1、亞油酸修飾羧甲基殼聚糖納米粒固定化菠蘿蛋白酶的研究* 本課題為山東省優秀中青年科學家科研獎勵基金資助（200603044）。通訊作者：劉晨光 副教授 傳真：86+532+82932586。 E-mail: liucg。 第一作者：譚玉龍 碩士研究生。收稿日期：2007年月日。譚玉龍，劉晨光，劉成圣，于樂軍（中國海洋大學 海洋生命學院，青島266003）酶的固定化技術有很多優點，它可以顯著提高酶的活力和穩定性，使酶可以在極端的pH和溫度下進行反應。不同的劑型已應用于酶的固定化，比如薄膜（Tanioka et al. 1998, Arica 2000），微球（Wu et al. 2005），納米粒

2、（Akiyoshi et al. 1998, Li et al. 2003, Tang et al. 2007）等。最近，納米材料因為其特別的性質與廣泛的應用已越來越多地引起人們的關注，納米膠束和納米粒已被用于固定化酶。由聚乙二醇-聚天冬氨酸嵌段共聚物制備的納米膠束可用來包埋酶分子（溶菌酶、胰蛋白酶）（Harada et al., 1998, 2001, Yuan et al. 2005）。Sunamoto的研究小組（Akiyoshi et al. 1998）曾合成了普魯蘭糖的膽甾烯基衍生物，可在水中自聚集成凝膠納米粒，并可與胰島素等藥物形成穩定的復合物。在以往的研究中發現胰蛋白酶可負載于納米

3、粒上（Liu et al. 2005），這與氯鍵疏水作用力以及離子相互作用有關。但固定化酶的性質（比如穩定性、動力學常數等）還需要進一步研究。本文作者采用亞油酸修飾羧甲基殼聚糖，通過超聲的方法制備凝膠納米粒。選擇菠蘿蛋白酶應用于實驗因為其在動物炎癥及人類炎性腸病等方面都有積極的治療作用。酪蛋白作為酶解反應的底物。將菠蘿蛋白酶固定于納米粒上。探討了影響固定化酶活力的因素（包括溫度、儲存穩定性等）。結果表明，酶被固定化后，熱穩定性及儲存穩定性均有提高。固定化酶的Km值小于自由酶，表明固定化可以提高酶的穩定性并加強酶與底物的親和力。一、材料及方法1. 化學試劑殼聚糖（低分子量），亞油酸（LA），1乙

4、基3（3二甲基氨丙基）碳二亞胺（EDC），菠蘿蛋白酶均購于Sigma公司。其他試劑都采用分析純。2. 制備方法（1）制備羧甲基殼聚糖（CMCS）Na型羧甲基殼聚糖的制備：稱取5g殼聚糖于三口燒瓶中，加入100ml水/異丙醇（v/v=1/1），攪拌，使其溶脹。加入6.75g NaOH，50攪拌1h。讓殼聚糖在堿性條件下膨脹, 形成堿化中心。將7.5g氯乙酸溶于10ml異丙醇，溶解后加到分液漏斗，向三口燒瓶中滴加，控制滴加時間30min, 50攪拌4h。反應結束后，布氏漏斗抽濾，70%、80%、90%乙醇水溶液、無水乙醇洗滌。所得產品放入60烘箱烘干, 即得白色粉狀羧甲基殼聚糖（Na型）。H型羧甲

5、基殼聚糖的制備：稱取2.5g Na型羧甲基殼聚糖，加入100ml 80%乙醇水溶液，攪拌。再加入10ml 37% HCl溶液，攪拌30min。布氏漏斗抽濾，70%、80%、90%乙醇水溶液、無水乙醇洗滌。所得產品放入60烘箱烘干,即得白色粉狀羧甲基殼聚糖（H型）。（2）制備亞油酸羧甲基殼聚糖（LA-CMCS）首先取1g羧甲基殼聚糖溶解于100ml 1%的醋酸溶液(pH4.6)中，然后分別取1ml、1.5ml、2ml亞油酸溶于100ml甲醇中。將兩溶液混合，加1mlEDC，攪拌24h后，加入200ml甲醇/氨水（體積比為7：3），攪拌，5000rpm/s，離心30min，去除上清。將沉淀分別用甲

