1、轉(zhuǎn)g10-epsps基因耐除草劑大豆ZUTS-33轉(zhuǎn)化體特異性檢測(cè)方法的建立近年來(lái),隨著基因工程技術(shù)的飛速發(fā)展,轉(zhuǎn)基因作物種植面積和轉(zhuǎn)基因作物品種都大幅增加。根據(jù)國(guó)際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織(International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications,ISAAA)發(fā)布的2018年全球生物技術(shù)/轉(zhuǎn)基因作物發(fā)展態(tài)勢(shì)報(bào)告,2018年全球共有26個(gè)國(guó)家或地區(qū)批準(zhǔn)了轉(zhuǎn)基因作物的種植,44個(gè)國(guó)家或地區(qū)批準(zhǔn)了轉(zhuǎn)基因作物作為加工原料進(jìn)口,轉(zhuǎn)基因作物的種植面積達(dá)1.917億hm21。轉(zhuǎn)基因大豆作為最主要的轉(zhuǎn)基因作物,全球種植面積達(dá)

2、9 590萬(wàn)hm2,占全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積的50%2。隨著轉(zhuǎn)基因產(chǎn)業(yè)的高速發(fā)展,全球已有60多個(gè)國(guó)家或地區(qū)相繼實(shí)施了轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品定量標(biāo)識(shí)閾值管理,其中,歐盟將轉(zhuǎn)基因成分標(biāo)識(shí)閾值設(shè)定為0.9%,日本設(shè)為5%,韓國(guó)設(shè)為3%3-4。我國(guó)自2001年起也先后頒布了農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理?xiàng)l例農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識(shí)管理辦法,明確規(guī)定了我國(guó)對(duì)所有的轉(zhuǎn)基因食品實(shí)行零容忍定性標(biāo)識(shí)管理制度。因此,轉(zhuǎn)基因安全管理實(shí)施定量標(biāo)識(shí)和閾值管理是發(fā)展的必然趨勢(shì)5。而建立快速、精準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因定量檢測(cè)方法體系可以為實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)識(shí)閾值管理制度、規(guī)范轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品銷(xiāo)售行為、保護(hù)消費(fèi)者的知情權(quán)、加強(qiáng)農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理提供技術(shù)支持。PCR

3、技術(shù)具有靈敏度高、穩(wěn)定性好、準(zhǔn)確性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便的優(yōu)勢(shì),是國(guó)際上轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品檢測(cè)的主要方法。特別是實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù),因具有更高的靈敏度、更強(qiáng)的特異性和準(zhǔn)確性、檢測(cè)過(guò)程耗時(shí)短且能實(shí)現(xiàn)高度自動(dòng)化等特點(diǎn),近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因作物的檢測(cè)6。目前針對(duì)大豆、水稻、玉米等作物的特定轉(zhuǎn)基因品系的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法已陸續(xù)研發(fā)成功7-12。轉(zhuǎn)基因耐草甘膦大豆ZUTS-33是由浙江大學(xué)利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化栽培大豆華春3號(hào)獲得的,ZUTS-33可產(chǎn)生G10-EPSPS蛋白,對(duì)草甘膦高抗,可以滿(mǎn)足大豆種植者對(duì)田間雜草的有效防治,具有較好的農(nóng)藝性狀和商業(yè)化潛力13。但到目前為止,尚未發(fā)布專(zhuān)門(mén)針對(duì)轉(zhuǎn)基

4、因耐除草劑大豆ZUTS-33轉(zhuǎn)化體及其衍生品種的檢測(cè)方法。本研究以轉(zhuǎn)g10-epsps基因耐除草劑大豆ZUTS-33為研究對(duì)象,設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)g10-epsps基因耐除草劑大豆ZUTS-33的轉(zhuǎn)化體特異性檢測(cè)引物和TaqMan探針,利用優(yōu)化的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法評(píng)價(jià)該引物對(duì)和探針的特異性、準(zhǔn)確度、精確度和重復(fù)性,并確定此檢測(cè)方法的檢測(cè)極限(limit of detection,LOD)和定量極限(limit of quantity,LOQ),以期建立轉(zhuǎn)g10-epsps基因耐除草劑大豆ZUTS-33品系的檢測(cè)鑒定方法,為農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理提供技術(shù)支持。1 材料與方法1.1 材料1.1.1 試

