1、 食品微生物實驗指導烏蘭察布職業學院農學與馬鈴薯工程系編寫人：張建飛2016年3月食品微生物學實驗指導一、課程性質和任務食品生物學實驗是一門專業基礎實驗課。該課程的任務是教會學生利用光學顯微鏡觀察各種微生物，學會常用培養基的制備、常用玻璃儀器的滅菌，學會分離培養微生物，學會鑒定微生物。二、教學的目標及要求：通過該課程的學習，要求學生達到如下目標：1 學會普通光學顯微鏡的使用方法，特別是利用油鏡觀察細菌的方法。2 學會微生物的制片染色技術。3 學會微生物細胞的大小測定及數量測計技術。4 學會培養基的制備、滅菌及微生物的分離純化技術。5 學會鑒定細菌的常規生理生化實驗方法為達到上述目標，要求學生一

2、定要自己親自動手獨立實驗，實事求是的完成每一次實驗報告，并做好每次實驗前的預習。三、實驗內容與學時分配序號項目名稱實驗內容學時實驗性質主要耗材及儀器設備1實驗一 顯微鏡的使用與細菌形態構造的觀察目的：介紹微生物實驗的實驗要求，重點掌握顯微鏡的使用，認識細菌的基本形態。內容：（1）觀察前的準備（2）低倍鏡觀察  （3）高倍鏡觀察 2基礎必修顯微鏡、香柏油、二甲苯、鏡頭紙、菌種2實驗二 真菌制片及形態觀察目的：學習水浸制片法觀察真菌的形態內容：1.觀察幾種代表真菌的無性孢子2.觀察幾種代表真菌的有性孢子2基礎必修載玻片、蓋玻片、顯微鏡3實驗三 細菌涂片制備、染色及觀察目的：進一

3、步掌握正確規范使用顯微鏡的方法和技能。理解簡單染色和革蘭氏染色的原理。掌握革蘭氏染色的方法與規范操作。鞏固顯微鏡的使用方法和無菌操作技術。內容：革蘭氏染色4基礎必修結晶紫、碘液、95%乙醇、蕃紅、載玻片、顯微鏡4實驗四 玻璃儀器的包扎與滅菌實驗目的：(1) 了解微生物實驗中玻璃器皿的洗滌重要性(2) 掌握玻璃器皿的洗滌的方法(3) 熟悉玻璃器皿滅菌原理及方法內容：（1）玻璃器皿的洗滌(2)玻璃器皿的包扎(3)玻璃器皿滅菌2基礎必修試管、各種規格的玻璃吸管、培養皿（平皿）、三角瓶及燒杯、玻璃涂布棒等。裝培養皿的金屬筒、干熱滅菌箱等。5實驗五培養基的制備目的：學習培養基的配制及滅菌方法內容：1.配

4、制牛肉膏瓊脂培養基和馬丁孟加拉紅鏈霉素培養基2.準備吸管、無菌水、平皿等無菌器材3.進行培養基和無菌器材的滅菌操作4基礎必修牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、孟加拉紅（四碘四氯熒光素）、鏈霉素、三角瓶、試管、1ml吸管、平皿、滅菌鍋6實驗六微生物顯微直接計數法目的：學習微生物的大小測定和顯微計數法內容：1.測定Saccharomyces cerevisiae的細胞大小。2.用血球計數板測定每支斜面上S.cerevisiae的菌數2基礎必修載玻片、鏡臺測微尺、目鏡測微尺、血球計數板、顯微鏡7實驗七微生物細胞大小的測定目的：觀察并掌握菌種個體形態和菌落特征、學習測微技術，測量細菌的大小。內容：酵母菌菌體大小的

5、測定 、酵母菌數量的測定 2鏡臺測微尺、顯微鏡、載玻片及蓋玻片、接種針、0.1%美藍液、孔雀綠染液、菌種。8實驗八菌種的分離純化目的：學習微生物的稀釋平板分離法及劃線分離法內容：采樣、樣品稀釋，制備培養基平板，平板畫線法分離培養2基礎必修培養基、試管、培養皿、三角瓶、接種環、酒精燈、恒溫恒濕培養箱。9實驗九食品中菌落總數的測定目的：掌握菌落計數的方法，掌握食品細菌菌落總數的測定報告方式。內容：取樣稀釋培養菌落計數4基礎必修食品檢樣、牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基、無菌生理鹽水、無菌培養皿、無菌移液管、無菌不銹鋼勺。10實驗十食品中大腸菌群的測定目的：學習食品中大腸菌群檢測程序方法，掌握食品中大腸菌群檢

6、測結果的報告方式。內容：初發酵試驗、平板分離、復發酵試驗6選修提高食品檢樣、乳糖蛋白胨發酵管、伊紅美藍瓊脂平板、EC 肉湯、磷酸鹽緩沖稀釋液、蛋白胨稀釋液、無菌生理鹽水、革蘭氏染色液、恒溫箱、冰箱、恒溫水浴、天平、顯微鏡、直徑為90mm的平皿、試管、吸管、廣口瓶或三角燒瓶、玻璃珠、載玻片、酒精燈、試管架。合 計30四、教學方式及課程考核辦法所有實驗在教學實驗室里由教師指導完成。課程結束后分筆試和操作考試，操作考試采取一個教師對一個學生的方式進行。內容包括：細菌的革蘭氏染色；微生物的顯微計數；微生物的劃線分離；微生物的稀釋分離。四項考試內容由學生自己抽簽選擇其中一項在規定時間內完成，超過規定時間

