1、核酸提取常見試劑的作用原理精品資料異硫氰酸胍強用力的蛋白質變性劑，能迅速溶解蛋白質，導致細胞結構破碎，核蛋白 由于其二級結構的破壞消失而迅速與核酸分離。胍鹽是破壞蛋白質三維結構的 離液劑，在通常使用的蛋白質變性劑中作用最強的是異硫氰酸胍，它們可以使 多數蛋白質轉換成一隨機的卷曲狀態。含有強力的陰離子和陽離子基團，它們 可以形成較強的氫鍵。在還原劑存在的情況下，異硫氰酸胍可以斷裂氫鍵，而 去垢劑，如SDS存在的情況下，可以破壞疏水作用。鹽酸胍、尿素鹽酸胍是一個核酸酶的強抑制劑，它并不是一種足夠強的變性劑，可以允 許完整的RNA從富含RNase的組織中提取出來。4-8M可斷裂氫鍵，有兩種可能機制：

2、1變性蛋白和鹽酸胍、尿素優先結 合，形成變性蛋白-變性劑復合物，當復合物被除去，從而引起 N-D反應平衡向 右移動，隨著變性劑濃度增加，天然狀態的蛋白不斷轉變為復合物，最終導致 蛋白質完全變性；2鹽酸胍、尿素對氨基酸的增溶作用，能形成氫鍵，當濃度 高時，能破壞水的氫鍵結構，結果鹽酸胍、尿素就稱為非極性殘基的較好溶 劑，使蛋白質內部的疏水殘基伸展和溶解性加強，鹽酸胍、尿素引起的變性往 往是不可逆的。高濃度尿素使蛋白質變性并抑制 Rn ase活性十二烷基肌氨酸鈉 使蛋白質解體 變性巰基試劑1防止蛋白質或酶等（如輔酶A）分子中SH基團氧化成二硫鍵，2在某些酶反應過程中維持體系的還原環境。DTT, D

3、DTE巰基乙醇應用最廣，谷胱甘肽也常應用，由于他是生物體內的還原劑，同時氧化后能被谷胱甘肽還原酶原位釋放。DNA提取中，常使用巰基乙醇，維持緩沖液的還原環境，防止多酚類氧化，由于具有一定的毒性，濃度不應高于2%我1常見的蔬詰試刑Fjbk 2 CommaHh1 ti»d thiol m；EcnhName分子式MoAecLjIarHIMMateuh weigH辯解J®ir Sduih 耶IWml._L柞濯庫 wnwntrrfjaniCjHtNSI3LI6燦iffCiH idO站IJUSl-JrakolZLHQ自i3*nMl*1-JmmoVL$沁571.103&7.W卓未

4、引口 Enzynwl啊 LA E FAX .BmM Smsitific (Si加帝族時.1 爭臨巰基乙醇B -巰基乙醇的主要作用是破壞 RNase蛋白質中的二硫鍵（肽和蛋白質分子中的半胱氨酸殘基中的鍵）1還原蛋白質二硫鍵，使 Rna酶變性2抑制酚類氧化，若氧化，核酸會變成灰黑色，苯酚的氧化產物苯醌等氧化物引起磷酸二酯鍵的斷裂及導致 RNA和DNA的交聯3保護蛋白質的巰基 蛋白質提取中需要巰基乙醇還原二硫鍵，使RNA酶失活化學變性劑SDS、尿素、鹽酸胍能破壞疏水鍵、鹽鍵、氫鍵、范德華力使蛋白質變性但不影響肽鍵和二硫鍵，不能使蛋白質徹底變性加上還原劑巰基乙醇或 DTT，能還原二硫鍵，使 RNA徹底

5、變性DTT二硫蘇糖醇刺激性氣味要小很多，毒性也比巰基乙醇低很多。而且DTT比巰基乙醇的濃度低7倍時，兩者效果相近，但DTT價格略高一些。由于容易被空氣氧化，因此 DTT的穩定性較差；但冷凍保存或在惰性氣體中處理能夠延長它的使用壽命。由于質子化的硫的親核性較低，隨著 pH值的降低，DTT的有效還原性也隨之 降低；DTT或含有DTT的溶液不能進行高壓處理。抑制Rnase活性TCEP三（2-甲酰乙基）膦鹽酸鹽半胱氨酸Trizol苯酚、異硫氰酸胍、8羥基喹啉、B -巰基乙醇等。TRIzol的主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解細胞，使細胞中的蛋白，核酸物質解聚得到釋放。苯酚雖可有效地變性蛋白質，但不能

