1、金蕎麥葉保護(hù)酶與保護(hù)物質(zhì)對(duì)增強(qiáng)UV-B輻射及干旱脅迫處理的響應(yīng)第一作者簡(jiǎn)介：陸翔（1991-），男，浙江湖州人，生物專業(yè)，本科大四學(xué)生，從事植物相關(guān)研究。E-mail: 819895254，電話15257588124通信作者：張益鋒，博士，主要從事藥用植物保護(hù)研究。E-mail:zhangyifeng_007，電話翔，張益鋒(紹興文理學(xué)院元培學(xué)院生命科學(xué)系，浙江 紹興312000) 摘要 目的：研究金蕎麥葉保護(hù)酶與保護(hù)物質(zhì)對(duì)增強(qiáng)UV-B輻射及干旱脅迫處理的響應(yīng)，為其規(guī)范化種植提供科學(xué)依據(jù)。方法：采用盆栽試驗(yàn)的方法，測(cè)定金蕎麥在干旱和UV-

2、B輻射脅迫下超氧化物歧化酶 (SOD) 活性、過(guò)氧化物酶 (POD)活性、總黃酮含量、游離脯氨酸和可溶性蛋白含量。結(jié)果：在充足水分狀況下，增強(qiáng)的UV-B輻射提高了金蕎麥葉SOD活性、總黃酮含量、游離脯氨酸含量；增強(qiáng)的UV-B輻射在處理前期和后期提高了金蕎麥POD活性；增強(qiáng)的UV-B輻射在處理前期增加了金蕎麥葉可溶性蛋白含量。在干旱脅迫下，增強(qiáng)的UV-B輻射在處理中期提高了金蕎麥SOD活性，而在處理前期和后期卻降低了其SOD活性；增強(qiáng)的UV-B輻射在處理后期升高了金蕎麥葉POD活性；提高了金蕎麥葉游離脯氨酸和可溶性蛋白含量。結(jié)論：在干旱條件下，金蕎麥通過(guò)酶系統(tǒng)和保護(hù)物質(zhì)的調(diào)節(jié)減少脅迫帶來(lái)的不利影

3、響，增強(qiáng)試驗(yàn)設(shè)定強(qiáng)度的UV-B輻射在一定程度上有利于提高其對(duì)干旱的抗性。關(guān)鍵詞 金蕎麥；干旱脅迫；增強(qiáng)UV-B輻射；酶系統(tǒng)；保護(hù)物質(zhì)Response of the protective enzymes and protective substances of Fagopyrum dibotrys under enhanced UV-B radiation and drought stress LU Xiang,ZHANG Yifeng(School of Life and Sciences, Yuanpei College Shaoxing University, Shaoxing 31200

4、0, China)Abstract Objective: To study the influences of enhanced UV-B radiation in simulation and drought stress on the protective enzymes and protective substances of Fagopyrum dibotrys, and so as to provide a theoretical basis for the cultivation for F. dibotrys. Method: By experiment of potted pl

5、ant, we mensurated the SOD activity, POD activity, total flavonoids contents, free proline contents and soluble protein contents of F. dibotrys under different drought stresses and UV-B radiations. Result: In conditions of adequate water, enhanced UV-B radiation increased SOD activity, total flavono

6、ids contents and free proline contents of F. dibotrys. In the early and late stages of the treatment, POD activity of F. dibotrys was increased by enhanced UV-B radiation. In the early and late stages of the treatment, soluble protein contents of F. dibotrys was increased by enhanced UV-B radiation.