5、驗(yàn)材料試驗(yàn)所用轉(zhuǎn)g10-epsps基因耐除草劑大豆ZUTS-33及其受體材料由浙江大學(xué)提供;其他轉(zhuǎn)基因大豆混合物(GTS40-3-2、MON89788、CV127、A5547-127、A2704-12、305423、356043、MON88302、73496、MON87769、MON87705、FG72、DAS68416-4、SHZD32-1),轉(zhuǎn)基因玉米混合物(Bt11、Bt176、MON810、MON863、GA21、NK603、T25、TC1507、MON89034、MON88017、59122、MIR604、3272、MON87460、MIR162、DAS40278-9、雙抗12-5、

6、IE09S034、C0030.3.5、C0010.3.7、4114、MON87427、5307),轉(zhuǎn)基因棉花混合物(MON531、MON1445、MON15985、LLCOTTON25、MON88913、GHB614、COT102),轉(zhuǎn)基因油菜混合物(MS1、MS8、RF1、RF2、RF3、T45、OXY235、Topas19/2、MON88302、73496),轉(zhuǎn)基因水稻混合物(TT51-1、科豐6號(hào)、克螟稻、M12、科豐8號(hào)、科豐2號(hào)、G6H1、T1C-19)陽(yáng)性材料購(gòu)置于深圳卓越生物科技有限公司和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部科技發(fā)展中心;其他非轉(zhuǎn)基因玉米、大豆、水稻、棉花等材料由本實(shí)驗(yàn)室自備。1.1.2

7、主要試劑TaqMan Fast Advanced Master Mix預(yù)混液購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司;植物基因組DNA提取試劑盒(DP305)購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。1.1.3 主要儀器CFX96熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Bio-rad公司;NanoDrop 2000C核酸蛋白測(cè)定儀購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司。1.2 DNA 提取與純化使用植物基因組DNA提取試劑盒提取并純化所有材料的基因組DNA,具體步驟按照試劑盒使用說(shuō)明書(shū)操作。獲得的基因組DNA用NanoDrop 2000C核酸蛋白測(cè)定儀進(jìn)行核酸質(zhì)量分析。為符合進(jìn)一步檢測(cè)的要求,所有材料基因組DNA OD

8、260/OD280在1.72.0之間,濃度在3070 ng·L-1之間,于-20 保存?zhèn)溆谩?.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法建立1.3.1 引物和探針設(shè)計(jì)根據(jù)轉(zhuǎn)g10-epsps基因耐除草劑大豆ZUTS-33左右邊界側(cè)翼序列信息13,通過(guò)Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)化體特異性引物和探針。轉(zhuǎn)化體特異性探針5端修飾基團(tuán)為6-羧基熒光素(6-carboxy-fluorescein,FAM),3端為黑洞淬滅基團(tuán)(BHQ1),內(nèi)源基因?yàn)榫幋a大豆凝集素的基因Lectin基因,引物探針引用歐盟CRLVL08/05VR14中的序列,具體信息見(jiàn)表1。引物和探針均由生工生物工程(上海)股

9、份有限公司合成。Table 1 Primers and probes used in this study表1 引物和探針引物/探針序列(53)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度/bp用途ZUTS-33- LB-qF5-GCGTCAATTTGTCCGCAAG-3109轉(zhuǎn)化體特異性ZUTS-33-LB-qR5-AGATGATGATTCATACATGGACACT-3ZUTS-33-LB-P5-FAM-CAGCTTCTTCTTCTCCGACGTTGT-BHQ1-3ZUTS-33-RB-qF15-GCCTTGCCGGTAGTAGGATC-3124轉(zhuǎn)化體特異性ZUTS-33-RB-qR15-AGATTGTCGTTTCCCGC