7、扣分。筆試成績和操作成績各占考試成績的50。五、主要參考書：1、趙斌、何紹江微生物學實驗科學出版社2002年2、范秀容、李廣武微生物學實驗高等教育出版社 1999 3、黃儀秀微生物學實驗教程北京大學出版社1999年 4、黃秀梨微生物學實驗指導高等教育出版社1999年 實驗一 顯微鏡的使用與細菌形態構造的觀察1本次實驗的目的和要求介紹微生物實驗的實驗要求，重點掌握顯微鏡的使用，認識細菌的基本形態。2實驗內容或原理 普通光學顯微鏡是一種精密的光學儀器,其構造可分為兩大部分：一為機械裝置，一為光學系統，這兩部分很好的配合，才能發揮顯微鏡的作用。顯微鏡的機械裝置包括底座、鏡筒、物鏡轉換器、載物臺、標本

8、移動器、粗調旋紐、微調旋紐等部件；顯微鏡的光學系統由反光鏡，聚光器，接物鏡，接目鏡等組成，光學系統使物體放大，形成物體放大像。顯微鏡結構精密，使用時必須細心，要按下述操作步驟進行。（1）觀察前的準備顯微鏡從顯微鏡柜或鏡箱內拿出時，要用右手緊握鏡臂，左手托住鏡座，平穩地將顯微鏡搬運到實驗桌上。不帶光源的顯微鏡，可利用燈光或自然光通過反光鏡來調節光照，但不能用直射陽光，直射陽光會影響物像的清晰并刺激眼睛。顯微鏡在觀察時，其光學系統中的光源、聚光器、物鏡和目鏡的光軸及光闌的中心必須跟顯微鏡的光軸同在一直線上。帶視場光闌的顯微鏡，先將光闌縮小，用10×物鏡觀察，在視場內可見到視場光闌圓球多邊

9、形的輪廓像，如此像不在視場中央，可利用聚光器外側的兩個調整旋鈕將其調到中央，然后緩慢地將視場光闌打開，能看到光束向視場周緣均勻展開直至視場光闌的輪廓像完全與視場邊緣內接，說明光線已經合軸。（2）低倍鏡觀察  鏡檢任何標本都要養成必須先用低倍鏡觀察的習慣。因為低倍鏡視野較大，易于發現目標和確定檢查的位置。將標本片放置在載物臺上，用標本夾夾住，移動推動器，使被觀察的標本處在物鏡正下方，轉動粗調節旋鈕，使物鏡調至接近標本處，用目鏡觀察并同時用粗調節旋鈕慢慢升起鏡筒，直至物像出現，再用細調節旋鈕使物像清晰為止。用推動器移動標本片，找到合適的目的像并將它移到視野中央進行觀察。（3）高倍鏡觀察&

10、#160; 在正常情況下，高倍物鏡的轉換不應碰到載玻片或其上的蓋玻片。在轉換物鏡時要從側面觀察，避免鏡頭與玻片相撞。然后從目鏡觀察，調節光照，使亮度適中，緩慢調節粗調節旋鈕，使載物臺上升，直至物像出現，再用細調節旋鈕調至物像清晰為止，找到需觀察的部位，并移至視野中央進行觀察。3需用的儀器或試劑等顯微鏡、香柏油、二甲苯、鏡頭紙、菌種4實驗步驟（1）介紹顯微鏡的構造與各部件的名稱和功能。（2）示范顯微鏡的規范化操作過程。（3）依據顯微鏡使用方法對各示教標本進行觀察。（4）根據觀察撰寫實驗報告，描述觀察到的微生物的形態。實 驗 記 錄實驗時間： 實驗人員：一、實驗名稱： 二、實驗目的：三、實驗材料：

11、四、實驗環境：五、實驗方法：六、實驗過程：七、實驗結果：八、結果分析：實驗二 真菌制片及形態觀察1本次實驗的目的和要求進一步掌握正確規范使用顯微鏡的方法和技能。掌握無菌操作。掌握真菌水浸片的制備，觀察霉菌形態。2實驗內容或原理 霉菌可產生復什分枝的菌絲體，分基內菌絲和氣生菌絲，氣生菌絲生長到一定階段分化產生繁殖菌絲，由繁殖菌絲產生孢子。霉菌菌絲體(尤其是繁殖菌絲)及孢子的形態特征是識別不同種類霉菌的重要依據。霉菌菌絲和孢子的寬度通常比細菌和放線菌粗得多(約為310微米)，常是細菌菌體寬度的幾倍至幾十倍，因此，用低倍顯微鏡即可觀察。3實驗器材顯微鏡、接種針、載玻片、蓋玻片、蒸餾水、酒精燈、菌種（

12、黑曲霉）等。4實驗步驟(1) 講解無菌操作的要點 a 將試管放于手掌中，并用手指夾住， b 用火焰將接種環燒紅，然后將接種環來回通過火焰數次。 c 用小指、無名指和手掌拔下試管塞，并持于手中。d 將試管口在火焰上微燒一周。 e 將燒過的接種環伸入菌種管內，先將環接觸一下沒有長菌的培養基部分，使其冷卻，以免燙死菌體，然后用環在菌苔上輕輕地接觸，刮下少許培養物，并將接種環慢慢的從試管中抽出， f 將接種環抽出，灼燒管口。(2) 講解真菌水浸片制備的要點在載玻片上滴加一滴蒸餾水，用接種針從生長有霉菌的平板中挑取少量霉菌菌絲，用50%的乙醇浸潤，然后放入載玻片上的液滴中，仔細地用接種針將菌絲分散開來。

