癌、乳腺癌和胰腺癌在內的其它腫瘤第三類為包括肺癌、乳腺癌和胰腺癌在內的其它腫瘤, ,這這一類腫瘤一類腫瘤MSIMSI發生頻率相對較低。發生頻率相對較低。背背 景景 介介 紹紹ppt課件課件.結直腸癌是是常見的消化道惡性腫瘤，我們每結直腸癌是是常見的消化道惡性腫瘤，我們每年有年有1313萬萬-16-16萬人罹患結直腸癌，其發病率占腫瘤萬人罹患結直腸癌，其發病率占腫瘤發病率的第三位，僅次于肺

4、癌和胃癌。發病率的第三位，僅次于肺癌和胃癌。 HNPCCHNPCC是常見的遺傳性腫瘤綜合癥，遺傳性結是常見的遺傳性腫瘤綜合癥，遺傳性結直腸癌是一個常染色體遺傳疾病直腸癌是一個常染色體遺傳疾病, ,目前研究表明微目前研究表明微衛星不穩定性可能是遺傳性結直腸癌發生的重要衛星不穩定性可能是遺傳性結直腸癌發生的重要機制。機制。背背 景景 介介 紹紹ppt課件課件.具有具有MSI的散發性結直腸癌的散發性結直腸癌,具有不同的臨床病理、具有不同的臨床病理、分子生物學特征分子生物學特征,表現為表現為:發病年齡較小；對某些化療發病年齡較小；對某些化療藥物藥物(如如5-FU、順鉑等、順鉑等)有原發性耐藥有原發性耐

5、藥; 生物學行為較生物學行為較好。好。MSI-H是是期結腸癌預后良好的一個標志物，也期結腸癌預后良好的一個標志物，也是患者不能從氟尿嘧啶單藥輔助化療獲益的療效預是患者不能從氟尿嘧啶單藥輔助化療獲益的療效預測指標。測指標。背背 景景 介介 紹紹ppt課件課件.微衛星不穩定檢測的意義微衛星不穩定檢測的意義1. 1. 檢測檢測MSIMSI可以用于檢測是否為可以用于檢測是否為LynchLynch綜合征綜合征結直腸癌的遺傳易感性包括一些研究較清楚的遺傳性結直腸癌的遺傳易感性包括一些研究較清楚的遺傳性綜合征，例如綜合征，例如LynchLynch綜合征（又稱之為遺傳性非息肉病綜合征（又稱之為遺傳性非息肉病性

6、結直腸癌，性結直腸癌，HNPCCHNPCC）和家族性息肉病（）和家族性息肉病（FAPFAP）。）。在在HNPCC HNPCC 和散發性直腸癌中的微衛星不穩定性是遍布整和散發性直腸癌中的微衛星不穩定性是遍布整個基因組的現象，并且可能是導致癌癥發生的普遍機個基因組的現象，并且可能是導致癌癥發生的普遍機制。制。 ppt課件課件. 專家組推薦，專家組推薦， MMRMMR蛋白檢測應強烈建議在所蛋白檢測應強烈建議在所有有5050歲以下的結腸癌患者中開展，原因在于該歲以下的結腸癌患者中開展，原因在于該群體中患群體中患LynchLynch綜合征的可能性增加。而且，在綜合征的可能性增加。而且，在一些中心，現在對

7、所有的結直腸腫瘤組織進行一些中心，現在對所有的結直腸腫瘤組織進行免疫組化檢測（有時分析免疫組化檢測（有時分析MSIMSI）以來決定哪些患）以來決定哪些患者需要進行者需要進行LynchLynch綜合征相關的基因檢測綜合征相關的基因檢測. .微衛星不穩定檢測的意微衛星不穩定檢測的意義義ppt課件課件. 2. 檢測檢測MSI可以用于判斷患者預后可以用于判斷患者預后高危高危期患者，定義為預后較差者，包括：期患者，定義為預后較差者，包括：T4（B、C期）、組織學分化差（期）、組織學分化差（3/4級，不包級，不包括括MSI-H者），已經有大量證據表明者），已經有大量證據表明MMR蛋白蛋白表達缺失或表達缺失

8、或MSI-H是是期結腸癌預后良好的一個期結腸癌預后良好的一個標志物。具有標志物。具有MSI-H腫瘤的腫瘤的期結腸癌患者，期結腸癌患者，3/4級分化（低分化）不再認為是高危因素。級分化（低分化）不再認為是高危因素。微衛星不穩定檢測的意義微衛星不穩定檢測的意義ppt課件課件.3. 3. 檢測檢測MSIMSI以判斷是否需要輔助化療以判斷是否需要輔助化療對于對于期結腸癌是否需要輔助化療，在做臨床決期結腸癌是否需要輔助化療，在做臨床決策時需要考量的一個重要信息就是微衛星不穩定策時需要考量的一個重要信息就是微衛星不穩定性（性（MSIMSI）。）。研究認為研究認為MMR MMR 基因為基因為MSI-HMSI