7、 In conditions of drought stress, enhanced UV-B radiation increased SOD activity of F. dibotrys in the medium-term of the treatment while decreased it in the early and late stages of the treatment. In the late stage of the treatment, enhanced UV-B radiation increased POD activity, free proline conte

8、nts and soluble protein contents of F. dibotrys. Conclusion: In conditions of drought stress, F. dibotrys reduce adverse effects by regulating protective enzyme system and protective substances, the enhanced UV-B radiation improve their resistance to drought to some extent.Key words Fagopyrum dibotr

9、ys; drought stress; enhanced UV-B radiation; enzyme system; protective substances據(jù)統(tǒng)計(jì)，在我國(guó)干旱、半干旱土地面積占全國(guó)總面積的47%。另一方面，臭氧量的減少帶來(lái)的后果是導(dǎo)致到達(dá)地表的UV-B輻射增強(qiáng)，而地表的UV-B輻射增強(qiáng)對(duì)植物造成很大影響。近年來(lái)，干旱脅迫與UV-B輻射的相互作用對(duì)植物的影響受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者重視，有研究表明干旱脅迫會(huì)減輕或掩蓋增強(qiáng)UV-B輻射對(duì)植物的不利影響1，也有相反的結(jié)論2。本文以廣泛栽培的藥用植物金蕎麥為材料，探討金蕎麥葉保護(hù)酶與保護(hù)物質(zhì)對(duì)增強(qiáng)UV-B輻射及干旱脅迫處理的響應(yīng)，不但有利于

10、深化兩種脅迫相互作用機(jī)理的認(rèn)識(shí)，進(jìn)一步拓展相關(guān)研究領(lǐng)域，而且可以為金蕎麥種植提供科學(xué)依據(jù)。1 材料與方法1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)同文獻(xiàn)3。1.2 測(cè)定方法取0.5 g葉片，精密稱重后按1:10 (w/v)比例加入預(yù)冷的酶提取液(0.1mmolL-1EDTA、0.3%(w/v) Triton X-100、4%(w/v) PVP、50mmolL-1pH 7.8L磷酸緩沖液)，在冰浴條件下充分研磨后，冷凍離心10500 × 20 min，取上清液冷藏備用。參照張志良21的法方測(cè)定超氧化物歧化酶 (SOD) 和過(guò)氧化物酶 (POD)活性；參照李芳蘭5的方法測(cè)定總黃酮含量；參照參照文獻(xiàn)6的法方測(cè)定游離

11、脯氨酸、可溶性蛋白。2 結(jié)果與分析2.1金蕎麥葉片保護(hù)酶活性對(duì)增強(qiáng)UV-B輻射及干旱脅迫處理的響應(yīng)圖1顯示的是金蕎麥葉SOD活性在增強(qiáng)UV-B輻射及不同干旱水平處理下的響應(yīng)。由圖可知，各處理組隨處理時(shí)間的增加有升高的趨勢(shì)。在不增強(qiáng)UV-B輻射的情況下在各時(shí)間點(diǎn)上都有T3T2T1，且各處理組間差異顯著，表明在不增強(qiáng)UV-B輻射的情況下，SOD活性隨干旱脅迫的增加而顯著上升。a、b、c表示每一處理時(shí)間同一UV-B輻射水平處理組間有顯著性差異；r和s表示每一處理時(shí)間同一干旱脅迫水平處理組間有顯著性差異(p<0.05)(圖25同)。圖 1金蕎麥葉SOD活性對(duì)增強(qiáng)UV-B輻射及干旱脅迫的響應(yīng)(平均

12、值+標(biāo)準(zhǔn)誤)在增強(qiáng)UV-B輻射的情況下，都有T6T5T4，第2050天時(shí)各處理組間差異顯著，表明在增強(qiáng)UV-B輻射的情況下，SOD活性隨干旱脅迫的增加而顯著上升。在充足水分狀況下，在各時(shí)間點(diǎn)上T4都要高于T1，處理中后期(3050天時(shí))達(dá)到顯著差異，表明在充足水分狀況下，增強(qiáng)的UV-B輻射在處理中后期顯著提高了SOD活性。在中度干旱脅迫下，第2040天時(shí)T5都要顯著高于T2，而第10，50天時(shí)T2都要顯著高于T5，表明在中度干旱脅迫下，增強(qiáng)的UV-B輻射在處理中期提高了SOD活性，而在處理前期和后期卻降低了SOD活性。在重度干旱脅迫下，第1040天時(shí)T6都要顯著高于T3，第50天時(shí)T3都要顯著