13、蓋上蓋玻片（勿使產生氣泡，且不要再移動蓋玻片），先用低倍鏡，必要時轉換高倍鏡鏡檢并記錄觀察結果。（3）制備真菌水浸片，顯微鏡觀察并記錄。實 驗 記 錄實驗時間： 實驗人員：一、實驗名稱： 二、實驗目的：三、實驗材料：四、實驗環境：五、實驗方法：六、實驗過程：七、實驗結果：八、結果分析：實驗三 細菌涂片制備、染色及觀察1本次實驗的目的和要求進一步掌握正確規范使用顯微鏡的方法和技能。理解簡單染色和革蘭氏染色的原理。掌握革蘭氏染色的方法與規范操作。鞏固顯微鏡的使用方法和無菌操作技術。 2實驗內容或原理革蘭氏染色法是1884年由丹麥病理學家Christain Gram氏創立的，而后一些學者在此基礎上作

14、了某些改進。革蘭氏染色法是細菌學中最重要的鑒別染色法。 革蘭氏染色法的基本步驟是：先用初染劑結晶紫進行染色，再用碘液媒染，然后用乙醇（或丙酮）脫色，最后用復染劑（如番紅）復染。經此方法染色后，細胞保留初染劑藍紫色的細菌為革蘭氏陽性菌；如果細胞中初染劑被脫色劑洗脫而使細菌染上復染劑的顏色（紅色），該菌屬于革蘭氏陰性菌。 革蘭氏染色法將細菌分為革蘭氏陽性和革蘭氏陰性，是由這兩類細菌細胞壁的結構和組成不同決定的。實際上，當用結晶紫初染后，象簡單染色法一樣，所有細菌都被染成初染劑的藍紫色。碘作為媒染劑，它能與結晶紫結合成結晶紫一碘的復合物，從而增強了染料與細菌的結合力。當用脫色劑處理時，兩類細菌的脫色

15、效果是不同的。革蘭氏陽性細菌的細胞壁主要由肽聚糖形成的網狀結構組成、壁厚、類脂質含量低，用乙醇（或丙酮）脫色時細胞壁脫水、使肽聚糖層的網狀結構孔徑縮小，透性降低，從而使結晶紫-碘的復合物不易被洗脫而保留在細胞內，經脫色和復染后仍保留初染劑的藍紫色。革蘭氏陰性菌則不同，由于其細胞壁肽聚糖層較薄，類脂含量高，所以當脫色處理時，類脂質被乙醇（或丙酮）溶解，細胞壁透性增大，使結晶紫-碘的復合物比較容易被洗脫出來，用復染劑復染后，細胞被染上復染劑的紅色。 3需用的儀器或試劑等顯微鏡，擦鏡紙，香柏油，二甲苯，接種環，酒精燈，石炭酸復紅染色液，草酸胺結晶紫染色液，95%乙醇，蕃紅染色液，大腸桿菌，金黃色葡萄

16、球菌。4實驗步驟(1) 制片 取菌種培養物常規涂片、干燥、固定。 要用活躍生長期的幼培養物作革蘭氏染色；以免脫色不完全造成假陽性；火焰固定不宜過熱（以玻片不燙手為宜）。 (2) 初染滴加結晶紫（以剛好將菌膜覆蓋為宜）染色1-2min，水洗。 (3) 媒染 用碘液沖去殘水，并用碘液覆蓋約1min，水洗。 (4) 脫色 用濾紙吸去玻片上的殘水，將玻片傾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脫色，直至流出的乙醇無紫色時，立即水洗。 水洗時，不要直接 沖涂面，而應使水從載玻片的一端流下。水流不宜急、過大，以免涂片薄膜脫落。 注意：革蘭氏染色結果是否正確，乙醇脫色是格蘭氏染色操作的關鍵環節，脫色不足，

17、陰性菌被誤染成陽性菌，脫色過度，陽性菌被誤染成陰性菌，脫色時間一般約20-30s。 (5) 復染 用番紅染液復染約2min，水洗。 (6) 鏡檢 干燥后，用油鏡觀察。 菌體被染成藍紫色是革蘭氏性菌，被染成紅色的為革蘭氏陰性菌。 實 驗 記 錄實驗時間： 實驗人員：一、實驗名稱： 二、實驗目的：三、實驗材料：四、實驗環境：五、實驗方法：六、實驗過程：七、實驗結果：八、結果分析：實驗四 玻璃儀器的包扎與滅菌1 實驗目的(1) 了解微生物實驗中玻璃器皿的洗滌重要性(2) 掌握玻璃器皿的洗滌的方法(3) 熟悉玻璃器皿滅菌原理及方法2 實驗原理微生物實驗是純種培養，必須是無菌的。因而微生物實驗需要的所有

