1、會計學1第一頁，共81頁。1.1.蛋白質互作研究的意義蛋白質互作研究的意義2.2.蛋白質互作（事例蛋白質互作（事例(shl)(shl)）3.3.細胞內蛋白質標記細胞內蛋白質標記4.4.其他進展其他進展References：Bruce Alberts et al, Molecular Biology of the Cell (5th edition), Garland Science Erica Golemis et al, Protein-protein InteractionA Molecular Cloning Manual papers第1頁/共80頁第二頁，共81頁。1.1.蛋白質互作

2、研究蛋白質互作研究(ynji)(ynji)的意義的意義(Importance)(Importance)生命活動生命活動 細胞活動細胞活動: : 基因基因(jyn)(jyn)是關是關鍵鍵基因(jyn)表達調控與其它分子結合: 信號轉導轉錄蛋白質:修飾翻譯蛋白作用蛋白作用單個蛋白: 較少蛋白復合體動態動態蛋白質相互作用蛋白質相互作用: 結構結構, 最具挑戰性最具挑戰性第2頁/共80頁第三頁，共81頁。分子分子(fnz)(fnz)水平：水平：基因組基因組DNADNA：基因重排，：基因重排，IgIg多樣性多樣性 基因序列多樣性（基因序列多樣性（Science. 2004Science. 2004，30

3、5:251-254 305:251-254 ），），抵抗抵抗 不同病原（低等動物）等作用不同病原（低等動物）等作用 DNA DNA修飾，甲基化（修飾，甲基化（epigenomicsepigenomics），），S S修飾等修飾等mRNAmRNA：啟動子，：啟動子，ChIPChIP，EMSAEMSA 非編碼小非編碼小RNARNA（siRNAsiRNA，miRNAmiRNA，piRNApiRNA）（）（epigenomicsepigenomics）蛋白質：蛋白質互作（蛋白質組學）蛋白質：蛋白質互作（蛋白質組學） 蛋白質結構（工具，生物信息學）蛋白質結構（工具，生物信息學） 蛋白質標記（細胞固定，活

4、細胞標記）蛋白質標記（細胞固定，活細胞標記） 異構體異構體第3頁/共80頁第四頁，共81頁。第4頁/共80頁第五頁，共81頁。第5頁/共80頁第六頁，共81頁。2.2.蛋白質互作蛋白質互作（protein-protein protein-protein interactioninteraction）事例事例(shl)(shl)第6頁/共80頁第七頁，共81頁。病毒病毒- -對蝦蛋白對蝦蛋白(dnbi)(dnbi)互作互作 經濟模式動物經濟模式動物White spot syndrome virus (WSSV)White spot syndrome virus (WSSV)對蝦對蝦: 無脊椎動物

5、無脊椎動物(jzhudngw)，僅有先天性免疫系統，僅有先天性免疫系統, 無無特異性免疫特異性免疫體表(t bio)阻擋細胞系統：吞噬細胞、細胞凋亡 體液防御系統：干擾素、抗病毒肽、凝集素等 無脊椎動物無脊椎動物免疫系統免疫系統1)1)概述概述開始研究前，必須了解研究背景開始研究前，必須了解研究背景第7頁/共80頁第八頁，共81頁。（1）模式識別：模式識別因子（2）信號轉導：受體藕聯蛋白(dnbi) 信號轉導（3）抗病毒效應：干擾素,抗病 毒肽,細胞凋亡,細胞吞噬。蛋白質互作蛋白質互作非特異性免疫非特異性免疫(miny)第8頁/共80頁第九頁，共81頁。特異性免疫特異性免疫(miny)Natu

6、re 2005, 434: 27蛋白質互作蛋白質互作如何如何(rh)(rh)開始研開始研究究? ?第9頁/共80頁第十頁，共81頁。抗病對蝦：mRNA差異顯示(xinsh)技術（DD-PCR），抑制差減雜交，親和層析36842751970個對蝦抗病相關基因(jyn)，其中30個新基因(jyn)2)2)對蝦抗病毒相關功能對蝦抗病毒相關功能(gngnng)(gngnng)基因篩選基因篩選第10頁/共80頁第十一頁，共81頁。Rab6: Rab6: 抗病毒對蝦中上調表達抗病毒對蝦中上調表達 說明說明(shumng)(shumng)在抗病毒免疫反應中起在抗病毒免疫反應中起作用作用 重要的小重要的小G

7、G蛋白蛋白第11頁/共80頁第十二頁，共81頁。小小G G蛋白蛋白(dnbi): GTPase, 20-25 (dnbi): GTPase, 20-25 kDakDa5 5個家族個家族Ras: Ras: 細胞生長調節細胞生長調節Rho: actinRho: actin細胞骨架重組細胞骨架重組, , 基因表達調控基因表達調控Rab: Rab: 膜性顆粒膜性顆粒(kl)(kl)的錨定與融合的錨定與融合Arf: Arf: 調節膜性顆粒調節膜性顆粒(kl)(kl)的運輸的運輸Ran: Ran: 調控核內運輸調控核內運輸胞質胞質細胞核細胞核RabRab蛋白在體內以兩種構象蛋白在體內以兩種構象(u xin