13、高于T6，表明在重度干旱脅迫下，增強(qiáng)的UV-B輻射在處理前中期提高了SOD活性，而在處理后期卻降低了SOD活性。經(jīng)過(guò)雙因素方差分析的有關(guān)增強(qiáng)UV-B輻射、干旱水平以及兩者交互作用對(duì)金蕎麥葉SOD活性的影響程度在表1中體現(xiàn)出來(lái)，和以上分析結(jié)果一致。圖2顯示的是金蕎麥葉POD活性在增強(qiáng)UV-B輻射及不同干旱水平處理下的響應(yīng)。由圖可知，POD活性隨著處理時(shí)間的增加有先升高后下降的趨勢(shì)。在不增強(qiáng)UV-B輻射條件下，在各時(shí)間點(diǎn)上都有T3T2T1，第30天時(shí)各組處理間差異顯著，第10，40，50天時(shí)，只有T1和T3差異顯著，第20天時(shí)，只有T1和T2差異顯著，表明在不增強(qiáng)UV-B輻射條件下，POD活性隨干

14、旱脅迫的加重而升高的趨勢(shì)，在處理中期尤為明顯。在增強(qiáng)UV-B輻射條件下，基本都有圖 2金蕎麥葉POD活性對(duì)增強(qiáng)UV-B輻射及干旱脅迫的響應(yīng)(平均值+標(biāo)準(zhǔn)誤)T6T5T4，第30，40天時(shí)各處理組間差異顯著，第20天時(shí)T4和T5無(wú)顯著差異，第50天時(shí)各處理組無(wú)顯著差異，表明在增強(qiáng)UV-B輻射條件下，POD活性隨干旱脅迫的加重而升高的趨勢(shì)，在處理中期尤為明顯。在充足水分狀況下各時(shí)間點(diǎn)上都有T4T1，顯著差異只在第10，50天時(shí)達(dá)到，表明在充足水分狀況下，增強(qiáng)的UV-B輻射升高了POD活性，在處理前期和后期尤為明顯。在中度干旱脅迫下，第1030天時(shí)T2和T5無(wú)顯著差異，第40，50天時(shí)，T5要顯著高

15、于T2，表明在中度干旱脅迫下，增強(qiáng)的UV-B輻射在處理后期升高了POD活性。在重度干旱脅迫下情況和中度干旱脅迫類似，即增強(qiáng)的UV-B輻射在處理后期升高了POD活性。經(jīng)過(guò)雙因素方差分析的有關(guān)增強(qiáng)UV-B輻射、干旱水平以及兩者交互作用對(duì)金蕎麥葉POD活性的影響程度在表1中體現(xiàn)出來(lái)，和以上分析結(jié)果一致。2.2金蕎麥葉片保護(hù)物質(zhì)含量對(duì)增強(qiáng)UV-B輻射及干旱脅迫處理的響應(yīng)圖3顯示的是金蕎麥葉總黃酮含量在增強(qiáng)UV-B輻射及不同干旱水平處理下的響應(yīng)。由圖可知，總體上各處理組隨處理時(shí)間的增加有先緩慢上升后緩慢下降的趨勢(shì)。在不增強(qiáng)UV-B輻射條件下，在各時(shí)間點(diǎn)上都有T3T2T1，第20天時(shí)各處理組差異達(dá)到顯著水

16、平，其它時(shí)間點(diǎn)上，只有T3和T2差異不顯著，這表明在不增強(qiáng)UV-B輻射條件下，總黃酮含量隨干旱脅迫程度加重而升高，顯著差異只在充足水分和干旱脅迫間達(dá)到。在增強(qiáng)UV-B輻射條件下情況和不增強(qiáng)UV-B輻射條件類似，即總黃酮含量隨干旱脅迫程度加重而升高，而顯著差異只在充足水分和干旱脅迫間達(dá)到。在充足水分狀況下，T4在各時(shí)間點(diǎn)上都要顯著高于T1，表明在充足水分狀況下，增強(qiáng)的UV-B輻射顯著提高了總黃酮含量。圖 3金蕎麥葉總黃酮含量對(duì)增強(qiáng)UV-B輻射及干旱脅迫的響應(yīng)(平均值+標(biāo)準(zhǔn)誤)在中度干旱脅迫下，T2和T5在各時(shí)間點(diǎn)上都無(wú)顯著差異，表明在中度干旱脅迫下總黃酮含量對(duì)增強(qiáng)的UV-B輻射不敏感。在重度干旱