6、完全抑制RNAB活性，因此TRIzol中還加入了 8羥基喹啉、異硫氰酸胍、B -巰基乙醇等來抑制內源和外源 RNase （ RNA 酶）。0.1%的8羥基喹啉可以抑制RNase與氯仿聯合使用可增強抑制作用。異硫氰酸胍屬于解偶劑，是一類強力的蛋白質變性劑，可溶解蛋白質并使蛋白 質二級結構消失，導致細胞結構降解，核蛋白迅速與核酸分離。B -巰基乙醇的主要作用是破壞RNase蛋白質中的二硫鍵。液氮組織破碎，裂解細胞SDS十二烷基硫酸鈉陰離子去垢劑，高溫(55-65 C )裂解細胞，使染色體離析，蛋白變性，形成 SDS/蛋白質/多糖復合物，釋放核酸，提高鹽(KAc或NaAc)濃度并降低溫度(冰浴)，使

7、SDS/蛋白質/復合物轉變為溶解度更小的鉀鹽酸形式，使蛋白質 及多糖雜質沉淀更加完全、離心后除去沉淀，上清液中的 DNA用酚/氯仿抽 提，乙醇沉淀水相中的DNA操作簡單，溫和，可提取到高分子量的 DNA，但產物多糖類雜質較多 陽離子強表面活性劑，通常與蛋白酶 K和抗氧化劑、螯合劑一起使用 可破壞細胞膜、核膜，并使組織蛋白與 DNA分離溶解膜類蛋白SDS能裂解細胞。使細胞中的蛋白質和核酸之間常借著靜電引力或配位鍵結 合，陰離子去污劑能夠破壞這種價鍵，使 染色體離析，蛋白變性，釋放核酸。(1) SDS是一種陰離子表面活性劑，能使蛋白質的氫鍵和疏水鍵打開，并結合 到蛋白質的疏水部位；(2) SDS可

8、引起蛋白質構象改變(3) SDS是一種良好的解離劑，可使蛋白質溶解，變性(4) 形成SDS-蛋白質復合物，并使復合物帶負電質粒方面：在1%的SDS溶液中慢慢加入5 N的NaCI，你會發現SDS在高鹽濃 度下是會產生沉淀的。因此高濃度的鹽導致了SDS的沉淀。但如果你加入的不是NaCI而是KCI，你會發現沉淀的量要多的多。這其實是十二烷基硫酸鈉(sodium dodecylsulfate遇到鉀離子后變成了十二烷基硫酸鉀(potassiumdodecylsulfate, PDS，而PDS是水不溶的，因此發生了沉淀。如此看來，溶液 III加入后的沉淀實際上是鉀離子置換了 SDS中的納離子形成了不溶性的

9、 PDS， 而高濃度的鹽，使得沉淀更完全。大家知道SDS專門喜歡和蛋白質結合，平均兩個氨基酸上結合一個SDS分子，鉀鈉離子置換所產生的大量沉淀自然就將絕 大部分蛋白質沉淀了，讓人高興的是大腸桿菌的基因組DNA也一起被共沉淀了。基因組DNA 一旦發生斷裂，只要是50100 kb大小的片斷，就沒有辦法 再被PDS共沉淀了CTABCTAB :十六烷基三甲基溴乙胺，低溫時易沉淀陽離子去污劑一種在高鹽下能和核酸結合形成可溶、穩定的復合物，低鹽濃度下可沉淀的表面活性劑是一種陽離子去污劑，低離子強度(0.1-0.5M NaCl)，沉淀核酸與酸性多聚糖, 而蛋白質和中性多聚糖仍留在溶液中。在高離子強度的溶液中

10、(>0.7mol/LNaCl)，CTAB與蛋白質和多聚糖形成復合物，只是不能沉淀核酸。通過有機溶 劑抽提，去除蛋白，多糖，酚類等雜質后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來。CTAB可從大量產生黏多糖的植物及某些革蘭氏陰性菌制備純化的 DNA，這種 去污劑加入調節至高離子強度的細菌和細胞裂解液中(> 0.7M NaCl)，經過連 續的酚/氯仿抽提，去除CTAB/黏多糖/蛋白質復合體，異丙醇/無水乙醇沉淀上 清即可將DNA分離出來CTAB還有提高DNA互補鏈復性速率及穩定已形成的 DNA雙螺旋的作用CTAB法的主要特點是用用較廣CTAB溶液在低于15度會形成沉淀析出，因此在將其加入冰冷的植物