8、)(u xin)形式存在，活化的形式存在，活化的RabRab蛋白為蛋白為GTPGTP結合形式，位于結合形式，位于 胞膜；未活化的胞膜；未活化的RabRab蛋白與蛋白與GDPGDP結合，位于胞漿。結合，位于胞漿。 第12頁/共80頁第十三頁，共81頁。Cell, 2007, 129: 865第13頁/共80頁第十四頁，共81頁。Thierry Galvez et al. 2012. Cell 151: 234第14頁/共80頁第十五頁，共81頁。RabRab蛋白蛋白: : 所有的真核生物中都有所有的真核生物中都有RabRab蛋白蛋白 酵母酵母(jiom)(jiom)中的中的RabRab蛋白稱為蛋

9、白稱為YptYpt蛋白蛋白,7,7個個RabRab蛋白蛋白 線蟲線蟲(C elegans) 29(C elegans) 29種種RabRab蛋白蛋白 果蠅果蠅(Drosophila melanogaster)26(Drosophila melanogaster)26種種RabRab蛋白蛋白 擬南芥擬南芥(Arabidopsis thaliana)57(Arabidopsis thaliana)57種種RabRab蛋白蛋白 人有人有6060多種多種RabRab蛋白蛋白 PM1-3，G1-3:與GTP結合(jih)/ 分解相關的保守區, G結構域F1-5: Rab的保守區高度可變的N端和C端 第1

10、5頁/共80頁第十六頁，共81頁。G G結構域結構域: 6: 6個個折疊折疊(1-6), 5(1-6), 5個個螺旋螺旋 (1-5) (1-5)和和5 5個多肽環。個多肽環。多肽環多肽環: : 折疊與折疊與螺旋之間由多肽環連接螺旋之間由多肽環連接 氨基酸序列高度保守氨基酸序列高度保守 Mg2+ Mg2+和鳥嘌呤的結合位點，同時催化和鳥嘌呤的結合位點，同時催化(cu (cu hu)hu) GTP GTP水解水解 開關開關I I和開關和開關II: RabII: Rab蛋白與它的蛋白與它的GEFGEF和和GAPGAP的關的關 鍵位點鍵位點 第16頁/共80頁第十七頁，共81頁。Rab6Rab6在抗病

11、毒對蝦在抗病毒對蝦(duxi)(duxi)中上調表達中上調表達 參與參與(cny)抗病毒免疫反抗病毒免疫反應應參與參與(cny)(cny)免疫的途免疫的途徑徑? ?篩選與篩選與Rab6Rab6結合的蛋白質結合的蛋白質蛋白互作蛋白互作GST pull-down,CoIP,GST pull-down,CoIP,酵母酵母( (細菌細菌) )雙雜交雙雜交, ,噬菌體展示噬菌體展示, ,蛋白質芯片蛋白質芯片,Native/SDS-PAGE,Native/SDS-PAGE蛋白質鑒定蛋白質鑒定蛋白互作驗證蛋白互作驗證功能功能3) 3) 互作蛋白篩選互作蛋白篩選第17頁/共80頁第十八頁，共81頁。GST “

12、X”“Y”GST (Glutathione-S-transferase ) pull-down assaySepharoseGSH |BamH1 | |EcoR1 |SmaI |SalI | XhoI | NotI |. ATC GAA GGT CGT GGG ATC CCC AGG AAT TCC CGG GTC GAC TCG AGC GGC CGC . TAG CTT CCA GCA CCC TAG GGG TCC TTA AGG GCC CAG CTG AGC TCG CCG GCG . Ile Glu Gly Arg Gly Ile Pro Arg Asn Ser Arg Val A

13、sp Ser Ser Gly Arg . | Factor Xa |His tagHis tagSDS-PAGEWestern blot第18頁/共80頁第十九頁，共81頁。Co-Immunoprecipitation (CoIP)Co-Immunoprecipitation (CoIP)不受互作蛋白不受互作蛋白(dnbi)結合位結合位點影響點影響蛋白蛋白(dnbi)條帶較多條帶較多第19頁/共80頁第二十頁，共81頁。nucleushis- leu- trp-Yeast 2-Hybrid AssayMeasurableproductDBDbaittrpADfishleureporterDBD

14、ADhis細菌(xjn)雙雜交文庫文庫(wnk)篩選，檢測篩選，檢測2個蛋白互作個蛋白互作第20頁/共80頁第二十一頁，共81頁。噬菌體展示噬菌體展示(zhnsh)第21頁/共80頁第二十二頁，共81頁。蛋白質芯片蛋白質芯片(xn pin)第22頁/共80頁第二十三頁，共81頁。第23頁/共80頁第二十四頁，共81頁。4)4)互作蛋白互作蛋白(dnbi)(dnbi)的鑒定的鑒定N N端測序端測序:Edman sequncing:Edman sequncing 需要需要(xyo)(xyo)大量純化的蛋白質大量純化的蛋白質 N N末端封閉末端封閉質譜質譜(masspectrometry, MS)(

15、masspectrometry, MS)分析分析 常用常用, ,基因組序列基因組序列MALDI-TOF MS: matrix-assisted MALDI-TOF MS: matrix-assisted laser-desorption/ionization laser-desorption/ionization time-of-flight time-of-flightESI-MS/MS: nano-electrospray ESI-MS/MS: nano-electrospray ionization tandem MS ionization tandem MS (Q-TOF) (Q-TO