10、CTT-3ZUTS-33-RB-P15-FAM-TCGTAGCCGTGTCGCCTTGC-BHQ1-3ZUTS-33-RB-qF25-CTTGCCGGTAGTAGGATCGAC-3141轉(zhuǎn)化體特異性ZUTS-33-RB-qR25-GAGCAGCTTGAGCTTGGATCA-3ZUTS-33-RB-P25-FAM-CAGGTGGTCTAGTGGCCAATGATCGTAG-BHQ1-3ZUTS-33-RB-qF35-GATCGTAGCCGTGTCGCCT-3139轉(zhuǎn)化體特異性ZUTS-33-RB-qR35-AGAGGCCCGCACCGATC-3ZUTS-33-RB-P35-FAM-CCAAGCTC

11、AAGCTGCTCTAGCATTCGCC-BHQ1-3Lec-F5-CCAGCTTCGCCGCTTCCTTC-374內(nèi)源基因Lec-R5-GAAGGCAAGCCCATCTGCAAGCC-3Lec-P5-FAM-CTTCACCTTCTATGCCCCTGACAC-BHQ1-31.3.2 引物探針適用性測(cè)試以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的轉(zhuǎn)基因大豆ZUTS-33基因組DNA為模板,采用通用的實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系和程序進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系為:2×TaqMan Fast Advanced Master Mix 12.5 L,10 mol·L-1上、下游引物各1.0 L,10 mol·

12、L-1探針0.5 L,25 mg·L-1 DNA 2.0 L,補(bǔ)水至25 L。反應(yīng)程序?yàn)?95 預(yù)變性5 min;95 變性15 s,60 退火/延伸 1 min(在此階段收集熒光信號(hào)),共40個(gè)循環(huán)。根據(jù)熒光曲線(xiàn)的線(xiàn)性、相對(duì)Ct值等因素,確定引物和探針組合。1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法反應(yīng)體系優(yōu)化為獲得最優(yōu)的引物和探針?lè)磻?yīng)濃度,將探針的濃度設(shè)置為0.10、0.20、0.25、0.30、0.40、0.50 mol·L-1 6個(gè)探針濃度梯度,對(duì)應(yīng)的引物濃度為探針濃度的2倍,采用通用的實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增。根據(jù)熒光曲線(xiàn)的線(xiàn)性、相對(duì)Ct值等

13、因素,確定體系中引物和探針的最優(yōu)濃度。1.4 實(shí)驗(yàn)室內(nèi)方法確認(rèn)1.4.1 檢測(cè)方法特異性選用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的轉(zhuǎn)基因大豆ZUTS-33、62種不同的主要商業(yè)化轉(zhuǎn)化體、轉(zhuǎn)基因大豆ZUTS-33陰性對(duì)照(即受體)、其他非轉(zhuǎn)基因大豆作為測(cè)試對(duì)象,對(duì)1.3中建立的耐除草劑大豆ZUTS-33實(shí)時(shí)熒光PCR方法進(jìn)行特異性測(cè)試,以驗(yàn)證候選引物和探針組合是否僅在陽(yáng)性樣品中獲得預(yù)期的擴(kuò)增。1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制根據(jù)EURL15對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線(xiàn)的各項(xiàng)參數(shù)的詳細(xì)規(guī)定,標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)R20.98,擴(kuò)增效率EEfficiency=10(-1/slope)-1的范圍為90%110%,斜率(slop

14、e)范圍為-3.1-3.6。提取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%的ZUTS-33大豆樣品的DNA,將基因組DNA(25 ng·L-1)按6倍濃度梯度依次進(jìn)行稀釋,配制成了5個(gè)含量的標(biāo)準(zhǔn)樣品,依次為22 422、3 737、623、104、17 copies·L-1。采用1.3中建立的最優(yōu)體系和通用反應(yīng)程序進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng),每個(gè)PCR反應(yīng)設(shè)置3個(gè)平行,重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)DNA溶液PCR反應(yīng)的Ct值及初始模板拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)繪制ZUTS-33的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的各項(xiàng)參數(shù)(R2、效率E、斜率)確認(rèn)方法是否符合要求。1.4.3 準(zhǔn)確度、精確度和重復(fù)性評(píng)價(jià)將研磨好的轉(zhuǎn)g10-eps

