1、專題五血紅蛋白的提取和分離【知識框架】1 .分離不同種類蛋白質(zhì)可以利用蛋白質(zhì)各種特性的差異， 如分子的? 所帶電荷的?>和對其他分子的等。凝膠色譜法也稱做，是根據(jù) 分離蛋白質(zhì)的有效方法；電泳是指帶電粒子在 的作用下發(fā)生的過程，許多重要的生物大分子，如、等都具有, 在下，這些基團會帶上, 在電場的作用下，這些帶電分子會 向著與其所帶電荷 的電極移動。電泳利用了待分離樣品中各種分子的差異以及 、的不同，使帶電粒子產(chǎn)生不同的,從而實現(xiàn)樣品中各種分子的分離。常用的電泳法有 由泳和也泳。蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠電泳中的遷移率取決于 以及 等因素。在測蛋白質(zhì)分子量（純度鑒定）時通常使用 電泳。2 .當

2、相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)通過瓊脂凝膠層析時，相對分子質(zhì)量 的蛋 白質(zhì)容易進入凝膠內(nèi)部，路程較，移動速度；而相對分子質(zhì)量大的蛋白 質(zhì)無法進入凝膠內(nèi)部，路程較，移動速度，導致相對分子質(zhì)量小的 流 出，相對分子質(zhì)量大的 流出，相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)因此得以分離。3 .蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步： 、粗分離、和。 （1）樣品（哺乳動物的血液）處理和粗分離樣品處理和粗分離的過程為：一 一一。紅細胞的洗滌：目的：去除;方法： 離心。采集血樣前，盛血容器中需預先加入 作為,以防止0 米血后應及時分離 和, 分離方法米用（500r/min離心10min）,分離后，去除 層透明的黃色血漿，將層色紅細胞倒入

3、燒杯，加入 儕體積的,緩慢攪拌10min,低速短時間離心，如此重復洗滌三次以上，直至表明紅細胞已洗滌干凈。洗滌紅細胞時，洗滌次數(shù)過少，無法將全部除去，如果血液樣品離心后分層不明顯，可能原因是;離心速度過 一 和時間過,會使白細胞和淋巴細胞一同沉淀，得不到 的紅細胞，影響后續(xù)提取的血紅蛋白的。血紅蛋白的釋放：將已洗滌干凈的紅細胞倒入燒杯， 加 到原血液的體積，使紅細胞攪拌器上充分攪拌 白。分離血紅蛋白溶液： 度進行局速離心10 min第1層（最上層）： 第2層（中上層）：第3層（中下層）：第4層（最下層）： 將試管中的液體用再加40%加積的,使 溶解，置于10分鐘（加速細胞破裂），紅細胞破裂釋放

4、出血紅蛋將攪拌好的混合液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，以2000r/min的速,離心管中的溶液從上往下分為 4層：的層的沉淀層，色薄層固體的水溶液層，的液體其它雜質(zhì)的沉淀層_過濾、這去, 這中靜置片刻后，分離出下層的。粗分離：即。將裝有血紅蛋白溶液的透析袋放入pH為7.0的中,透析12h,透析的原理是,透析的目的是。（2）血紅蛋白的純化一一凝膠色譜法（層析）制作色譜柱：柱體是長 40cmi內(nèi)徑1.6cm的玻璃管，柱頂部插入安裝了 的橡皮塞，柱底部插入安裝了 （帶頭部）的橡皮塞（橡皮塞上 部切成鍋底狀凹穴），在橡皮塞中安裝移液管時，移液管上部 （必'需/不 能）超過橡皮塞凹穴底面，凹穴上覆蓋尼龍網(wǎng)，再

5、用尼龍紗將橡皮塞上部包好插 入柱體的下端，移液管頭部作為出口部位，連接細尼龍管，用螺旋夾控制尼龍管 的打開與關閉。裝填凝膠色譜柱：商品凝膠使用前直接放在 中膨脹，并用將加入洗脫液的 加熱至接近沸騰，這種方法既加速凝膠膨脹，又除去凝膠中可能帶有的 和排除凝膠顆粒內(nèi)的 。因為干的凝膠和用緩沖液（洗脫液）平衡好的凝膠的體積差別 （不大/很大），所以裝 柱前需要根據(jù)色譜柱的內(nèi)體積計算。交聯(lián)葡聚糖凝膠（SephadexG-75 白"G表示凝膠的?及, “75”表示凝膠的得水值，即每克凝膠膨脹時吸水 go 凝膠裝填色譜柱時，色譜柱下端連接的尼龍管應 仔T開/關閉），將配制 好的凝膠懸浮液 （一次