16、F) MALDI-Q-TOF, TOF/TOF MALDI-Q-TOF, TOF/TOF 生物樣品生物樣品(yngpn)離子化方法離子化方法第24頁/共80頁第二十五頁，共81頁。5)5)蛋白蛋白(dnbi)(dnbi)互作的驗證互作的驗證體外體外: Western blot: Western blot體內體內(t ni): (t ni): 細胞細胞試驗試驗酵母酵母(jiom)(jiom)(細菌細菌) )雙雜雙雜交交第25頁/共80頁第二十六頁，共81頁。第26頁/共80頁第二十七頁，共81頁。6) 6) 功能功能(gngnng)(gngnng)體內體內RNAiRNAi抑制抑制(yzh)Rab

17、6(yzh)Rab6基因的表達對血細胞吞噬功能的影響基因的表達對血細胞吞噬功能的影響 第27頁/共80頁第二十八頁，共81頁。Rab6Rab6基因過量表達對血細胞吞噬基因過量表達對血細胞吞噬(tnsh)(tnsh)功能的影響功能的影響 Rab6Rab6基因基因(jyn)(jyn)沉默對病毒感染的影響沉默對病毒感染的影響 第28頁/共80頁第二十九頁，共81頁。Rabtropomyosinactin900-1020 bp 互作片段互作片段(pin dun)第29頁/共80頁第三十頁，共81頁。信號信號(xnho)通路通路 VP466-tropomyosin-actinVP466：感染必需(bx)

18、蛋白第30頁/共80頁第三十一頁，共81頁。信號信號(xnho)通路通路VP466-Rab6-actinRab6 N端：與VP466互作必需(bx)體外體內(t ni)VP466為為Rab6的的GAP第31頁/共80頁第三十二頁，共81頁。信號信號(xnho)通路通路VP466-Rab6-actinVP466激活激活(j hu)Rab6，Rab6影響影響actin構象，促進吞噬構象，促進吞噬第32頁/共80頁第三十三頁，共81頁。信號信號(xnho)通路通路VP466-Rab6-actin第33頁/共80頁第三十四頁，共81頁。果蠅果蠅(u yn)：Rab6-actin第34頁/共80頁第三十

19、五頁，共81頁。果蠅果蠅(u yn)：Rab6-actin第35頁/共80頁第三十六頁，共81頁。VP466Ranmyosinactin細胞細胞(xbo)(xbo)吞噬吞噬 細胞細胞(xbo)吞噬吞噬 RantropomyosinRabRNAioverexpressionNP小分子(fnz)siRNA小小G蛋白（蛋白（Rab，Ran）與骨架）與骨架 蛋白直接作用調控吞噬蛋白直接作用調控吞噬病毒雙功能蛋白病毒雙功能蛋白第36頁/共80頁第三十七頁，共81頁。蛋白質復合體標記蛋白質復合體標記(bioj)病毒感染病毒感染 Rhodamine-Phalloidin 第37頁/共80頁第三十八頁，共81

20、頁。3.3.細胞細胞(xbo)(xbo)內蛋白質標記內蛋白質標記（protein labeling in vivoprotein labeling in vivo）蛋白質互作：生化數據，體外分析蛋白質互作：生化數據，體外分析(fnx)細胞、個體觀察：蛋白質標記細胞、個體觀察：蛋白質標記第38頁/共80頁第三十九頁，共81頁。熒光標記熒光標記(fluorecence labeling)常用：小分子有機染料與各種抗體常用：小分子有機染料與各種抗體(kngt)相連接或特異的熒光標相連接或特異的熒光標記物記物 ，研究，研究 各種目的蛋白各種目的蛋白 需要對細胞進行固定等操作需要對細胞進行固定等操作 進

21、展：直接在活體細胞內標記某種細胞器、核酸分子或某些離子進展：直接在活體細胞內標記某種細胞器、核酸分子或某些離子的熒的熒 光標記物光標記物 熒光蛋白：非侵入性的活體細胞成像熒光蛋白：非侵入性的活體細胞成像 熒光蛋白熒光蛋白-目的蛋白融合表達：過量表達目的蛋白融合表達：過量表達 目的基因失活突變體（株）目的基因失活突變體（株）第39頁/共80頁第四十頁，共81頁。1 1）熒光標記物）熒光標記物2 2）標記蛋白技術）標記蛋白技術(jsh) (jsh) 3 3）應用）應用第40頁/共80頁第四十一頁，共81頁。1）熒光）熒光(ynggung)標記物標記物小分子有機染料小分子有機染料分子量小于分子量小于

22、1KD1KD與生物大分子共價連接對其進行標記與生物大分子共價連接對其進行標記染料的最佳檢測波長范圍、亮度，即吸光系數、光穩定性和自我淬滅特性染料的最佳檢測波長范圍、亮度，即吸光系數、光穩定性和自我淬滅特性利用：擴展共軛雙鍵、額外利用：擴展共軛雙鍵、額外( wi)( wi)添加環狀結構增強其剛性、用氟或磺酸鹽這類添加環狀結構增強其剛性、用氟或磺酸鹽這類 吸電子性的或帶電荷的物質進行修飾等。吸電子性的或帶電荷的物質進行修飾等。有數百種熒光染料商品，如有數百種熒光染料商品，如DAPIDAPI，FITCFITC，RhodamineRhodamine，HoechstHoechst，PIPI，DTAFDT