15、ps基因耐除草劑大豆ZUTS-33品系大豆和其受體材料(非轉(zhuǎn)基因大豆)按照質(zhì)量百分比進(jìn)行混合,配制了3個(gè)不同轉(zhuǎn)基因百分含量的樣品,質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為5.0%、1.0%和0.5%。采用1.3中建立的最優(yōu)體系和通用反應(yīng)程序進(jìn)行內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Lectin和轉(zhuǎn)g10-epsps基因耐除草劑大豆ZUTS-33轉(zhuǎn)化體特異性實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。每次設(shè)3個(gè)平行,重復(fù)3次實(shí)驗(yàn),計(jì)算多次測(cè)試的偏差(Bias)和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD),評(píng)價(jià)測(cè)試方法的準(zhǔn)確度和精確度。1.4.4 檢測(cè)極限和定量極限確定根據(jù)轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測(cè) 實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法制定指南(農(nóng)

16、業(yè)部2259號(hào)公告-5-2015)的規(guī)定,轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法的檢測(cè)極限(limit of detection,LOD)應(yīng)不高于目標(biāo)濃度的1/20,定量極限(limit of quantity,LOQ)應(yīng)不高于目標(biāo)濃度的1/10。根據(jù)農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識(shí)管理辦法,我國(guó)目前對(duì)轉(zhuǎn)基因食品實(shí)行強(qiáng)制標(biāo)識(shí)管理制度,只要食品中檢出轉(zhuǎn)基因成分就需進(jìn)行標(biāo)識(shí),并未設(shè)定閾值15。本研究設(shè)定的目標(biāo)濃度參考?xì)W盟閾值0.9%,因此,檢測(cè)極限LOD0.045%(相當(dāng)于50 ng DNA模板中含有約20拷貝的ZUTS-33轉(zhuǎn)化體特異性序列),定量極限LOQ0.09%(相當(dāng)于50 ng DNA模板中含有約40拷貝的ZUTS-33轉(zhuǎn)化

17、體特異性序列)。本研究設(shè)置了反應(yīng)體系中含有20拷貝和10拷貝2種ZUTS-33轉(zhuǎn)化體特異性序列對(duì)方法LOD進(jìn)行測(cè)試,設(shè)置了40拷貝和20拷貝2種ZUTS-33轉(zhuǎn)化體特異性序列對(duì)方法LOQ進(jìn)行測(cè)試,以確定方法的LOD和LOQ。2 結(jié)果與分析2.1 引物探針適用性測(cè)試為了獲得擴(kuò)增效果最好的引物和探針,以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的轉(zhuǎn)基因大豆ZUTS-33基因組DNA為模板進(jìn)行適用性測(cè)試。測(cè)試結(jié)果(圖1)表明,4組引物探針組合擴(kuò)增Ct值無(wú)明顯差異,但組合A擴(kuò)增曲線(xiàn)上升幅度最大,線(xiàn)型最好,即引物探針組合ZUTS-33-LB-qF/qR/P(以下文中定名為ZUTS-33-qF/qR/P)的擴(kuò)增效果最好。因此,選擇Z

18、UTS-33-qF/qR/P作為候選的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物進(jìn)行進(jìn)一步測(cè)試。2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系優(yōu)化為了獲得最優(yōu)的反應(yīng)體系,本研究對(duì)反應(yīng)體系中引物和探針設(shè)置了不同的濃度進(jìn)行測(cè)試。結(jié)果表明(圖2),隨著引物和探針濃度的增加,擴(kuò)增曲線(xiàn)呈現(xiàn)上升的趨勢(shì),Ct值逐漸減小,0.20 mol·L-1及以上濃度的Ct值無(wú)明顯差異。當(dāng)反應(yīng)體系中探針濃度為0.10 mol·L-1時(shí),Ct值約為33,當(dāng)反應(yīng)體系中探針濃度為0.20 mol·L-1及以上時(shí),Ct值約為32。考慮內(nèi)源基因擴(kuò)增反應(yīng)體系,最終確定檢測(cè)的引物濃度為0.40 mol·L-1,探針濃度為0.2