6、性/分多次）緩慢倒入色譜柱內(nèi)，期間（可 以/不能）輕微抖動色譜柱，使凝膠裝填均勻，凝膠色譜柱內(nèi)不得有 存在，否則會攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的,降低。 一旦發(fā)現(xiàn)凝膠柱內(nèi)有氣泡，必需 。凝膠裝填完畢，立即連接盛有 （pH為7.0 ）的洗脫瓶，在50cm高的操作壓下充分洗滌平衡，使凝膠裝填緊密。樣品的加入和洗脫：加樣前，打開色譜柱下端的流出口，讓色譜柱內(nèi)凝 膠面上的緩沖液緩慢下降，當緩沖液緩慢下降到 時關閉出口，然后按照下圖順序加樣，最后連接裝有緩沖液的洗脫瓶進行洗脫， 待紅色 蛋白液接近色譜柱底部時，用試管收集流出液，每試管 mL如果凝膠色譜柱裝填成功、分離操作正確，能清楚地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶 &g

7、t;? 地隨著洗脫液緩慢流出，反之，如果凝膠色譜柱的裝填不好，紅色區(qū)帶?,分離效果不好。通過凝膠色譜（層析）除去透析后的血紅蛋白溶液中的。吸臂口沿管 壁環(huán)繞移動， 貼書菅壁捫樣(3)純度鑒定：判斷 的蛋白質(zhì)是否達到要求，需要進行蛋白質(zhì)純度的鑒定。在鑒定的方法中，使用最多的是。十二烷基硫酸鈉(SDS能與各種蛋白質(zhì)形成“蛋白質(zhì)一SD雙合體”，SDS所帶負電荷的量 大大超過蛋白質(zhì)分子的電荷量，掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間的電荷差異， 電泳時，蛋 白質(zhì)的遷移速率完全取決于 2蛋白質(zhì)由點樣孔向 極遷移,點樣孔在極一端；SDStt使蛋白質(zhì)發(fā)生完全變性，多肽鏈蛋白質(zhì)解聚成單條肽鏈，因此，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測定

8、的結(jié)果是 的分子量。將純化的血紅蛋白樣品與若干已知 分子量的標準蛋白分別加入到電泳裝置上槽的點樣孔中，電泳后，觀察血紅蛋白條帶與標注蛋白條帶的位置， 可確定提 取的蛋白質(zhì)的分子量。圖甲的上、下槽中加入 ,上、下才©之間是比較圖乙條帶蛋白質(zhì)的分子量大小：4 .血紅蛋白的提取和分離常見試劑及其作用：檸檬酸鈉： ; 生理鹽水： ;蒸儲水：使紅細胞 ; 40%勺甲苯溶液： ;磷酸緩沖溶液：維持pH穩(wěn)定，使血紅蛋白的不受破壞。5 .緩沖溶液能夠在一定的范圍內(nèi)，能抵制外來 對溶液 的影響，維持基本不變，緩沖溶液通常由 種緩沖劑溶解于水中配制而成。調(diào)緩緩沖劑的 就可以制得 使用的緩沖液。【核心要點

9、】1.凝膠色譜層析法項目蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)里人相對分子質(zhì)量小凝膠內(nèi)部不能進入能進入運動方式垂直向卜垂直向卜和無規(guī)則擴散運動經(jīng)過路程較短較長洗脫次序先流出后流出2.電泳法原理在一定pH下，蛋白質(zhì)分子的某些基團解離后帶上正電或負電。在電場的 作用下，帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極移動。由于待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小、形狀的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實現(xiàn)樣品中各種分子的分離。3 .比較瓊脂糖凝膠電泳和SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(1)從載體上看，利用瓊脂糖凝膠作為載體的是瓊脂糖凝膠電泳，利用聚丙 烯酰胺凝膠作為載體的是SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。(2)從依據(jù)上看，利用了分子帶電性質(zhì)差異和分子大小的是瓊脂糖凝膠電泳， 僅利用了分子大小的是SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。(3)從優(yōu)點上看，瓊脂糖凝膠電泳操作簡單，電泳速度快，樣品不需處理， 電泳圖譜清晰，分辨率高，重復性好；SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳消除了凈電荷對 遷移率的