18、的玻璃器皿，無論是新購置的還是使用過的都必須經過仔細地清洗和嚴格的滅菌后才能使用。3 實驗用儀器設備試管、各種規格的玻璃吸管、培養皿（平皿）、三角瓶及燒杯、玻璃涂布棒等。裝培養皿的金屬筒、干熱滅菌箱等。4 實驗步驟（1）玻璃器皿的洗滌a 新購置的玻璃器皿的洗滌 新購置的玻璃器皿一般含較多的游離的堿，可在2%的鹽酸或洗滌液內先浸泡幾小數后，用自來水沖洗干凈，倒置在洗滌架上，晾干或在干燥箱內烘干備用。b 使用過的玻璃器皿的洗滌 試管、培養皿、三角瓶、燒杯的洗滌。可先用瓶刷（或試管刷）沾用洗衣粉或去污粉等刷洗，然后用自來水沖洗干凈。洗滌后，要求內壁的水均勻分布成一薄層，表示油垢完全洗凈，如還掛有水珠

19、，則需用洗滌液浸泡數小時，然后再用自來水沖洗干凈。培養皿放入 玻璃吸管的洗滌。吸過菌液的吸管（如有棉塞應先去掉）或滴管（先拔去橡皮頭）應立即放入2%的煤酚或0.5%新潔爾滅消毒液內浸泡數小時，然后再用自來水沖洗干凈，必要時還需用蒸餾水淋洗。最后放后烘箱內烘干備用。 載玻片和蓋玻片的洗滌。如玻片上有香柏油，先用二甲苯溶解油垢，再在肥皂水中煮沸10min左右，用自來水沖洗，然后在稀洗滌液中浸泡1h2h，自來水沖去洗滌液，最后用蒸餾水淋洗。等干燥后用95%乙醇中保存備用。(2) 玻璃器皿的包扎培養皿用牛皮紙包裹，或直接放入特制的金屬筒內，進行干熱滅菌。干燥的吸管上端塞入1cm1.5cm棉花，用紙條以

20、螺旋式包扎。包好的多支吸管用牛皮紙包成捆滅菌(3) 玻璃器皿滅菌干熱滅菌 用干燥的熱空氣殺死微生物的方法稱為干熱滅菌。干熱滅菌操作步驟： 裝箱。將包扎好的玻璃器皿放入干熱滅菌箱滅菌專用的鐵盒內，關好箱門。滅菌。接通電源，打開干熱滅菌箱排氣孔，待溫度升至80100時關閉排氣孔。繼續升溫至160170，開始計時，恒溫1h2h。滅菌結束后，關閉電源，自然降溫至60，打開箱門，取出物品放置備用。注意：滅菌物品不能有水，否則干熱滅菌中易爆裂；滅菌物品不能裝得太擠，以免影響溫度上升；滅菌溫度不能超過180，否則棉塞及牛皮紙會燒焦，甚至是燃燒；自然降溫至60以下，才能打開箱門，取出物品，以免因突然降溫導致玻

21、璃器炸裂。 實 驗 記 錄實驗時間： 實驗人員：一、實驗名稱： 二、實驗目的：三、實驗材料：四、實驗環境：五、實驗方法：六、實驗過程：七、實驗結果：八、結果分析：實驗五 培養基的制備1 實驗目的與要求：(1) 學習微生物培養基的制備，了解培養基配方中各成分的作用、制備流程及各環節的操作技術與應用。(2) 學習并掌握培養基的高壓蒸氣滅菌原理、操作關鍵技術和滅菌技術。2 實驗原理(1) 培養基的制備原理培養基是按照微生物生長發育的需要，用不同組分的營養物質調制而成的營養基質。人工制備培養基的目的，在于給微生物創造一個良好的營養條件。把一定的培養基放入一定的器皿中，就提供了人工繁殖微生物的環境和場所

22、。它含有滿足微生物生長發育的水分、碳源、氮源、無機鹽和生長素以及某些特需的微量元素等。此外，培養基還應具有適宜的酸堿度(pH值)和一定緩沖能力及一定的氧化還原電位和合適的滲透壓。固體培養基是在液體培養基中添加凝固劑制成的，常用的凝固劑有瓊脂、明膠和硅酸鈉，其中以瓊脂最為常用，其主要成份為多糖類物質，性質較穩定，一般微生物不能分解，故用凝固劑而不致引起化學成份變化。瓊脂在95的熱水中才開始融化，融化后的瓊脂冷卻到45才重新凝固。因此用瓊脂制成的固體培養基在一般微生物的培養溫度范圍內(2537)不會融化而保持固體狀態。（2） 高壓蒸氣滅菌原理高壓蒸汽滅菌是將待滅菌的物品放在一個密閉的加壓滅菌鍋內，

23、通過加熱，使滅菌鍋隔套間的水沸騰而產生蒸汽。待水蒸汽急劇地將鍋內的冷空氣從排氣閥中驅盡，然后關閉排氣閥，繼續加熱，此時由于蒸汽不能溢出，而增加了滅菌器內的壓力，從而使沸點增高，得到高于100的溫度。導致菌體蛋白質凝固變性而達到滅菌的目的。 在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比干熱大，其原因有三：一是濕熱中細菌菌體吸收水分，蛋白質較易凝固，因蛋白質含水量增加，所需凝固溫度降低，二是濕熱的穿透力比干熱大；三是濕熱的蒸汽有潛熱存在，這種潛熱，能迅速提高被滅菌物體的溫度，從而增加滅菌效力。在使用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌時，滅菌鍋內冷空氣的排除是否完全極為重要，因為空氣膨脹壓大于水蒸汽的膨脹壓，所以，當水蒸汽中含有