19、0 mol·L-1。反應(yīng)體系確定為:2×Mix 12.5 L,10 mol·L-1上、下游引物各1.0 L,10 mol·L-1探針0.5 L,25 mg·L-1 DNA 2.0 L,補(bǔ)水至25 L。圖1 實(shí)時(shí)熒光PCR引物的適用性測(cè)試圖2 實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系優(yōu)化2.3 特異性測(cè)試為了驗(yàn)證適應(yīng)性試驗(yàn)篩選出的候選引物和探針組合是否僅在陽(yáng)性材料中獲得預(yù)期的擴(kuò)增,采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的轉(zhuǎn)基因大豆ZUTS-33、62種不同的主要商業(yè)化轉(zhuǎn)化體、轉(zhuǎn)基因大豆ZUTS-33陰性對(duì)照(即受體)、其他非轉(zhuǎn)基因大豆作為測(cè)試對(duì)象,進(jìn)行了特異性試驗(yàn)。測(cè)試結(jié)果

20、(圖3)顯示,僅耐除草劑大豆ZUTS-33獲得了典型的擴(kuò)增曲線(xiàn),其余轉(zhuǎn)化體及ZUTS-33陰性對(duì)照、其他非轉(zhuǎn)基因大豆均未出現(xiàn)擴(kuò)增,表明建立的實(shí)時(shí)熒光PCR方法具有高度的特異性。圖3 ZUTS-33轉(zhuǎn)化體檢測(cè)方法特異性測(cè)試2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%的轉(zhuǎn)基因大豆ZUTS-33基因組DNA進(jìn)行梯度稀釋,以獲得的5個(gè)濃度的基因組DNA為模板,利用優(yōu)化后的反應(yīng)體系和通用反應(yīng)程序進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR,構(gòu)建轉(zhuǎn)基因大豆ZUTS-33品系特異性序列的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中ZUTS-33檢測(cè)反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的回歸系數(shù)R2、效率E、斜率、截距等所有指標(biāo)全部滿(mǎn)足了轉(zhuǎn)基因定量檢測(cè)的要求17(圖4)。表明Z

21、UTS-33檢測(cè)體系的Ct值與模板拷貝數(shù)間均具有良好的線(xiàn)性關(guān)系。2.5 準(zhǔn)確度、精確度和重復(fù)性測(cè)試為了驗(yàn)證建立的檢測(cè)方法是否具有良好的準(zhǔn)確度、精確度和重復(fù)性,利用預(yù)期轉(zhuǎn)基因質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.0%、1.0%、0.5%的轉(zhuǎn)基因大豆ZUTS-33材料基因組DNA對(duì)內(nèi)源基因Lectin和轉(zhuǎn)化體特異性序列進(jìn)行擴(kuò)增,計(jì)算多次測(cè)試的偏差(Bias)和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)以評(píng)估檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度、精確度和重復(fù)性。3次重復(fù)測(cè)試結(jié)果(表2)顯示3個(gè)濃度的偏差(Bias)均小于25%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation, RSD)均小于25%,說(shuō)明ZUTS-33檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度與精確度

22、均符合檢測(cè)的要求,重復(fù)性較好。圖4 ZUTS-33檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Table 2 Accuracy and precision test of ZUTS-33 detection method表2 ZUTS-33檢測(cè)方法準(zhǔn)確度和精確度測(cè)試轉(zhuǎn)化體預(yù)期濃度/%實(shí)驗(yàn)結(jié)果/%平均值/%BiasSDRSD/%重復(fù)1重復(fù)2重復(fù)35.04.684.784.794.755.000.061.281.00.950.870.960.937.000.055.320.50.470.440.420.4412.000.035.682.6 檢測(cè)極限和定量極限測(cè)試2.6.1 LOD測(cè)試為了確定本研究建立的檢測(cè)方法的LOD,分別