9、-H（高度微衛星不穩定）（高度微衛星不穩定）會對順鉑、卡培他濱及會對順鉑、卡培他濱及5-FU 5-FU 產生耐藥性，相反產生耐藥性，相反MSI-LMSI-L、MSS MSS 的患者不會產生耐藥。的患者不會產生耐藥。微衛星不穩定檢測的意義微衛星不穩定檢測的意義ppt課件課件. 一項研究長期隨訪了一項研究長期隨訪了/期結腸癌期結腸癌患者后發現，患者后發現，MSI-LMSI-L或或MSSMSS者通過者通過5-FU5-FU輔助輔助化療確實改善了預后；然而，化療確實改善了預后；然而，MSI-HMSI-H者卻者卻不能從術后不能從術后5-FU5-FU輔助化療中顯著獲益，與輔助化療中顯著獲益，與單純手術相比，

10、單純手術相比，5-5-年生存率反而更低。年生存率反而更低。微衛星不穩定檢測的意義微衛星不穩定檢測的意義ppt課件課件MSI 檢檢 測測 方方 法法1. 免疫組化方法免疫組化方法(IHC) 免疫組化方法僅用于與腫瘤細胞中的免疫組化方法僅用于與腫瘤細胞中的MLH1, MSH2, MSH6和和PMS2蛋白結蛋白結合。如果沒有結合任何的蛋白，就證明發生了合。如果沒有結合任何的蛋白，就證明發生了MSI。2. 直接測序法直接測序法 對對MMR基因各區域（基因各區域（MLH1、MSH2、MSH6等）的擴增產物直接測序。等）的擴增產物直接測序。3. 多重熒光多重熒光PCR 采用多重熒光采用多重熒光PCR的方法

11、對的方法對NCI建議的位點進行擴增，以確定建議的位點進行擴增，以確定MSI狀態。狀態。ppt課件課件.檢檢 測測 MSI 方方 法法 比比 較較 方法方法靈敏度靈敏度特異特異性性重現重現性性時間時間成本成本操作操作IHC90%低低低低3-5天天5001000復雜復雜直接測序直接測序法法80100%高高高高5-7天天10002000 簡便簡便多重熒光多重熒光PCR100%高高高高2-3天天5001000 簡便簡便ppt課件課件.Microread MSI 檢檢 測測 試試 劑劑 盒盒 閱微基因根據閱微基因根據NCCNNCCN指南，針對結直腸癌基因診斷領域研發了指南，針對結直腸癌基因診斷領域研發了

12、MSIMSI檢測檢測的試劑盒。的試劑盒。 微衛星不穩定（微衛星不穩定（microsatellite instabilitymicrosatellite instability，MSIMSI）檢測試劑盒）檢測試劑盒是一款以多重熒光是一款以多重熒光PCRPCR技術為基礎的基因突變檢測系統，一次擴增檢技術為基礎的基因突變檢測系統，一次擴增檢測測6 6個個MSIMSI位點，操作簡便、快速。位點，操作簡便、快速。ppt課件課件.擴擴 增增 檢檢 測測 位位 點點位點位點GenBankNumber重復序列重復序列產物范圍產物范圍1標記熒光類型標記熒光類型NR-27AF070674(A)2770-91HEX

13、NR-21XM_033393(A)2192-113FAMBAT-26U41210(A)26160-185FAMBAT-25L04143(A)25105-125HEXNR-24X60152(A)24119-139TMRMONO-27AC007684(A)27155-177TMRPenta CAL138752(AAAAG)3-15190-250FAMPenta DAC000014(AAAAG)2-17151-224HEXAmel-107/113TMRppt課件課件.MSI 檢檢 測測 送送 樣樣 要要 求求 若客戶提供石蠟切片，則要求厚度若客戶提供石蠟切片，則要求厚度5-20m的石蠟切片（切片的石

14、蠟切片（切片中確保含有中確保含有9mm2以上大小的組織塊）以上大小的組織塊）10片或以上，注明石蠟片或以上，注明石蠟包埋組織的保存年限，組織類型和包埋前處理方式等。包埋組織的保存年限，組織類型和包埋前處理方式等。若客戶提供若客戶提供DNA樣品，則從新鮮組織提取的樣品，則從新鮮組織提取的DNA最佳，最佳，20ng/l以上的以上的DNA 20l即可（需提供即可（需提供DNA濃度）；若為石蠟濃度）；若為石蠟包埋組織提取的包埋組織提取的DNA，除了提供，除了提供DNA的濃度（的濃度（20ng/l以上的以上的DNA至少至少20l）外，還需提供瓊脂糖凝膠電泳圖）外，還需提供瓊脂糖凝膠電泳圖ppt課件課件.