24、空氣時，在同一壓力下，含空氣蒸汽的溫度低于飽和蒸汽的溫度。3 實驗器材瓊脂、10HCL、10% NaOH、牛肉膏、蛋白胨、試管、量筒、小燒杯、玻璃棒、骨匙、pH試紙、紗布、棉花、報紙、麻繩、標簽、培養皿、高壓蒸汽滅菌鍋、烘箱、電爐等。4 實驗步驟(1) 稱量：按照培養基配方，準確稱取各成份放于燒杯中。 (2) 熔化：向上述燒杯中加入所需水量，攪勻，然后加熱使其熔解。如是配制固體培養基，在瓊脂熔化的過程中，需不斷攪拌并控制火力不要使培養基溢出或燒焦，待完全熔解后，補充所失水分。如果配方中含有淀粉，則需要將淀粉用少量冷水調成糊狀并在火焰上加熱攪拌后加足水份及其他藥品，待完全熔解后，補充水份。 (3

25、) 調PH值：初制備好的培養基往往不能符合所要求的PH值，故需用PH試紙或酸度計校正，用1M HCl調PH至所需范圍。 (4) 過濾：用濾紙或多層紗布過濾，一般無特殊要求的情況下這一步可以省去。 (5) 分裝：根據不同的需要，可將制好的培養基分裝入試管內或三角瓶內，管（瓶）口塞上棉塞，注意不要使培養基沾在管（瓶）口上以免浸濕棉塞，引起污染。 注意：裝入試管中的量不宜超過試管高度的1/5，裝入三角燒瓶中的量以燒瓶總體積的一半為限。在分裝過程中，應注意勿使培養基沾污管口或瓶口、以免弄濕棉塞，造成污染。(6) 高壓滅菌手提式高壓蒸汽滅菌鍋的使用操作步驟： a 首先將內層滅菌桶取出，再向外層鍋內加入適

26、量的水，使水面與三角擱架相平為宜。 b 放回滅菌桶，并裝入待滅菌物品。注意不要裝得太擠，以免防礙蒸汽流通而影響滅菌效果。三角燒瓶與試管口端均不要與桶壁接觸，以免冷凝水淋濕包口的紙而透入棉塞。c 加蓋，并將蓋上的排氣軟管插入內層滅菌桶的排氣槽內。再以兩兩對稱的方式同時旋緊相對的兩個螺栓，使螺栓松緊一致，勿使漏氣。 d 同時打開排氣閥，使水沸騰以排除渦內的冷空氣。待冷空氣完全排盡后，關上排氣閥，讓鍋內的溫度隨蒸汽壓力增加而逐漸上升。當鍋內壓力升到所需壓力時，控制電源，維持壓力至所需時間。本實驗用1.05kg/cm2，121.3，20分鐘滅菌。 e 滅菌所需時間到后，切斷電源，讓滅菌鍋內溫度自然下降

27、，當壓力表的壓力降至0時，打開排氣閥，旋松螺栓，打開蓋子，取出滅菌物品。如果壓力未降到0時，打開排氣閥，就會因鍋內壓力突然下降，使容器內的培養基由于內外壓力不平衡而沖出燒瓶口或試管口，造成棉塞沾染培養基而發生污染。 f 將取出的滅菌培養基放入37溫箱培養24小時，經檢查若無雜菌生長，即可待用。實 驗 記 錄實驗時間： 實驗人員：一、實驗名稱： 二、實驗目的：三、實驗材料：四、實驗環境：五、實驗方法：六、實驗過程：七、實驗結果：八、結果分析：實驗六 微生物顯微直接計數法1 實驗目的與要求（1） 了解血球計數板的構造和計數原理（2） 掌握使用血球計數板進行微生物計數的方法。（3） 掌握顯微鏡下直接

28、計數的技能。2 實驗基本原理在顯微鏡下對酵母菌活細胞進行計數的常用工具是血球計數板。該計數板是一塊特制的厚型載玻片，計數室的規格有兩種：一種是將計數室分成25個中方格，每個中方格又分為16個小方格。另一種是將計數室分成16個中方格，每個中方格又分成25個小方格。兩種規格計數室都由400個小方格組成。3 實驗材料與儀器顯微鏡、蓋玻片、無菌滴管、血球計數板、計數器、菌種。4 實驗方法和步驟（1）稀釋 根據待測菌懸液濃度，加無菌水適量稀釋，以每小格510個菌體為宜。（2）制片 取一清潔干燥的血球計數板，蓋上蓋玻片。將菌懸液搖均，用無菌滴管吸取少許，沿蓋玻片的邊緣滴一小滴，使其自行滲入計數室。注意不可

29、產生氣泡，兩個平臺都滴加菌液。多余菌液用吸水紙吸去。（3）顯微鏡計數 靜置3min-5min后鏡檢。先用低倍鏡找到計數室（光線不宜太強），然后轉換高倍接物鏡進行計數。計數時，規格為16×25的計數板只計算左上、左下、右上和右下4個中格（即100小格）內的酵母菌數。若是25×16的計數板，除統計上述4個中格外，還需增加中央1個中格（即80小格）的酵母菌數。如菌體位于中方格的雙線上，只統計上線和右線上的菌體數。對于出芽的酵母菌，當芽體達母細胞大小一半時，可作為2個菌體計數。計數時注意轉動細調節器，以便上下液層的菌體均可觀測到。每個樣品重復計數23次（每次數值不應過大，否則重新操