23、AF， phalloidin phalloidin等等多與抗體聯用多與抗體聯用 第41頁/共80頁第四十二頁，共81頁。第42頁/共80頁第四十三頁，共81頁。熒光蛋白熒光蛋白 最早：藻膽蛋白（最早：藻膽蛋白（phycobiliproteins），藍藻中提取的觸角光合色素），藍藻中提取的觸角光合色素 含有多種膽汁三烯生色基團，生色基團包裹在一種基質結構中，含有多種膽汁三烯生色基團，生色基團包裹在一種基質結構中， 將它們的淬滅作用降至最小，因此這些將它們的淬滅作用降至最小，因此這些(zhxi)藻膽蛋白的熒光亮度藻膽蛋白的熒光亮度 要比小分子熒光染料的亮度高出兩個數量級。要比小分子熒光染料的亮度高

24、出兩個數量級。 蛋白分子量蛋白分子量200KD，限制了它們在細胞內的擴散，只能與抗體聯，限制了它們在細胞內的擴散，只能與抗體聯 用，在流式細胞或用，在流式細胞或ELISA中用來檢測細胞表面的蛋白質分子中用來檢測細胞表面的蛋白質分子 后來：維多利亞發光水母（后來：維多利亞發光水母（Aequorea victoria）中發現）中發現GFP，生物成像，生物成像 發生革命性改變，單獨表達發生革命性改變，單獨表達GFP或與其它蛋白融合表達或與其它蛋白融合表達 GFP依賴(yli)鈣離子第43頁/共80頁第四十四頁，共81頁。熒光蛋白（GFP，RFP，YFP，CFP）大都來自海洋腔腸動物 熒光蛋白發出的熒

25、光一般對它們所處的生化(shn hu)環境都不太敏感，但 酸性環境或變性劑的存在可以淬滅熒光第44頁/共80頁第四十五頁，共81頁。第45頁/共80頁第四十六頁，共81頁。量子點（量子點（Quantum DotQuantum Dot）（）（20002000）無機納米結晶體，冷光半導體納米顆粒無機納米結晶體，冷光半導體納米顆粒可根據其大小發出特定波長的熒光，具有非常高的消光系數（比小分子可根據其大小發出特定波長的熒光，具有非常高的消光系數（比小分子 熒光基團和熒光蛋白高出熒光基團和熒光蛋白高出10-10010-100倍），量子產率也非常好倍），量子產率也非常好典型的量子點都含有一個硒化鎘（典型的

26、量子點都含有一個硒化鎘（CdSeCdSe）或碲化鎘（）或碲化鎘（CdTeCdTe）核心，外面）核心，外面 包裹一硫化鋅（包裹一硫化鋅（ZnSZnS）外殼）外殼吸收波長范圍覆蓋從非常短的波長至略低于其發射波長的廣闊范圍，一束吸收波長范圍覆蓋從非常短的波長至略低于其發射波長的廣闊范圍，一束 單波長激發光就可以讓量子點達到多重發射單波長激發光就可以讓量子點達到多重發射量子點可以與抗體、抗生物量子點可以與抗體、抗生物(shngw)(shngw)素蛋白鏈菌素（素蛋白鏈菌素（streptavidinstreptavidin）等分子相連，）等分子相連， 但結合生物但結合生物(shngw)(shngw)大分子

27、的量子點體積過大（直徑約大分子的量子點體積過大（直徑約10-30nm10-30nm），阻礙它通），阻礙它通 過細胞膜結構，只能用于經透化處理的細胞或只能對胞外蛋白和可過細胞膜結構，只能用于經透化處理的細胞或只能對胞外蛋白和可 被細胞內吞的蛋白進行研究被細胞內吞的蛋白進行研究量子點的光穩定性使其能夠反復成像，其大小和電子密度特性又使得它適量子點的光穩定性使其能夠反復成像，其大小和電子密度特性又使得它適 合用于電鏡研究合用于電鏡研究在親水的樹枝狀高分子聚合物中形成的金或銀納米點材料也能發出熒光，在親水的樹枝狀高分子聚合物中形成的金或銀納米點材料也能發出熒光， 也具有波長可調性，這種新型材料可望在細

28、胞生物也具有波長可調性，這種新型材料可望在細胞生物(shngw)(shngw)學領域應用學領域應用應用限制：與生物(shngw)大分子連接，體積大第46頁/共80頁第四十七頁，共81頁。量子(lingz)點結構模式圖 量子點與抗體(kngt)及生物素連接模式圖 Color Qtracker 細胞標記效果3T3細胞(綠色), HeLa細胞(紅色), U188細胞(白色(bis) 分別用 Qtracker 565, 655, 和705 進行了熒光標記 第47頁/共80頁第四十八頁，共81頁。納米顆粒納米顆粒Bruce E . Cohen. 2010. Nature 467: 407-408Bruc

29、e E . Cohen. 2010. Nature 467: 407-408有機納米顆粒：鈦酸鋇（有機納米顆粒：鈦酸鋇（BaTiO3BaTiO3） 可代替無機熒光染料可代替無機熒光染料 用于活組織的成像用于活組織的成像熒光染料成像原理：熒光分子吸收熒光染料成像原理：熒光分子吸收(xshu)(xshu)光，發出比吸收光，發出比吸收(xshu)(xshu)光能量低光能量低的熒光的熒光 吸收吸收(xshu)(xshu)光與散射光的能量差異稱為光與散射光的能量差異稱為Stokes shiftStokes shift， 保證發出熒光保證發出熒光熒光染料的缺點：熒光染料的缺點：1 1）細胞本身有許多熒光分