17、脅迫下，T2和T5只在第40天時(shí)有顯著差異，表明在重度干旱脅迫下，不增強(qiáng)UV-B輻射條件類似，即總黃酮含量隨干旱脅迫程度加重而升高，而顯著差異只在充足水分和干旱脅迫間達(dá)到。在充足水分狀況下，T4在各時(shí)間點(diǎn)上都要顯著高于T1，表明在充足水分狀況下，增強(qiáng)的UV-B輻射顯著提高了總黃酮含量。在中度干旱脅迫下，T2和T5在各時(shí)間點(diǎn)上都無(wú)顯著差異，表明在中度干旱脅迫下總黃酮含量對(duì)增強(qiáng)的UV-B輻射不敏感。在重度干旱脅迫下，T2和T5只在第40天時(shí)有顯著差異，表明在重度干旱脅迫下，不增強(qiáng)UV-B輻射條件類似，即總黃酮含量隨干旱脅迫程度加重而升高，而顯著差異只在充足水分和干旱脅迫間達(dá)到。在充足水分狀況下，T

18、4在各時(shí)間點(diǎn)上都要顯著高于T1，表明在充足水分狀況下，增強(qiáng)的UV-B輻射顯著提高了總黃酮含量。在中度干旱脅迫下，T2和T5在各時(shí)間點(diǎn)上都無(wú)顯著差異，表明在中度干旱脅迫下總黃酮含量對(duì)增強(qiáng)的UV-B輻射不敏感。在重度干旱脅迫下，T2和T5只在第40天時(shí)有顯著差異，表明在重度干旱脅迫下，中度干旱脅迫下總黃酮含量對(duì)增強(qiáng)的UV-B輻射不甚敏感。經(jīng)過(guò)雙因素方差分析的有關(guān)增強(qiáng)UV-B輻射、干旱水平以及兩者交互作用對(duì)金蕎麥葉總黃酮含量的影響程度在表1中體現(xiàn)出來(lái)，和以上分析結(jié)果一致。圖 4金蕎麥葉游離脯氨酸含量對(duì)增強(qiáng)UV-B輻射及干旱脅迫的響應(yīng)(平均值+標(biāo)準(zhǔn)誤)圖4顯示的是金蕎麥葉游離脯氨酸含量在增強(qiáng)UV-B輻

19、射及不同干旱水平處理下的響應(yīng)。由圖可知，各處理組隨著處理時(shí)間的增加而有先升高后降低的趨勢(shì)。在不增強(qiáng)UV-B輻射條件下，第1040天時(shí)，基本都有T3T2T1，差異顯著，第50天時(shí)， T2要顯著高于T1和T3，T1和T3差異不顯著，這表明在不增強(qiáng)UV-B輻射條件下，在處理前中期游離脯氨酸含量隨干旱脅迫的加重而上升，在處理后期則無(wú)明顯規(guī)律。在增強(qiáng)UV-B輻射條件下，情況和不增強(qiáng)UV-B輻射類似。在充足水分狀況下，在各時(shí)間點(diǎn)上T1都要顯著低于T4，表明，在充足水分狀況下，增強(qiáng)的UV-B輻射提高了游離脯氨酸含量。在中度干旱脅迫下情況和在充足水分狀況類似。在重度干旱脅迫條件下，第10天時(shí)，T3要顯著高于T