15、MSI 檢檢 測測 試試 劑劑 盒盒 使使 用用 方方 法法 DNA提取：根據樣本不同，采用二甲苯或提取：根據樣本不同，采用二甲苯或Chelex 100的方法提取的方法提取DNA； PCR擴增：擴增： 毛細管電泳檢測：按照毛細管電泳檢測：按照（0.5lROX500）樣品數樣品數+（8.5l甲酰甲酰胺）胺）樣品數樣品數制備好樣品，制備好樣品，RUN 3130 xl遺傳分析儀。遺傳分析儀。組分組分20 l體系體系(l)Master Mix無核酸酶超純水無核酸酶超純水6.02.5PCR Mix8.05MSI引物混合引物混合物物4.0模板模板DNA2.0反應總體積反應總體積20.0ppt課件課件.操操

16、 作作 流流 程程 示示 意意 圖圖ppt課件課件.數數 據據 分分 析析n 目的峰：目的峰：A. 單核苷酸標記的位點單核苷酸標記的位點NR21、Bat26、NR27、Bat25、NR24、Mono27的峰型均為類似五指的手掌峰，見圖的峰型均為類似五指的手掌峰，見圖2； 圖圖2 單核苷酸標記位點峰型示意圖單核苷酸標記位點峰型示意圖ppt課件課件.B. 五核苷酸重復的位點五核苷酸重復的位點Penta C、Penta D和性別位點和性別位點Amelogenin的峰型均為單峰型，見圖的峰型均為單峰型，見圖3。 圖圖3 五核苷酸標記和性別位點峰型示意圖五核苷酸標記和性別位點峰型示意圖n 非目的峰：非目

17、的峰：pull-up峰、峰、stutter峰、染料峰、加峰、染料峰、加A不完全峰等。不完全峰等。數數 據據 分分 析析ppt課件課件.MSI 判判 定定 結結 果果微衛星不穩定MSI-H型 根據根據NCI建議，與正常樣本比較，有建議，與正常樣本比較，有2個發生改變可稱定為個發生改變可稱定為MSI-H型，型，只有只有1個出現不穩定的為個出現不穩定的為MSI-L型，沒有出現突變的情況為型，沒有出現突變的情況為MSS型。型。ppt課件課件.微衛星不穩定MSI-L型MSI 判判 定定 結結 果果ppt課件課件.微衛星穩定MSS型MSI 判判 定定 結結 果果ppt課件課件.MSI 檢檢 測測 試試 劑

18、劑 盒盒 優優 點點 基于基于MSIMSI的的NCI panelNCI panel標準開發了適合中國人群的標準開發了適合中國人群的MSIMSI檢測系統；檢測系統； 采用多重熒光采用多重熒光PCRPCR技術，一次擴增和檢測技術，一次擴增和檢測6 6個準單態性單核苷酸個準單態性單核苷酸微衛星基因座，其中微衛星基因座，其中5 5個與國外檢測相吻合，另外增加了一個適合個與國外檢測相吻合，另外增加了一個適合中國人群的位點；中國人群的位點； 基于測序儀的基因分型研究領域擁有多年的經驗和多項成果，基于測序儀的基因分型研究領域擁有多年的經驗和多項成果，已經做了超過已經做了超過10001000例病例樣本，積累了

19、豐富的經驗和數據基礎。例病例樣本，積累了豐富的經驗和數據基礎。ppt課件課件.MSI 檢檢 測測 案案 例例XBH-XXBH-1* 接收委托方兩份樣本，正常組織接收委托方兩份樣本，正常組織XBH-X和腫瘤組織和腫瘤組織XBH-1，要求鑒定腫瘤組織的，要求鑒定腫瘤組織的MSI狀態，狀態，正常對照樣本分型正確，腫瘤組織樣品在正常對照樣本分型正確，腫瘤組織樣品在BAT-26、NR-27、BAT-25、NR-24和和MONO-27等等5個位點出現雙峰。該腫瘤組織為個位點出現雙峰。該腫瘤組織為MSI-H型。型。ppt課件課件.13MS6E13MS6C* 接收委托方兩份檢材，分別為腫瘤組織接收委托方兩份檢材，分別為腫瘤組織13MS6C和正常組織和正常組織13MS6E，要求檢測該腫瘤組，要求檢測該腫瘤組織的織的MSI狀態，狀態，6個單核苷酸位點均未出現個單核苷酸位點均未出現MSI，鑒定結果為，鑒定結果為MSS穩定狀態。穩定狀態。MSI 檢檢 測測 案案 例例ppt課件課件.閱閱 微微 基基 因因 診診 斷斷 試試 劑劑 簡簡 介介n 脆