30、子，產生熒光背景）細胞本身有許多熒光分子，產生熒光背景 2 2）熒光顯微鏡的激發光可能損傷細胞，如紫外光）熒光顯微鏡的激發光可能損傷細胞，如紫外光 等；光損傷可能間接發生，熒光分子與其它分等；光損傷可能間接發生，熒光分子與其它分 子發生反應子發生反應解決熒光染料的缺點：構建雙光子顯微鏡（解決熒光染料的缺點：構建雙光子顯微鏡（two-photon microscopetwo-photon microscope） 采用脈沖近紅外線激光，發出比激發光能量高采用脈沖近紅外線激光，發出比激發光能量高 的光的光該文：采用第二次諧波產生技術該文：采用第二次諧波產生技術 發現發現barium titanate

31、 (BaTiO3)barium titanate (BaTiO3)晶體（納米顆粒），晶體（納米顆粒），30 nm 30 nm 比核糖體的直徑大比核糖體的直徑大2 2倍倍 有望代替熒光染料的材料：量子點和納米顆粒有望代替熒光染料的材料：量子點和納米顆粒第48頁/共80頁第四十九頁，共81頁。活細胞活細胞(xbo)(xbo)染色染料染色染料Invitrogen product listInvitrogen product listC10106 Cellular LightsC10106 Cellular Lights Tubulin-GFP Tubulin-GFP * *BacMam 1.0Bac

32、Mam 1.0* * C10112 Cellular LightsC10112 Cellular Lights Tubulin-RFP Tubulin-RFP * *BacMam 1.0BacMam 1.0* * C10126 Cellular LightsC10126 Cellular Lights Actin-GFP Actin-GFP * *BacMam 1.0BacMam 1.0* * C10127 Cellular LightsC10127 Cellular Lights Actin-RFP Actin-RFP * *BacMam 1.0BacMam 1.0* * O10100 Or

33、ganelle LightsO10100 Organelle Lights Lysosomes-RFP Lysosomes-RFP * *BacMam 1.0BacMam 1.0* *O10104 Organelle LightsO10104 Organelle Lights Endosomes-GFP Endosomes-GFP * *BacMam 1.0BacMam 1.0* * O36210 Organelle LightsO36210 Organelle Lights Mito-GFP Mito-GFP * *BacMam 1.0BacMam 1.0* * O36231 Organel

34、le LightsO36231 Organelle Lights Endosomes-RFP Endosomes-RFP * *BacMam 1.0BacMam 1.0* * P36232 PremoP36232 Premo FUCCI Cell Cycle Sensor FUCCI Cell Cycle Sensor * *BacMam 1.0BacMam 1.0* * P36235 PremoP36235 Premo Autophagy Sensor LC3B-GFP Autophagy Sensor LC3B-GFP * *BacMam 2.0BacMam 2.0* * P36236 P

35、remoP36236 Premo Autophagy Sensor LC3B-RFP Autophagy Sensor LC3B-RFP * *BacMam 2.0BacMam 2.0* *第49頁/共80頁第五十頁，共81頁。2）標記蛋白）標記蛋白(dnbi)技術技術 免疫標記法免疫標記法檢測內源性蛋白最常用檢測內源性蛋白最常用(chn yn)(chn yn)方法方法用特異性抗體（一抗）識別靶蛋白，再用標記有小分子有機染料、藻膽用特異性抗體（一抗）識別靶蛋白，再用標記有小分子有機染料、藻膽 蛋白或量子點的二抗顯色；或者，直接將熒光標記物或生物素連接蛋白或量子點的二抗顯色；或者，直接將熒光標記

36、物或生物素連接 在一抗上，然后再用抗生物素蛋白鏈菌素檢測。在一抗上，然后再用抗生物素蛋白鏈菌素檢測。如果沒有高質量的抗體，可將熒光標記物與靶蛋白融合過量表達如果沒有高質量的抗體，可將熒光標記物與靶蛋白融合過量表達缺點：該方法只能用于經透化處理的細胞、胞外蛋白和可被細胞內吞的缺點：該方法只能用于經透化處理的細胞、胞外蛋白和可被細胞內吞的 蛋白；蛋白； 抗體標記物的多價性可能會導致靶蛋白形成寡聚體抗體標記物的多價性可能會導致靶蛋白形成寡聚體 熒光標記復合體通常分子量會超過熒光標記復合體通常分子量會超過200KD200KD，可能影響蛋白互作，可能影響蛋白互作第50頁/共80頁第五十一頁，共81頁。+

37、、+/-、-分別表示分別表示(biosh)“應用范圍較廣應用范圍較廣”，“在某些領域內有所應用在某些領域內有所應用”，“較少應用較少應用” 第51頁/共80頁第五十二頁，共81頁。遺傳標記法遺傳標記法熒光蛋白與靶蛋白融合表達，轉染、轉基因熒光蛋白與靶蛋白融合表達，轉染、轉基因缺點：表達的蛋白不是內源性蛋白缺點：表達的蛋白不是內源性蛋白 熒光蛋白分子大小會影響目的蛋白功能熒光蛋白分子大小會影響目的蛋白功能 熒光蛋白的限制性熒光蛋白的限制性改進：靶基因突變株或改進：靶基因突變株或RNAiRNAi 活細胞內或細胞表面將小分子熒光標記物與目的蛋白共價活細胞內或細胞表面將小分子熒光標記物與目的蛋白共價(