20、6，第30天時(shí)，T6要顯著高于T3，在其它時(shí)間點(diǎn)上，差異不顯著，表明在重度干旱脅迫條件下，增強(qiáng)的UV-B輻射對(duì)游離脯氨酸的影響無(wú)明顯規(guī)律。經(jīng)過(guò)雙因素方差分析的有關(guān)增強(qiáng)UV-B輻射、干旱水平以及兩者交互作用對(duì)金蕎麥葉游離脯氨酸含量的影響程度在表1中體現(xiàn)出來(lái)，和以上分析結(jié)果一致。圖5顯示的是金蕎麥可溶性蛋白含量在增強(qiáng)UV-B輻射及不同干旱水平處理下的可塑性響應(yīng)。由圖可知，各處理組隨處理時(shí)間的增加大體有先上升后下降的趨勢(shì)（T1一直上升）。在增強(qiáng)UV-B輻射條件下類似在不增強(qiáng)UV-B輻射條件時(shí)，圖 4金蕎麥葉可溶性蛋白含量對(duì)增強(qiáng)UV-B輻射及干旱脅迫的響應(yīng)(平均值+標(biāo)準(zhǔn)誤)可溶性蛋白含量在處理前期隨干

21、旱脅迫的加深而升高，而到處理后期則隨干旱脅迫的加深而降低。在充足水分狀況下，第10，20天時(shí)有T6T3，在第20天時(shí)差異不顯著，第3050天時(shí)有T3T6，顯著差異只在第50天時(shí)達(dá)到，表明在充足水分狀況下，增強(qiáng)的UV-B輻射在處理前期增加了可溶性蛋白含量，而在后期則減小了可溶性蛋白含量。在中度干旱脅迫下，在各時(shí)間點(diǎn)上都有T5T2，顯著差異在第1050天時(shí)達(dá)到，表明在中度干旱脅迫下，增強(qiáng)的UV-B輻射提高了可溶性蛋白含量，在處理前期和后期尤為顯著。在重度干旱脅迫下，第1040天時(shí)，基本都有T6T3，顯著差異在第10，30天時(shí)達(dá)到，而在第50天時(shí)，T3要顯著高于T6，表明在重度干旱脅迫下，增強(qiáng)的UV

22、-B輻射在處理前中期增加了可溶性蛋白含量，而在后期則減小了可溶性蛋白含量。經(jīng)過(guò)雙因素方差分析的有關(guān)增強(qiáng)UV-B輻射、干旱水平以及兩者交互作用對(duì)金蕎麥葉可溶性蛋白含量的影響程度在表1中體現(xiàn)出來(lái)，和以上分析結(jié)果一致。表1 增強(qiáng)UV-B輻射及干旱水平處理對(duì)金蕎麥保護(hù)酶和保護(hù)物質(zhì)特征影響的方差分析指標(biāo)影響因子處理時(shí)間 (d)1020304050超氧化物歧化酶活性UV-B*G*UV-B × G*過(guò)氧化物酶活性UV-Bn.s.*n.s.*G*UV-B × G*n.s.n.s.*n.s.總黃酮含量UV-Bn.s.n.s.n.s.*n.s.G*UV-B × G*n.s.n.s.n

23、.s.n.s.游離脯氨酸含量UV-Bn.s.*G*UV-B × G*n.s.*n.s.可溶性蛋白質(zhì)含量UV-B*n.s.n.s.*G*注：G.干旱；n.s.不顯著；*.顯著性概率p<0.05；*.顯著性概率p<0.01；*.顯著性概率 p<0.001。3 討論當(dāng)植物受到干旱和UV-B輻射增強(qiáng)等脅迫時(shí)，會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧(active oxygen)，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)、膜脂、DNA及其它細(xì)胞組分的嚴(yán)重?fù)p傷。植物自身酶保護(hù)系統(tǒng)和非酶保護(hù)系統(tǒng)的成員協(xié)同作用使細(xì)胞內(nèi)的活性氧維持在較低水平才能確保其正常生長(zhǎng)和代謝7。超氧化物歧化酶(SOD)和過(guò)氧化物酶(POD)是酶保護(hù)系統(tǒng)的重