30、作），取其平均值。（4） 計算16×25規格的計數室：細胞數（）=（5） 清洗計數板使用完畢后，用自來水龍頭的急水沖洗，切勿用硬物洗刷。洗后自然晾干或電吹風吹干，也可用濾紙吸干水份后再用擦鏡紙擦干，鏡檢計數室內無殘留菌體或其它沉淀物即可。否則應重新清洗干凈。實 驗 記 錄實驗時間： 實驗人員：一、實驗名稱： 二、實驗目的：三、實驗材料：四、實驗環境：五、實驗方法：六、實驗過程：七、實驗結果：八、結果分析：實驗七 微生物細胞大小的測定1 本次實驗的目的和要求 觀察并掌握菌種個體形態和菌落特征、學習測微技術，測量細菌的大小。2 實驗內容或原理微生物細胞的大小可使用測微尺測量。測微尺由目鏡

31、測微尺和鏡臺測微尺兩部分組成。鏡臺測微尺是一塊在中央有精確刻度尺的載玻片。刻度尺總長1mm，等分為100小格，每小格為0.01 mm(即10um)，是專用來標定目鏡測微尺在不同放大倍數下每小格的實際長度。目鏡微尺是一塊圓形的特制玻片，其中央是一個帶刻度的尺，等分成50或100小格。每小格的長度隨顯微鏡的不同放大倍數而定，測定時需用鏡臺測微尺進行標定，求出在某一放大倍數時目鏡測微尺每小格代表的實際長度，然后用標定好的目鏡測微尺測量菌體大小3 需用的儀器或試劑鏡臺測微尺、顯微鏡、載玻片及蓋玻片、接種針、0.1%美藍液、孔雀綠染液、菌種。4 實驗步驟（1） 酵母菌菌體大小的測定 取下鏡臺測微尺，放好

32、事先做好的酵母菌涂片在低倍鏡找到目的物用高 倍鏡或油鏡測菌體大小（d）（目鏡測微尺格數×相應放大倍數下每格標定長度） 測定1020株菌體，求出平均值，即為該種酵母菌的大小。 （2） 酵母菌數量的測定 稀釋樣品，（取少量酵母菌100ml水中）標準：每小格內約有5-10個菌體。 檢測血球計數板的清潔度（不潔凈要重新清洗）。 加樣 把蓋玻片放在計數室上，吸取少量稀釋液于蓋玻片邊緣，使其自行滲入（多余菌液濾紙吸去）。 計數 將血球計數板放在載物臺上，低倍鏡下找計數室，于高倍鏡下找到清晰的計數室線條。按下述方法取值： 25中方格：5個中方格中的菌體數 16中方格：4個中方格中的菌體數 注意：方

33、格邊線上的只計算上方邊線和右邊線上的菌出芽生殖狀態的菌，視芽體大小而定，當其體積達母細胞一半時，即視作兩個菌體。 計數一個樣品要從兩個計數室中計得的值來取平均值 計算公式 菌細胞數/ml=每小格中菌數平均數×400×104×稀釋倍數 清洗血球計數板 較大水流沖洗（均勻刷洗）自行晾干。 實 驗 記 錄實驗時間： 實驗人員：一、實驗名稱： 二、實驗目的：三、實驗材料：四、實驗環境：五、實驗方法：六、實驗過程：七、實驗結果：八、結果分析：實驗八 菌種的分離純化1 實驗目的和要求學習采集樣品，分離純化微生物菌種的方法步驟2 實驗內容或原理從混雜的微生物群體中獲得只含有某一

34、種微生物的過程稱為微生物的分離純化。欲從含有多種微生物的樣品中直接辯認出，并且取得某種所需微生物的個體，進行純培養，那是困難的。由于微生物可以形成菌落，而每個單一菌落常常是由一種個體繁殖而成，菌落又是可以識別和加以鑒定的。因此將樣品中不同微生物個體在特定的培養基上培養出不同單一菌落，再從選定的某一菌落中取樣，移植到新的培養基中去，就可以達到分離純化的目的。這也就是常用純種分離法的原理。3 需用的儀器或試劑等培養基、試管、培養皿、三角瓶、接種環、酒精燈、恒溫恒濕培養箱。4 實驗步驟(1) 采樣，樣品稀釋 稀釋土樣。稱取1g樣品，在火焰旁加到有99mL無菌水和少許玻璃珠的三角瓶內，振蕩10min，

35、使土壤和水樣充分混合，將菌分散，土樣中的菌樣被稀釋了100倍，土壤懸液的稀釋度為10-2。在火焰處打開無菌吸管的紙套，用無菌吸管吸取土壤懸液1ml，加到一個盛有9ml無菌水的試管內，稀釋1000倍制成稀釋度為10-3的土壤懸液，將此吸管在試管內反復吹洗3次，然后取出，通過火焰，再插入紙套內，以備再用。輕輕搖動試管，使菌液均勻。再用剛才用過的吸管，插入試管內，反復吹洗3次，然后取出1ml菌液，加到另一支9 ml無菌水中，制成稀釋度為10-4的土壤懸液備培養基平板同法按每級稀釋10倍的次序得到10-5、10-6的土壤稀釋液，稀釋完后，用最后一支吸管，由最小的稀釋液（10-6）開始吸取0.2ml加到