38、n ji)(n ji)連接或連接或 通過酶進行連接通過酶進行連接 例：四半胱氨酸序列（例：四半胱氨酸序列（tetracysteinetetracysteine）-biarsenical-biarsenical染料系統染料系統 12aa12aa肽段（含肽段（含4Cys4Cys），），CysCys與透過細胞膜的與透過細胞膜的biarsenicalbiarsenical染染 料結合（高親和力），形成料結合（高親和力），形成FlAsHFlAsH或或ReAsHReAsH，發出綠色或，發出綠色或 紅色熒光紅色熒光 同時使用小分子二巰基化合物解毒劑可降低靶蛋白與染料同時使用小分子二巰基化合物解毒劑可降低靶蛋

39、白與染料 間親和力，減少毒性反應間親和力，減少毒性反應 TetracysteineTetracysteine對目的蛋白的影響比熒光蛋白小得多對目的蛋白的影響比熒光蛋白小得多 可用于親和純化、熒光蛋白輔助的光滅活作用、檢測蛋白可用于親和純化、熒光蛋白輔助的光滅活作用、檢測蛋白 質合成過程、進行脈沖追蹤標記、電鏡定位等質合成過程、進行脈沖追蹤標記、電鏡定位等 biarsenical biarsenical染料會造成背景熒光偏高，未用于轉基因動染料會造成背景熒光偏高，未用于轉基因動 物，不能同時對不同的蛋白標記上不同的顏色物，不能同時對不同的蛋白標記上不同的顏色phalloidin: actinph

40、alloidin: actin第52頁/共80頁第五十三頁，共81頁。HaloTagHaloTag技術技術 蛋白標記示蹤蛋白標記示蹤+ +融合融合(rngh)(rngh)表達表達+ +蛋白分離蛋白分離具體步驟： 1.構建帶有HaloTag和目標蛋白的融合 表達載體 2.轉染目標細胞，可按需要選擇瞬時轉 染或穩定轉染 3.培養細胞至表達產物 4.選擇合適的熒光配基或生物素與細胞 共同孵育5-60分鐘，配基穿越細胞膜 和HaloTag形成共價結合，然后洗掉未 結合的配基。 5.分析研究：活細胞熒光成像；或者固 定細胞成像；細胞裂解以及蛋白親和 純化(chn hu)/捕獲，或凝膠分析。 第53頁/共

41、80頁第五十四頁，共81頁。3 3）應用）應用(yngyng)(yngyng)蛋白質表達蛋白質表達(biod)、蛋白質定位、蛋白質定位流式細胞：蛋白質表達、蛋白質活性流式細胞：蛋白質表達、蛋白質活性 特異結合磷酸化蛋白的被熒光標記的抗體，觀察內源蛋白特異結合磷酸化蛋白的被熒光標記的抗體，觀察內源蛋白 質的活化狀態；熒光標記抗體，檢測蛋白表達質的活化狀態；熒光標記抗體，檢測蛋白表達 同時同時(tngsh)(tngsh)對對1717種熒光進行檢測種熒光進行檢測 光鏡光鏡/ /電鏡：蛋白質定位電鏡：蛋白質定位共聚焦顯微鏡觀察熒光基團在光照下產生單線態氧，容易對熒光基團自身起漂白作用，而 且可將局部的

42、二氨基聯苯胺氧化形成電鏡下的嗜鋨小體。量子點可以用于光鏡和電鏡A，B 內源性蛋白一抗標記、染料內源性蛋白一抗標記、染料-二抗標記二抗標記D，E：融合表達熒光蛋白，：融合表達熒光蛋白，tetracysteine標記標記第54頁/共80頁第五十五頁，共81頁。Different frames from time-lapse microscopy are shown for CID-GFP (Drosophila CENP-A, centromere marker) coexpressed with H2B-mRFP (chromosome counter stain) at 1, 64, 83 a

43、nd 138 minutes. Purple indicatescell outlines taken by transmission light. 共定位(dngwi)：質粒共表達 第55頁/共80頁第五十六頁，共81頁。Caroline Grabbe and Ivan Dikic. 2008. Science 322: 872-873 IRES第56頁/共80頁第五十七頁，共81頁。蛋白質在細胞內的彌散過程蛋白質在細胞內的彌散過程(guchng)(guchng)和運輸過程和運輸過程(guchng) (guchng) 蛋白在細胞內運動、分布、活化、信號通路、第二信使等，可通過成像 技術觀察其

44、變化過程(guchng)單粒子示蹤技術（single-particle tracking）： 對單個分子、聚合物或細胞器等進行觀察；被觀測的粒子必須足夠亮，彼此間隔足夠大Rab（藍），actin（紅） 細胞核（藍）第57頁/共80頁第五十八頁，共81頁。Phagocytosis of C. albicans by Drosophila S2 Cells. The Drosophila hemocyte-like S2 cell line phagocytoses C. albicans. S2 cells were co-incubated with GFPexpressing C. albi

45、cans for the Indicated times. Cells were fixed, and the filamentous actin of S2 cells was stained with Rhodamine phalloidin and the S2cell DNA with Hoechst 33258.第58頁/共80頁第五十九頁，共81頁。熒光相關光譜技術（Fluorescence correlation spectroscopy）：針對分子熒光物理參數瞬時細微漲落的探測及其與時間相關處理的技術對熒光標記蛋白進入或離開(l ki)某一激光焦點區域導致的熒光強度的改變情 況