11、材料時，必須預熱，且離心溫度不低于 15度EDTA酶抑制劑，螯合二價金屬，抑制金屬依賴性的酶螯合Mg2+或Mn2+離子，抑制細胞中DNase的活性，該酶可降解 DNAEDTA是去垢劑，結合離子用，而它結合的部分離子是能夠誘發或者促進 RNA 酶活性的，比如Ca2+。EDTA是一種二價離子熬合劑，能熬合Mg2+和Ca2+等 二價陽離子，而多種RNA酶的活性是需要依賴二價陽離子的，所以EDTA能通過 熬合二價陽離子來抑制RNA酶的活性堿性條件下才能夠溶解，要和 NaOH粉末混合后，再加水，然后用 NaOH水溶液 調節pH。0.01M，DNase酶基本失活。BSA酶抑制劑，使一些降解酶的活性的表面變

12、性精胺或其他多胺酶抑制劑，降低核酸酶的影響僅供學習與交流，如有侵權請聯系網站刪除 謝謝5精品資料氰化物酶抑制劑，降低重金屬氧化酶的影響PVP減少酚類、醌類、單寧類物質的影響，抗氧化作用，絡合多酚和萜類物質，防 止多酚類褐變而氧化，去除多糖和色素，色素是 PCR雖抑制劑，必須去除 樣品液氮研磨及提取緩沖液中加入 PVP或 PVPP等能絡合多酚和萜類物質，離心 或氯仿抽提出去，有效防止多酚氧化成醌類，避免溶液變褐色而具有抗氧化能 力提取液中加入適量的PVP或 PVPP能提高DNA勺純度，用量根據雜質而定(1- 6%，PVP同時能去除多糖，因此將PVP和巰基乙醇配合使用并調整用量，能 有效防止多酚污

13、染PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的絡合物，能與多酚形成一種不溶的絡合物質，有效去除多酚，減少DNA中酚的污染；同時它也能和多糖結合，有效去除多糖。Triton -x100Triton X100之類的去垢劑有苯環結構，所以在 280nm有很強的吸收蛋白酶K蛋白酶K:切割活性較廣的絲氨酸蛋白酶，切割脂族和芳香族氨基酸的羧基端肽鍵，將蛋白質降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分離出來。蛋白酶K在較廣的pH范圍內均有活性(pH 4-12.5 )溫度范圍37-60度 鹽濃度3M GuHCI或4M尿素中均有活性 在一些去污劑：Twee n20(5%) Trit on X-100 (1%)和SDS(1%條件

14、下也有活性。蛋白酶K消化裂解法適用于所有標本的消化處理，尤以 DNA羊品為佳.如組 織細胞(包括石蠟包埋組織)絨毛、毛發、精斑、血液(血清、血漿、全血)局部 分泌 物、尿，糞便等.蛋白酶K的一般工作濃度是50100卩g/ml蛋白酶(蛋白酶K或鏈酶蛋白酶)可以降解蛋白質,滅活核酸酶(DNase和RNase) ,DNase和RNase也用于去除不需要的核酸，有人使用蛋白酶替代 DEPC處理水的，但有些人說效果不好。蛋白酶K，威力巨大的廣譜蛋白酶，95C加熱10分鐘，則完全失活。數年 前首次使用它替代DEPC處理RNA抽提用的離心管和槍頭，效果不錯；后來又 用于處理RNase-Free的水，效果也是

15、一級棒。從此就再也不用DEPC 了。配制RNA裂解試劑時，直接用滅菌的雙蒸水配制，最后，加入蛋白酶K至終濃度1ug/ml。輕輕混勻，室溫放置15分鐘后即可。槍頭及離心管去除RNase：先將槍頭及離心管清洗干凈后，移入預先混好的含 1ug/ml蛋白酶K的雙蒸水，徹底浸入。室溫放置 30分鐘后，連水一起高壓 滅菌。棄水后，烘干即可。RNase-Free水的獲得：直接在滅菌的雙蒸餾水中加入蛋白酶K至終濃度1ug/ml。輕輕混勻，室溫放置15分鐘后，滅菌處理即可。該蛋白質的殘留對 后續實驗沒有可見的影響。無蛋白質殘留的RNase-Free水的獲得：這比較麻煩。直接在滅菌的雙蒸餾水 中加入蛋白酶K至終濃

