1、Central Laboratory of Biology水體中大腸菌群的測定微生物學(xué)實驗【課前預(yù)習(xí)】1. 典型的大腸桿菌群菌落特征是什么？2. 食品中大腸菌群數(shù)測定的意義是什么？【目的要求】1. 學(xué)習(xí)和掌握大腸菌群的測定方法（多管發(fā)酵法）2. 了解測定過程中每一步的反應(yīng)原理。3. 了解大腸菌群的數(shù)量在飲水中的重要性 大腸菌群是一群能在37培養(yǎng)48h內(nèi)發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸、產(chǎn)氣的需氧或兼氧革蘭氏染色陰性無芽抱桿菌。以大腸桿菌為主，包括腸細菌屬、檸檬酸細菌屬、埃希氏菌屬和克雷伯氏菌屬等。 大腸菌群在腸道和糞便中數(shù)量非常高，且與腸道和糞便中的病原菌生活習(xí)性相近，可作為判斷樣品是否被人、畜糞便污染的標(biāo)志。

2、發(fā)酵法： 又稱多管發(fā)酵法或三步發(fā)酵法(此法是根據(jù)大腸菌群具有發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的特性，利用含乳糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)不同稀釋度的樣品經(jīng)初發(fā)酵、平板分離和復(fù)發(fā)酵3個檢測步驟，最后根據(jù)結(jié)果查最大自然數(shù)（most probable number）表，算出食品中的大腸菌群數(shù)。 ) 1) 初發(fā)酵（推測試驗）： 將不同稀釋度的水樣，分別接種于含有乳糖等糖類的培養(yǎng)液中（3倍或1倍乳糖培養(yǎng)基，視所加的水樣體積和培養(yǎng)基體積而定），經(jīng)37 C培養(yǎng)24 h，觀察產(chǎn)酸產(chǎn)氣情況，以初步判斷是否有大腸菌群存在。 發(fā)酵管內(nèi)裝有乳糖蛋白胨液體培養(yǎng)基，并倒置杜氏小套管。乳糖能起選擇作用，因為很多細菌不能發(fā)酵乳糖，而大腸菌群能發(fā)酵乳糖而產(chǎn)

3、酸產(chǎn)氣。為便于觀察細菌的產(chǎn)酸情況，培養(yǎng)基內(nèi)加有溴甲酚紫作為pH指示劑，細菌產(chǎn)酸后，培養(yǎng)基即由原來的紫色變?yōu)辄S色。溴甲酚紫還有抑制其他細菌如芽孢菌生長的作用。2）平皿分離（證實試驗） 水中除大腸菌群外，尚有其它細菌可能引起糖類發(fā)酵，因此需要進一步證實。 將初發(fā)酵管中已發(fā)酵的菌液接種于伊紅美蘭培養(yǎng)基，37 C培養(yǎng)24 h，根據(jù)菌落特征，挑取可能為大腸菌群的菌落制片，經(jīng)革蘭氏染色，進一步證實是否為大腸菌群。 平 板 培 養(yǎng) 基 使 用 伊 紅 美 藍 瓊 脂 （ e o s i n methyleneblue agar，EMB agar）。伊紅美藍瓊脂平板含有伊紅和美藍染料，在此亦作為指示劑，大腸菌

4、群發(fā)酵乳糖造成酸性環(huán)境時，該兩種染料即結(jié)合成復(fù)合物，使大腸菌群產(chǎn)生帶核心的、有金屬光澤的深紫色（龍膽紫的紫色）陽性菌落。初發(fā)酵管24h內(nèi)產(chǎn)酸產(chǎn)氣和48h產(chǎn)酸產(chǎn)氣的均需在以上平板上劃線分離菌落。3） 復(fù)發(fā)酵試驗(完成實驗） 將上述可能為大腸菌群的菌落再次轉(zhuǎn)接入1倍乳糖培養(yǎng)液中，經(jīng)37 C培養(yǎng)24 h，產(chǎn)酸產(chǎn)氣者即最后確證為存在大腸菌群。 產(chǎn)酸、產(chǎn)氣分別記為陽性反應(yīng)，不產(chǎn)酸、產(chǎn)氣則記為陰性反應(yīng)； 根據(jù)陽性管數(shù)量，查表求得水體大腸菌群的數(shù)量。1. 被檢樣品根據(jù)不同需要選擇檢檢樣品（如自來水、湖水等）2. 培養(yǎng)基乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基，伊紅美藍固體培養(yǎng)基，乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基3. 試劑革蘭氏染色液，芽孢染色液4