46、進行統計學分析，以此來分析蛋白質的運動情況。記錄的熒光分子的漲落是由于熒光分子擴散進入和逃出一個小的激發體 積形成的，其中激發體積的大小由聚焦激發激光質量所決定。激發 體積內分子發射的熒光強度是通過記錄一個個光子獲得的。假設激 發光是穩定的，則熒光強度的漲落被定義為信號時間平均值的偏離。 探測這些偏離可以獲得的化學和物理參數是局部濃度、遷移率系數、 結合和分離比例常數，以及酶動力學參數。衍生方法：影像相關光譜學技術，對熒光圖像進行測量，發現不同圖像 間的變化情況，對細胞內蛋白間互作和蛋白動力學進行 了解第59頁/共80頁第六十頁，共81頁。光標記技術（photomarking methods）

47、：各種熒光蛋白都可以被破壞（圖F）、被去淬滅或者被光活化作用(zuyng)改變顏 色（圖E），經過上述處理的熒光標記分子可直接進行成像研究E：光活化作用。強烈的光刺激改變局部：光活化作用。強烈的光刺激改變局部(jb)熒光蛋白的發射光譜，從而發現蛋白運熒光蛋白的發射光譜，從而發現蛋白運 動情況動情況F：FRAP作用。強烈的光刺激可以讓局部作用。強烈的光刺激可以讓局部(jb)的熒光被漂白，但新合成蛋白或從別處的熒光被漂白，但新合成蛋白或從別處 運動過來的蛋白仍然會發出熒光；運動過來的蛋白仍然會發出熒光； 第60頁/共80頁第六十一頁，共81頁。光脫色熒光恢復（Fluorescence recove

48、ry after photobleaching，FRAP)： 先用熒光物質標記膜蛋白或膜脂，然后用激光束照射細胞表面某一區域(qy)， 使被照射區域(qy)的熒光淬滅變暗形成一個漂白斑。由于膜的流動性，漂 白斑周圍的熒光物質隨著膜蛋白或膜脂的流動逐漸將漂白斑覆蓋，使 淬滅區域(qy)的亮度逐漸增加，最后恢復到與周圍的熒光光強度相等。根 據熒光恢復的速度，可推算分子的擴散速度 FRAP能證明膜的流動性，也能測量膜蛋白擴散的速率。第61頁/共80頁第六十二頁，共81頁。量子(lingz)點：因亮度和光穩定性非常高，可反復成像 很難在活體細胞內對量子(lingz)點標記的胞質蛋白進行觀測 免疫靶向的

49、抗生物素蛋白鏈菌素標記的量子(lingz)點 （immunotargeted streptavidin-QDs）第62頁/共80頁第六十三頁，共81頁。熒光標記技術在蛋白質構象改變研究中的應用熒光標記技術在蛋白質構象改變研究中的應用研究蛋白隨時空間改變而發生構象改變時，最常用方法是將某一蛋白質結研究蛋白隨時空間改變而發生構象改變時，最常用方法是將某一蛋白質結 構域與構域與2個熒光基團結合個熒光基團結合(jih)，然后對該結構的螢光共振能量轉移（，然后對該結構的螢光共振能量轉移（FRET） 進行檢測進行檢測常用熒光基團有常用熒光基團有CFP、YFP等等FRET 傳感器：底物經修飾(xish)（橙

50、色，磷酸化修飾(xish)）導致構象改變，通過 FRET使發青色熒光的CFP發黃色熒光 FRET效率取決于供體與受體間的距離和方向FRET反映蛋白分子內部因方向而不是距離改變所造成的構象改變，因為熒 光蛋白分子中有一個發生交替排列或者接頭長度發生微小的改變都會 給FRET帶來很大的影響，這要比2個熒光蛋白分子間的距離改變對FRET 造成的影響大得多連接2個熒光蛋白的蛋白質在生化信號的影響下改變構象如果與定位信號序列融合，這種結構可用于對胞內特定的亞細胞結構研究第63頁/共80頁第六十四頁，共81頁。熒光共振能量轉移（Fluorescence Resonance Energy Transfer，

51、FRET）當一個熒光分子(供體分子)的熒光光譜與另一個熒光分子(受體分子) 的 激發光譜相重疊時，供體熒光分子的激發能誘發受體分子發出熒光， 同時供體熒光分子自身的熒光強度衰減。兩個發色基團間能量轉換效率與它們間的空間距離的6次方成反比，對空 間位置的改變非常靈敏 例 用CFP作供體、YFP作受體，當它們足夠接近時，用CFP的吸收波長(bchng)激 發，CFP的發色基團將會把能量高效率地共振轉移至YFP的發色基團 上，所以CFP的發射熒光將減弱或消失，主要發射將是YFP的熒光。FRET技術(jsh)原理示意圖第64頁/共80頁第六十五頁，共81頁。熒光熒光(ynggung)(ynggung)