36、編號為10-6的培養皿，再依次分別從10-5、10-4試管中各吸取0.2ml稀釋液，加到相應編號的培養皿內，每次吸取時，吸管都要在稀釋液中反復吹洗幾次。(2) 制備培養基平板 (3) 平板畫線法分離培養a 平板的制作及培養。將已滅菌的牛肉膏蛋白胨固體培養基水浴融化后冷卻至4550（溫度過高，培養皿蓋上凝結水太多，菌易被沖掉或燙死；溫度過低，培養基凝固不易倒出）。傾倒培養基應在酒精燈火焰附近操作，右手持盛培養基的三角瓶（或試管），左手拿培養皿，并松動三角瓶的棉塞。培養基一次不能用完時，棉塞應用左手小指夾持，不可放在桌面上，拔出棉塞后，三角瓶口在火焰上滅菌，然后少許打開培養皿蓋，迅速傾入培養基，迅

37、速將皿蓋蓋妥，平放桌上，輕輕旋轉，使培養基與懸液混合均勻，待凝固后，即成平板。將培養皿倒置于37恒溫箱中培養24h，細菌即在所固定的位置長成肉眼可見的菌落。放線菌的稀釋分離法同前，只不過在制土壤懸液時，于99ml無菌水的三角瓶內加入10%的苯酚溶液10滴，以抑制細菌生長，28恒溫箱中培養7 d10d。b 平板劃線分離法將融化的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基制成平板，待冷凝后，左手持平板，右手持接種針，用接種環在火焰上滅菌后沾取一環適宜稀釋度的懸液，在火焰附近用左手拇指、食指掀開皿蓋，使接種環輕觸培養基，迅速劃線（注意勿將培養基劃破），劃線時，接種環與培養基表面的夾角為2030°。常用的劃線方

38、式有兩種,一種是將平板分成三個區域，先在第一個區域內劃34條平行線，轉動培養皿，在火焰上燒掉接種環上的殘余物后，通過第一次劃線部分，在第二個區域內劃線；第二個區域中的線和第一個區域中的線應有部分交叉，依法在第三個區域中劃線。另一種是先以沾有細菌懸液的接種環在平板的一端抹一下，使該處沾上一些細菌，然后燒掉環上剩下的細菌，再用燒過冷卻的接種環，通過剛才涂抹的部分，左右劃線，不能互相接觸。劃線分離對細菌、酵母菌較為適宜，而霉菌和放線菌的分離多采用稀釋分離法。分離純化工作可反復進行，直至獲得滿意的單菌落純培養為止。（4）觀察、鏡檢、純培養實 驗 記 錄實驗時間： 實驗人員：一、實驗名稱： 二、實驗目的

39、：三、實驗材料：四、實驗環境：五、實驗方法：六、實驗過程：七、實驗結果：八、結果分析：實驗九 食品中菌落總數的測定1 實驗目的和要求掌握菌落計數的方法，掌握食品細菌菌落總數的測定報告方式。2 實驗內容或原理菌落總數是指食品經過處理，在一定條件下培養后，所得1g或1ml檢樣中所含細菌菌落總數。菌落總數主要作為判別食品被污染程度的標志，也可以應用這一方法觀察細菌在食品中繁殖的動態過程，以便對被檢樣品進行衛生學評價時提供依據。菌落總數并不表示樣品中實際存在的所有細菌總數，菌落總數也并不能區分其中細菌的種類，所以有時被稱為雜菌數，需氧菌數等。3 實驗材料與儀器食品檢樣、牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基、無菌生理

40、鹽水、無菌培養皿、無菌移液管、無菌不銹鋼勺。 4 實驗步驟（1）取樣、稀釋和培養a 以無菌操作取檢樣25g（或ml），放于225ml滅菌生理鹽水的滅菌玻璃瓶內（瓶內預置適量的玻璃珠），經充分振要或研磨制成1：10的均勻稀釋液。b 用1ml滅菌吸管吸取1：10稀釋液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml滅菌生理鹽水的試管內，振搖試管混合均勻，制成1：100的稀釋液。c 另取1ml滅菌吸管，按上項操作順序，制10倍遞增稀釋液，如此每遞增稀釋一次即換用1支10ml吸管。d  根據標準要求或對污染情況的估計，選擇23個適宜稀釋度，分別在制作10倍遞增稀釋的同時，以吸取該稀釋度的吸管移取1ml稀釋液

41、于滅菌平皿中，每個稀釋度做兩個平皿。e  稀釋液移入平皿后，將涼至4550牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基注入平皿約15ml，并轉動平皿，混合均勻。同時將牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基傾入加有1ml稀釋液（不含樣品）的滅菌平皿內作空白對照。f  待培養基凝固后，翻轉平板，置37溫箱內培養48h，取出計算平板內菌落數目，乘以稀釋倍數，即得每克（每毫升）樣品所含菌落總數。(2)  菌落計數方法作平皿菌落計數時，可用肉眼觀察，必要時用放大鏡檢查，以防遺漏。在記下各平皿的菌落總數后，求出同稀釋度的各平皿平均菌落數。到達規定培養時間，應立即計數。如果不能立即計數，應將平板放置于04，但不要超

42、過24h。(3) 菌落計數報告方法a 平皿菌落數的選擇選取菌落數在30300之間的平皿作為菌落總數測定標準。每一個稀釋度應采用兩個平皿平均數，其中一個平皿有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應以無片狀菌落生長的平皿作為該稀釋度的菌落數，若片狀菌落不到平皿的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，則可以計算半個平皿后乘以2以代表全皿菌落數。b  稀釋度的選擇 應選取平均菌落數在30300之間的稀釋度報告細菌菌落總數是指檢樣在培養基上3724小時培養所長出的菌落數。菌落總數的多少可以說明污染的程度。 若有二個稀釋度均在30300之間時，應以二者比值決定，比值 2取平均數，比值>2則其較