16、度1ug/ml。輕輕混勻后，倒入專用的蒸餾器中。放置 15分鐘后，加熱蒸餾，流出的就是無蛋白質殘留的RNase-Free水。要提醒的是，該專用蒸餾器頭幾次流出來的水，只能當普通蒸餾水用，因為通道中難確 保RNase-Free的環境；另外，一定要主要密閉性，否則，流出的水又被污染 了。DNA裂解液的作用是破壞細胞膜、核膜，并使組織蛋白與DNA分離，抑制細胞中Dnase的活性，而蛋白酶k的作用是將蛋白質降解成小肽或氨基酸，使 DNA 分子完整地分離出來！ 溶菌酶 溶壁酶Dn aseRn ase多糖水解酶：水解多糖飽和酚酚是一種有機溶劑，預先要用STE緩沖液飽和，因未飽和的酚會吸收水相而帶走 一部分

17、核酸。酚也易氧化發黃，而氧化的酚可引起核酸鏈中磷酸二酯鍵斷裂或使 核酸鏈交聯：故在制備酚飽和液時要加入 82羥基喹嚀，以防止酚氧化。苯酚非極性分子水為極性分子使蛋白質變性，同時抑制了 DNase的降解作用。用苯酚處理勻漿液時，由于蛋白與DNA聯結鍵已斷，蛋白分子表面又含有很多極性基團與苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。使用酚的 優點：1有效變性蛋白質；2.抑制了 DNase的降解作用。能有效使蛋白質變性而出去，酚形成的有機相破壞蛋白質的膠體穩定性，從而蛋白質不會分布在水相中，避免核酸污染缺點：1能溶解10-15%的水，從而溶解一部分poly （A） RNA。2.不能完全抑制RN

18、ase的活性。酚變性大，但與水相有一定程度的互溶，大約10-15%的水溶在酚相中，使核酸損失 酚（Phenol）對蛋白質的變性作用遠大于氯仿，按道理應該用酚來最大程度將 蛋白質抽提掉，但是水飽和酚的比重略比水重，碰到高濃度的鹽溶液（比如 4M 的異硫氰酸胍），離心后酚相會跑到上層，不利于含質粒的水相的回收；但加 入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始終在下層，方便水相的回收；還有一 點，酚與水有很大的互溶性，如果單獨用酚抽提后會有大量的酚溶解到水相 中，而酚會抑制很多酶反應（比如限制性酶切反應），應此如果單獨用酚抽提 后一定要用氯仿抽提一次將水相中的酚去除，而用酚 /氯仿的混合液進行抽提， 跑到

19、水相中的酚則少得多，微量的酚在乙醇沉淀時就會被除干凈而不必擔心酶 切等反應不能正常進行。至于異戊醇的添加，其作用主要是為了讓離心后上下 層的界面更加清晰，也方便了水相的回收。氯仿非極性分子水為極性分子去除脂肪,使更多蛋白質變性，從而提高提取效率克服酚的缺點；加速有機相與液相分層。最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的跡量酚。（酚易溶于氯仿中）氯仿變性不如酚好，但與水不混溶，不會帶走 DNA因此混合使用最佳，經酚第一次抽提的水相有殘留的酚，由于酚和氯仿互溶， 可用氯仿第二次帶走酚，也可在第二次抽提中混合使用，比例為1:1苯酚/氯仿苯酚、氯仿抽提去除蛋白質非極性分子水為極性分子，當蛋白水溶液與他們混合時

20、，蛋白質分子見的水分 子被擠去，使蛋白失去水合狀態而變性，經離心，變性蛋白密度比對大，而與 水相分離，苯酚/氯仿比重大，保留在最下層苯酚氯仿 使蛋白質變性 量要足夠，因為苯酚去除蛋白是有一定的飽和度 的，超過飽和度，裂解體系中蛋白質不能被一次性去除，必須多次抽提。離心 后分三層，下層 有機層中有一些脂溶性的雜質，中間層白色絮狀沉淀是蛋白, 上清液中即含有核酸；變性后的蛋白質從水相中析出，位于苯酚中或苯酚與水相之間。異戊醇抽提DNA，為混合均勻，容易產生氣泡，氣泡會阻止相互間的充分作用，加入異戊醇降低分子表面張力，一般采用氯仿：異戊醇 =24： 1或酚：氯仿：異戊醇=25: 24： 1 （不必先