5、. 其它顯微鏡，天平，培養(yǎng)箱，水浴鍋，研缽，平皿，試管，刻度吸管，涂布器1水樣的采取（青山湖水，應(yīng)取距水面10-15cm的深層水樣，用滅菌帶玻璃塞的瓶子，瓶口向下侵入水中，然后翻轉(zhuǎn)過來，除去玻璃塞，水既流入瓶中，盛滿后，將瓶塞蓋好，再從水中取出）2湖水的檢查（1）初（步）發(fā)酵實驗 水樣的稀釋： 10-2、10-3 、10-4 （用無菌水稀釋） 接種：取0.5ml上三個稀釋度的水樣接入裝有4.5ml三倍濃縮乳糖蛋白胨發(fā)酵管（水樣的體積和培養(yǎng)液的體積由試管而定） ，混勻后，37 培養(yǎng)24 h。 水樣接種于發(fā)酵管內(nèi)，37下培養(yǎng)： （1）24h內(nèi)小套管中有氣體形成，并且培養(yǎng)基混濁，顏色改變，說明水中存

6、在大腸桿菌，疑為陽性結(jié)果； （2）在量少的情況下，也可能延遲48h后才產(chǎn)酸產(chǎn)氣，此時應(yīng)視為可疑結(jié)果。 以上兩種結(jié)果均需繼續(xù)做下面兩部分實驗，才能確定是否是大腸菌群。 （3）48h后仍不產(chǎn)氣的為陰性結(jié)果。（2）平板分離 將經(jīng)24 h培養(yǎng)后產(chǎn)酸產(chǎn)氣的發(fā)酵管，分別劃線接種于伊紅美藍瓊脂平板上，再于37 培養(yǎng)1824 h，將符合下列特征的菌落進行染色鏡檢。 深紫黑色，有金屬光澤； 紫黑色，不帶或略帶金屬光澤； 淡紫紅色，中心顏色較深。（3）復(fù)發(fā)酵試驗 將鏡檢為革蘭氏陰性無芽孢桿菌的菌株重復(fù)初步發(fā)酵試驗(利用乳糖蛋白胨培養(yǎng)液)。仍為產(chǎn)酸產(chǎn)氣者為大腸桿菌陽性。（4） 結(jié)果計算：根據(jù)三個稀釋度中陽性管數(shù)組成

7、一個數(shù)量指標(biāo)，查MPN計數(shù)表10-110ml1001ml1001ml10-11ml10-231111支各3支【實驗結(jié)果】1. 將實驗測出的各樣品大腸菌群數(shù)以報表方式報告結(jié)果。2. 對樣品大腸菌落數(shù)作出是否符合衛(wèi)生要求的結(jié)論。 【思考題】1. 在進行食品中大腸桿菌群數(shù)的測定時，為什么要進行復(fù)發(fā)酵試驗？2. 典型的大腸桿菌群菌落特征是什么？3. 食品中大腸菌群數(shù)測定的意義是什么？生物學(xué)實驗教學(xué)中心【課前預(yù)習(xí)】1. 典型的大腸桿菌群菌落特征是什么？2. 食品中大腸菌群數(shù)測定的意義是什么？【目的要求】1. 學(xué)習(xí)和掌握大腸菌群的測定方法（多管發(fā)酵法）2. 了解測定過程中每一步的反應(yīng)原理。3. 了解大腸菌群的數(shù)量在飲水中的重要性3） 復(fù)發(fā)酵試驗(完成實驗