24、要成員，能有效地清除自由基。黃酮類物質(zhì)能清除活性氧已經(jīng)得到越來(lái)越多的學(xué)者證實(shí)8,9。游離脯氨酸是植物體內(nèi)有效的非酶類抗氧化物質(zhì)35，能有效清除羥自由基，和可溶性蛋白一樣作為滲透調(diào)節(jié)物在植物體內(nèi)積累對(duì)抵抗逆境具有重要作用11。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)金蕎麥SOD活性、總黃酮含量隨干旱脅迫的增加而顯著上升；POD活性隨干旱脅迫的加深而升高，在處理中期達(dá)到顯著水平，而在處理前期和后期，這種影響似乎有減弱的趨勢(shì)；在處理前中期游離脯氨酸含量隨干旱脅迫的加重而上升，在處理后期則無(wú)明顯規(guī)律；金蕎麥可溶性蛋白含量在處理前期隨干旱脅迫的加深而升高，而到處理中后期則隨干旱脅迫的加深而降低。以上結(jié)果基本證實(shí)了前人有關(guān)干旱脅迫

25、對(duì)植物保護(hù)酶和保護(hù)物質(zhì)影響的觀點(diǎn)。在充足水分狀況下，增強(qiáng)的UV-B輻射處理提高了金蕎麥葉SOD活性、總黃酮含量、游離脯氨酸含量；增強(qiáng)的UV-B輻射在處理前期和后期升高了金蕎麥POD活性；增強(qiáng)的UV-B輻射在處理前期增加了金蕎麥葉可溶性蛋白含量，而在后期則減小了金蕎麥和蕎麥葉可溶性蛋白含量。Pastori and Trippi12認(rèn)為植物不僅具有抵抗某種境脅迫的能力，而且具有抵抗其它逆境的能力，即交叉抗性，這種交叉抗性與植物體內(nèi)活性氧清除系統(tǒng)存在密切關(guān)系。本研究表明，在干旱脅迫下，增強(qiáng)的UV-B輻射在處理中期提高了金蕎麥SOD活性，而在處理前期和后期卻降低了其SOD活性，UV-B輻射和干旱脅迫導(dǎo)

26、致金蕎麥葉O2-·在中期積累較多，兩種脅迫的傷害在中期可能有累加效應(yīng)，同時(shí)需要更高的SOD活性來(lái)清除O2-·，在處理前期和中期則相反，增強(qiáng)的UV-B輻射緩解了干旱脅迫導(dǎo)致的O2-·積累；增強(qiáng)的UV-B輻射在處理后期升高了金蕎麥葉POD活性；增強(qiáng)的UV-B輻射提高了金蕎麥葉游離脯氨酸含量；在中度干旱脅迫下，增強(qiáng)的UV-B輻射提高了金蕎麥葉可溶性蛋白含量，而在重度干旱脅迫下，增強(qiáng)的UV-B輻射在處理前中期提高了金蕎麥葉可溶性蛋白含量，而在后期則減小了其葉可溶性蛋白含量。因此，本研究認(rèn)為，酶保護(hù)系統(tǒng)或非酶保護(hù)系統(tǒng)在植物受到脅迫的反應(yīng)靈敏度是可能因植物本身特性、脅迫強(qiáng)度、

27、脅迫時(shí)間差異而不同。參考文獻(xiàn)1 晏斌, 戴秋杰. 紫外線B對(duì)水稻葉組織中活性氧代謝及膜系統(tǒng)的影響J. 植物生理學(xué)報(bào), 1996, 22(4): 373-378.2 Rao M V, Paliyath G, Ormrod D P. Ultraviolet-B and ozone-induced biochemical changes in antioxidant enzymes of Arabidopsis thalianaJ. Plant Physio, 1996, 110(1): 125.3 張益鋒, 何平, 張春平. 干旱及增強(qiáng)UV-B脅迫對(duì)金蕎麥生物量積累與分配的影響J. 中國(guó)中藥雜志201136(15): 2032-2037.4 張志