43、小數字。 若所有稀釋度均>300，則取最高稀釋度的平均菌落數乘以稀釋倍數。 若所有稀釋度均<30，則以最低稀釋度的平均菌落數乘稀釋倍數。 若所有稀釋度均不在30300之間，有的>300，有的又<30，則應以最接近300或30的平均菌落數乘以稀釋倍數。c 菌落計數報告方法菌落數在1100時，按實有數字報告，如大于100時，則報告前面兩位有效數字，第三位數按四舍五入計算，為了縮短數字后面的零數，也可以10的指數表示。實 驗 記 錄實驗時間： 實驗人員：一、實驗名稱： 二、實驗目的：三、實驗材料：四、實驗環境：五、實驗方法：六、實驗過程：七、實驗結果：八、結果分析：

44、實驗十 食品中大腸菌群的測定1實驗目的和要求學習食品中大腸菌群檢測程序方法，掌握食品中大腸菌群檢測結果的報告方式。2實驗內容或原理大腸菌群系指一群能發酵乳糖、產酸產氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。該菌主要來于人畜糞便，故以此作為糞便污染指標來評價食品的衛生質量，推斷食品中有否污染腸道致病菌的可能。食品中大腸菌群數是以100ml(g)檢樣內大腸菌群最可能數(MPN)表示。本實驗學習多管發酵法檢測食品中的大腸菌群。a 初發酵試驗用于初步發酵試驗的液體培養基含有乳糖、蛋白胨和溴甲酚紫。許多細菌不能發酵乳糖，而大腸菌群可發酵乳糖產酸（有機酸），產氣（CO2+H2）。乳糖起選擇性碳源的作用。溴

45、甲酚紫是pH指示劑（堿性條件：紫蘭色；酸性條件：黃色，變色點pH=6.7），當大腸菌群的細菌利用乳糖產酸后，使原來的pH由中性下降成酸性，培養基從紫色變為黃色。另外，溴甲酚紫還具有抑制其他細菌生長的作用。b 平板分離為進一步證明大腸菌群的存在，需進行平板分離，所用培養基為伊紅美藍瓊脂。伊紅美藍瓊脂培養基中含有伊紅與美藍兩種苯胺類染料，可以抑制G+菌和一些難培養的G-菌，而且在低酸度時，兩種染料結合形成沉淀，起著產酸指示劑的作用。大腸菌群因其強烈發酵乳糖而產生大量混合酸，使菌體表面帶上正電荷，可染上伊紅染液，伊紅與美藍結合，菌體被著上深紫色，形成帶核心、具金屬光澤的特征性菌落。c 復發酵試驗陽性

46、菌落經涂片染色鑒別為G-，無芽孢者，再經過乳糖發酵管液體培養進行復發酵試驗，經24h培養產酸產氣者，可確認為大腸菌群陽性結果。3 實驗材料與儀器食品檢樣、乳糖蛋白胨發酵管、伊紅美藍瓊脂平板、EC 肉湯、磷酸鹽緩沖稀釋液、蛋白胨稀釋液、無菌生理鹽水、革蘭氏染色液、恒溫箱、冰箱、恒溫水浴、天平、顯微鏡、直徑為90mm的平皿、試管、吸管、廣口瓶或三角燒瓶、玻璃珠、載玻片、酒精燈、試管架。4 實驗操作步驟（1） 檢樣處理液態檢樣可用振搖的方式，使充分均勻混合后，取50ml加入 450ml已滅菌的稀釋液中，即為10倍稀釋檢液。凝態及濃稠液態檢體如布丁、煉乳等,經適當攪拌均勻后，取50g加入450ml滅菌

47、之稀釋液中，用攪拌均質器攪拌(攪拌方法同前)，即為10倍稀釋檢液。（2） 檢樣稀釋以無菌操作將上述處理樣25ml放于有225ml滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶內(瓶內予置適當數量的玻璃珠)，經充分振搖后，制成1:10的均勻稀釋液。用1ml滅菌吸管吸取1:10稀釋液1ml，注入含有9ml滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管內，振搖試管混勻，制成1:100的稀釋液。另取1ml滅菌吸管，按上條操作依次做10倍遞增稀釋液,每遞增稀釋一次，換用1支1ml滅菌吸管。根據食品衛生標準要求或對檢樣污染情況的估計，選擇三個稀釋度，每個稀釋度，接種3管。（3） 初發酵試驗將已選擇的稀釋檢液及原液(液體檢樣)充分振

48、搖、混合均勻后,分別吸取1ml接種于已裝有9ml乳糖膽鹽發酵管內（內倒置小管）。接種量在1ml以上者，用雙倍乳糖膽鹽發酵管（內倒置小管），1ml及1ml以下者，用單倍乳糖膽鹽發酵管（內倒置小管）。每一稀釋度接種3管，置37 溫箱內，培養24h，如所有乳糖膽鹽發酵管都不產氣，則可報告為大腸菌群陰性，如有產氣者，則按下列程序進行。（4） 分離培養經24h培養后，將產氣（倒管頂部有空氣）的發酵管分別轉種在伊紅美藍瓊脂平板上，置37 溫箱內，培養24h，然后取出，觀察菌落形態，并做革蘭氏染色和證實試驗。（5） 復發酵試驗在上述平板上，挑取可疑大腸菌群菌落12個進行革蘭氏染色，同時接種乳糖發酵管，置 37溫