21、配置，臨用前加入即可）減少操作過程中產生的氣泡。減少蛋白質變性操作過程中產生的氣泡。異戊醇可以降低表面張力，從而減少氣泡產生。另外，異戊醇有助于分相，使離心后的上層含DNA的水相、中間的變性蛋白相及下層有機溶劑相維持穩定。NaCl提供一個高鹽環境，使DNA充分溶解于液相沉淀DNA時總會加入高濃度的鹽，加鹽的目的是破壞能使蛋白質保持穩定的兩個因素，使蛋白和DNA分離并沉淀下來.而此時鹽的陽離子會與DNA結合形成DNA-陽離子鹽溶于溶液中，再用無水乙醇可以將DNA-陽離子鹽沉淀下來提取DNA時先加0.14mol/L氯化鈉，因為在這種濃度的氯化鈉溶液中，DNA的溶解度最低，而蛋白質的溶解度增加，這樣

22、通過過濾能將DNA分離開，以除去蛋白質。再加入95%的酒精能使DNA沉淀，因為在這個濃度下 DNA溶解度 最低。如果直接加酒精不先加氯化鈉，DNA和蛋白質都能被酒精所沉淀，就無法將DNA和蛋白質分離開。所以必須先加氯化鈉后加酒精，順序不能顛倒。DNA溶液是DNA以水合狀態穩定存在，當加入乙醇時，乙醇會奪去 DNA 周圍的水分子，使DNA失水而易于聚合。這樣可以是 DNA沉淀出來在pH為 8左右的溶液中，DNA分子是帶負電荷的，加一定濃度的 NaAc或NaCl，使 Na+中和DNA分子上的負電荷，減少DNA分子之間的同性電荷相斥力，易于 互相聚合而形成DNA鈉鹽沉淀，當加入的鹽溶液濃度太低時，只

23、有部分DNA 僅供學習與交流，如有侵權請聯系網站刪除 謝謝9精品資料形成DNA鈉鹽而聚合，這樣就造成 DNA沉淀不完全，當加入的鹽溶液濃度太 高時，其效果也不好。在沉淀的 DNA中，由于過多的鹽雜質存在，影響 DNA 的酶切等反應，必須要進行洗滌或重沉淀。檸檬酸鈉它可以控制反應體系的離子強度，同時還有一定的緩沖作用，保證體系PH的相對穩定狀態，總之檸檬酸鈉在這里的作用類似于食物中的防腐劑。DEPC焦碳酸二乙酯，它通過和 RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環結合使蛋白質變 性，從而抑制酶的活性。與肝素何用效果增強。在Tris中不穩定，很快會分解為二氧化碳和乙醇。強烈但不徹底的RNA酶抑制劑0.1%濃

24、度Tris-HCl緩沖體系，使pH變化不會太大異丙醇加入異丙醇之后立即出現絮狀沉淀，我一直以為這是正確的，看了帖子才知道是蛋白質污染，異丙醇的沉淀效果要比無水乙醇的沉淀效果要好，但是異丙醇沉淀有一個弊端就是會沉淀下來好多的鹽和蛋白質這樣會影響下一步的操作，一般我加異丙醇 是等體積的效果還可以。70%乙醇70%乙醇洗滌DNA沉淀 個為在70%乙醇里DNA是不溶的，而鹽離子卻可溶），用無水乙醇則達不到這個目的！乙醇對于蛋白質、核酸的沉淀效應隨分子量加大而增大，小分子的核酸和蛋白質碎片是可以溶于 75%乙醇的。漂洗DNA是為了 去除殘余的鹽類，去除過量 SDS和酚等雜物，因為SDS在70%勺乙醇中保持溶解狀態，不與DNA共沉淀，從而通過棄上清液去除這種去污劑,避免對以后PCR 反應的影響。DEPC（焦碳酸二乙酯）：常用RNA酶抑制劑，與RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環結合使蛋白質變性，強烈但不徹底的RNA酶抑制劑 甲酰胺用高濃度甲酰胺替代苯酚從細胞裂解物的蛋白酶 K消化物中分離抽提D