23、設(shè)置反應(yīng)體系中含20拷貝和10拷貝2種轉(zhuǎn)化體特異性序列對(duì)方法LOD進(jìn)行60個(gè)平行測(cè)試。測(cè)試結(jié)果(圖5)顯示,反應(yīng)體系中2種目標(biāo)濃度60個(gè)平行反應(yīng)均有擴(kuò)增信號(hào)。為有更好的適應(yīng)性,本方法LOD設(shè)定為20拷貝。圖5 ZUTS-33 LOD測(cè)試擴(kuò)增曲線(xiàn)2.6.2 LOQ測(cè)試為了確定本研究建立的檢測(cè)方法的LOQ,分別設(shè)置反應(yīng)體系中含40拷貝和20拷貝2種轉(zhuǎn)化體特異性序列對(duì)方法LOQ進(jìn)行15個(gè)平行測(cè)試。LOQ測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表3。當(dāng)反應(yīng)體系中含有20拷貝ZUTS-33轉(zhuǎn)化體特異性序列(相當(dāng)于ZUTS-33含量為0.045%)時(shí),15次測(cè)試結(jié)果的偏差為2.0%,小于25%;RSD為18.3%,小于25%。當(dāng)DNA

24、模板中含有40拷貝ZUTS-33轉(zhuǎn)化體特異性序列(相當(dāng)于ZUTS-33含量為0.09%)時(shí),15次測(cè)試結(jié)果的偏差為7.8%,小于25%;RSD為10.6%,小于25%。因此,由實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的驗(yàn)證估測(cè)本檢測(cè)方法的LOQ不高于20拷貝,為了有更好的適應(yīng)性,本方法LOQ設(shè)定為40拷貝。3 討論目前中國(guó)已經(jīng)批準(zhǔn)了12種轉(zhuǎn)基因大豆品系(A2704-12、DP356043、DP305423、GTS40-3-2、A5547-127、MON87705、MON89788、MON87751、DAS44406-6、DAS-81419-2、305323× GTS40-3-2、SYHT0H2)作為加工原料進(jìn)口。為

25、了規(guī)范轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的生產(chǎn)和銷(xiāo)售,正確引導(dǎo)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的消費(fèi),保護(hù)消費(fèi)者的知情權(quán),建立準(zhǔn)確、快速、高效的轉(zhuǎn)基因大豆檢測(cè)技術(shù)十分重要18-19。2019年上海交通大學(xué)的轉(zhuǎn)基因大豆SHZD32-01獲得了農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全證書(shū)農(nóng)基安證字(2019)第293號(hào),目前浙江大學(xué)自主研發(fā)的轉(zhuǎn)基因大豆品系ZUTS-33也進(jìn)入生產(chǎn)性試驗(yàn)。但到目前為止尚未發(fā)布針對(duì)該轉(zhuǎn)化體的檢測(cè)方法。Table 3 ZUTS-33 detection method LOQ test表3 ZUTS-33檢測(cè)方法LOQ測(cè)試轉(zhuǎn)化體預(yù)期濃度/拷貝15次測(cè)試結(jié)果平均值Bias/%SDRSD/%4043474243.17.84.610.63749

26、423735524642444342462027261920.42.03.718.3191915142121192321242216轉(zhuǎn)基因成分實(shí)行閾值標(biāo)識(shí)管理需要相應(yīng)的精準(zhǔn)定量檢測(cè)技術(shù)支持,目前,實(shí)時(shí)熒光定量PCR法被國(guó)內(nèi)外用作對(duì)轉(zhuǎn)基因成分定量檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”。本研究基于實(shí)時(shí)熒光PCR法,首先在轉(zhuǎn)基因大豆ZUTS-33外源基因插入位點(diǎn)旁側(cè)序列設(shè)計(jì)引物和探針并對(duì)引物和探針的適用性進(jìn)行確認(rèn),然后對(duì)獲得的候選引物和探針進(jìn)行條件優(yōu)化,最后對(duì)建立的方法從特異性、準(zhǔn)確度和精確度等方面進(jìn)行確認(rèn)。研究結(jié)果表明建立的轉(zhuǎn)基因大豆ZUTS-33轉(zhuǎn)化體特異性實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法具有良好的特異性、準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性,