52、標記技術在蛋白與蛋白互作中的應用標記技術在蛋白與蛋白互作中的應用FRETFRET用于活體細胞內研究蛋白間互作（圖）用于活體細胞內研究蛋白間互作（圖）三分子三分子FRETFRET作用：蛋白作用：蛋白X X和和Y Y結合后，使發青色熒光的結合后，使發青色熒光的CFPCFP發黃色熒光，發黃色熒光， 再與蛋白再與蛋白Z Z結合發紅色熒光結合發紅色熒光 這種方法已用于多蛋白復合體以及這種方法已用于多蛋白復合體以及(yj)(yj)三聚體蛋白研究中三聚體蛋白研究中第65頁/共80頁第六十六頁，共81頁。BiFC技術可用于研究蛋白表達BiFC技術具有(jyu)很高的信噪比，因為它可以形成新的熒光；試驗花費時間

53、長BiFC技術：蛋白技術：蛋白X與與Y結合導致結合導致GFP的的2個裂解片段結合在一起，形成生色基團，個裂解片段結合在一起，形成生色基團， 發出發出(fch)綠色熒光綠色熒光 雙分子熒光互補(h b)技術（bimolecular fluorescence complementation，BiFC）：原理：利用熒光蛋白及其突變體的特性作為報告基因，將熒光蛋白分割成 2個不具有熒光活性的分子片段，分別與目標蛋白連接。若2個目標 蛋白因為互作而靠近，使得熒光蛋白的2個分子片段在空間上相互 靠近，重新形成活性的熒光基團而發出熒光。在熒光顯微鏡下，直 接觀察2目標蛋白是否有互作，且在最接近活細胞生理狀態

54、下觀察 其互作發生的時間、位置、強弱、所形成蛋白質復合體的穩定性， 以及細胞信號分子對其互作的影響等 第66頁/共80頁第六十七頁，共81頁。第67頁/共80頁第六十八頁，共81頁。熒光標記技術在蛋白質合成和降解過程熒光標記技術在蛋白質合成和降解過程(guchng)(guchng)研究中的應用研究中的應用蛋白質降解：分辨蛋白質降解：分辨“陳舊的陳舊的”蛋白和蛋白和“新生的新生的”蛋白蛋白常用方法：用不可逆標記對某一時刻合成的所有蛋白質進行標記，再用另常用方法：用不可逆標記對某一時刻合成的所有蛋白質進行標記，再用另 一種顏色的熒光對遲些時候新生成的蛋白質進行標記一種顏色的熒光對遲些時候新生成的蛋

55、白質進行標記 例：例：1 1）用高親和力配體或標記有熒光基團的抗體對內源性蛋白和胞外蛋白）用高親和力配體或標記有熒光基團的抗體對內源性蛋白和胞外蛋白 進行標記進行標記 2 2）先用一種雙砷（）先用一種雙砷（biarsenicalbiarsenical）染料標記四半胱氨酸）染料標記四半胱氨酸 （TetracysteineTetracysteine）序列，然后用另一種雙砷染料進行標記）序列，然后用另一種雙砷染料進行標記 FLAsH FLAsH（bis-arsenical fluoroscein derivativebis-arsenical fluoroscein derivative） ： 聯砷

56、熒光素衍生物聯砷熒光素衍生物 合成的合成的 細胞可透細胞可透 FLAsH FLAsH結合四半胱氨酸結合四半胱氨酸: :發夾型結合物發夾型結合物 FLAsH FLAsH（綠），（綠），ReAsHReAsH（紅），（紅），HoXAsHHoXAsH（藍），（藍），CHoX-AsCHoX-As（藍）等（藍）等第68頁/共80頁第六十九頁，共81頁。脈沖追蹤技術：脈沖追蹤技術：Tetracysteine序列標記的蛋白被綠色染料標記后，形成能發出綠序列標記的蛋白被綠色染料標記后，形成能發出綠 色熒光色熒光(ynggung)的的FIAsH（綠色小點）；去掉綠色染料后，用紅色染料標（綠色小點）；去掉綠色染料后

57、，用紅色染料標 記新生的蛋白，形成能發出綠色熒光記新生的蛋白，形成能發出綠色熒光(ynggung)的的ReAsH（紅色小點）（紅色小點） 第69頁/共80頁第七十頁，共81頁。HaloTag標記(bioj) TNF-dependent degradation of IkB-HaloTag fusion protein. a) Time series of images showing HEK-293 cells transiently expressing the IkB-HaloTag fusion protein labeled with the TMR ligand. Degradati

58、on was prevented by treatment of the cells with 10 M lactacystin for 30 min.b) Mean cellular fluorescence intensities were determined at each time pointc) Western blot analysis of IkB-HaloTag fusion protein degradation. Cells were treated with TNF- (10 ng/mL) and harvested at the indicated times. Pr

59、oteins were resolved by SDS-PAGE and visualized using an anti-IkB antibody. 第70頁/共80頁第七十一頁，共81頁。利用依賴生色基團的光滅活作用來控制蛋白質的活性利用依賴生色基團的光滅活作用來控制蛋白質的活性通過免疫染色對目的蛋白進行標記，熒光基團受光照活化后會生成通過免疫染色對目的蛋白進行標記，熒光基團受光照活化后會生成(shn chn)ROS(shn chn)ROS， 尤其是生成尤其是生成(shn chn)(shn chn)單線態氧，利用這種特性將目的蛋白滅活單線態氧，利用這種特性將目的蛋白滅活摧毀胞內靶蛋白效率：摧毀胞內靶蛋白效率：ReAsH FlAsHReAsH FlAsH熒光素熒