27、方法的LOD為20拷貝,LOQ為40拷貝。本研究建立的轉(zhuǎn)g10-epsps基因耐除草劑大豆ZUTS-33定量檢測(cè)方法可為耐除草劑大豆ZUTS-33大豆及其衍生產(chǎn)品的精準(zhǔn)檢測(cè)、標(biāo)準(zhǔn)制定、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和試劑盒等衍生產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供技術(shù)支持。然而,實(shí)時(shí)熒光定量PCR作為一種相對(duì)定量方法也有其局限性,在定量過(guò)程中需要依賴(lài)標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)來(lái)達(dá)到對(duì)未知樣品的相對(duì)定量。數(shù)字PCR作為一種核酸絕對(duì)定量技術(shù),它最大的特點(diǎn)是無(wú)需借助標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)來(lái)實(shí)現(xiàn)定量目的,可以有效地解決實(shí)時(shí)熒光定量PCR法的局限性。本研究開(kāi)發(fā)的引物和探針具有良好的適用性和特異性,為開(kāi)發(fā)數(shù)字PCR定量檢測(cè)方法提供了研究基礎(chǔ)。1 國(guó)際農(nóng)業(yè)生物

28、技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織.2018年全球生物技術(shù)/轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化發(fā)展態(tài)勢(shì)J.中國(guó)生物工程雜志,2019,39(8):1-6.2 楊樹(shù)果.全球轉(zhuǎn)基因作物發(fā)展演變與趨勢(shì)J.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué),2020,25(9):13-26. 3 六月明,王秀秀,劉博,等.口岸重點(diǎn)監(jiān)控的轉(zhuǎn)基因棉花T304-40品系定量PCR檢測(cè)方法J.上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2016,32(5):145-154.4 劉津,李婷,冼鈺茵,等.轉(zhuǎn)基因大豆MON89788雙重?cái)?shù)字PCR通用定量檢測(cè)方法的建立J.食品科學(xué),2018,39(4):312-319.5 盧長(zhǎng)明.我國(guó)實(shí)施轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品定量標(biāo)識(shí)的對(duì)策與建議J.科技導(dǎo),2011,29(24):11.6 付

29、海濱,張敏,吳渺渺,等.轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)大豆MON87701品系實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法的建立J.遼寧農(nóng)業(yè)科學(xué),2016(4):23-26.7 劉國(guó)強(qiáng),海小,羅建興,等.基于TaqMan實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)植物中轉(zhuǎn)基因成分J.農(nóng)業(yè)與技術(shù),2020,40(10):4-9.8 袁俊杰,魏霜,龍陽(yáng).轉(zhuǎn)基因大豆MON87701和MON87708雙重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)技術(shù)的建立與應(yīng)用J.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),2020,28(2):342-248.9 謝實(shí)龍,汪小福,丁晨露,等.轉(zhuǎn)基因大豆MON89788實(shí)時(shí)熒光重組酶聚合酶擴(kuò)增檢測(cè)方法的建立J.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),2019,27(7):1301-1310.10 于曉帆,

30、高宏偉,孫敏,等.熒光PCR和數(shù)字PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因 DAS-44406-6 品系大豆J.食品科學(xué),2016,16(37):235-241.11 任怡菲,高琴,鄧婷婷,等.基于數(shù)字PCR的轉(zhuǎn)基因水稻LL62品系精準(zhǔn)定量檢測(cè)方法建立J.生物技術(shù)通報(bào),2016,32(8):69-76.12 繆青梅,汪小福,陳笑蕓,等.基于雙重微滴數(shù)字PCR精準(zhǔn)定量轉(zhuǎn)基因水稻 G6H1 的方法研究J.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),2019,27(1):159-169.13 郭慧,劉來(lái)盤(pán),沈文靜等.轉(zhuǎn)基因耐除草劑大豆ZUTS-33對(duì)田間生物多樣性的影響J.中央民族大學(xué)學(xué)報(bào),2020,5(2):21-26.14 MAZZARA Marco,MUNARO Barbara,LARCHE