6、醇洗兩次，乙醚洗一次，每次洗滌后都要進行5000rpm/s，離心30min，去除上清。室溫真空干燥24h。（3）制備負載菠蘿蛋白酶的LA-CMCS納米粒10mg LA-CMCS懸浮于10ml PBS緩沖液(pH7.4)。冰浴中用探頭超聲(Utralsonic homogenizer UH-600)，超聲重復兩次得到澄清透明溶液(20W，工作10S，停2s)。加入不同濃度的菠蘿蛋白酶溶液，然后再分別超聲兩次。（4）載藥量和包封率將不同濃度的菠蘿蛋白酶溶液加到1ml 0.2mg/ml的納米粒溶液中，濃度從0.05mg/ml到0.4mg/ml。將混合液超聲，然后超濾，得到固定化酶。通過檢測未固定化的

7、酶含量來計算納米粒對酶的的負載量與包封率。載藥量=（A-B）/C×100包封率=（A-B）/A×100A為加入的菠蘿蛋白酶含量；B為超濾后未固定化的菠蘿蛋白酶含量；C為冷凍干燥后的納米粒質量。（5）測定自由酶和固定化酶的酶活力取2ml酶液加入試管中,然后加入1%的酪蛋白溶液3ml,準確保溫37反應10min,再加入5ml三氯乙酸以終止反應, 搖勻。空白試樣,方法同上,僅在加酪蛋白溶液之前,先加入5ml三氯乙酸使酶失活,再加入酪蛋白溶液。以空白樣做對照,用分光光度計280nm波長測定試樣的吸光度(O.D)。結果取三次測定的平均值。（6）菠蘿蛋白酶活力單位將一個酶活力單位在標準

8、實驗條件下 (pH7.4，37時，反應10min），1min內水解酪蛋白產生1mg溶于三氯乙酸的酪氨酸時所需要的酶量。二、結果與討論1. 納米粒表征亞油酸通過EDC共價連接于羧甲基殼聚糖的氨基上（圖1）。紅外譜圖及核磁共振譜圖表明，共價連接成功。平均粒徑與粒徑分布通過動態激光光散射儀來分析，平均粒徑約為417.8 ± 17.8 nm (Liu et al. 2007)。透射電子顯微鏡照片顯示納米粒有完整的圓形結構（圖2）。2. 納米粒的載藥量與包封率納米粒對菠蘿蛋白酶的負載量與包封率如表1所示，一方面，隨加入酶的濃度的增加，從0.05到0.3mg/ml，納米粒的包封率逐漸下降；另一方

9、面，酶的負載量卻從20.68±0.37%增加到 94.19±1.12%。但是，當濃度到達0.4mg/ml時，負載量卻沒有顯著增加，表明納米粒負載菠蘿蛋白酶約0.3mg/ml時達到飽和。3. 溫度對酶活力的影響在2080下測定自由酶與固定化酶的活力（圖3），其最適溫度相同，固定化酶的最適溫度（60）也未改變。熱穩定性是固定化酶的一個重要指標，將固定化酶和自由酶保存于0.05mol/L的PBS緩沖圖1亞油酸羧甲基殼聚糖的結構圖表1載藥量和包封率菠蘿蛋白酶 (mg/ml) 包封率 (%) 載藥量 (%)0.05 82.72±1.47 20.68±0.370.1

10、 71.57±1.32 35.79±0.660.2 64.83±1.69 64.83±1.690.3 62.79±0.75 94.19±1.120.4 49.28±0.49 98.55±0.98圖2納米粒的透射電鏡照片液(pH7.4)中，在不同溫度下保存1h，迅速冷卻測其酶活力。在不同溫度下保存后的相對酶活力，隨著溫度升高，相對酶活力均有所下降（圖4）。從圖中看出固定化酶的熱失活曲線比自由酶要低。在90保存1h后，固定化酶保持了19%的相對活力，而自由酶在同樣的實驗條件下，幾乎喪失了全部活力。固定化酶熱穩定性的提高

11、是因為酶和納米粒之間的多重的作用（比如離子相互作用、氫鍵結合以及疏水作用力等）。有一部分菠蘿蛋白酶被包裹于納米粒內部，這可以保護酶的結構使其免受高溫的破壞。納米?？梢灶A防蛋白質不可逆的變性聚集，其機制類似于分子伴侶的作用(Akiyoshi et al. 1999, Takehiro et al. 1994, Nomura et al. 2003) 。不論是從結構上還是從酶活力上，納米粒均可顯著提高酶分子抵御變性的能力和熱穩定性，所以其可作為有效的酶固定化材料(Bryjak et al., 1998, Hsieh et al. 2000, Karim et al., 2002, Li et al

12、. 2003, Wu et al. 2005, Tu et al. 2006) 。圖3 溫度對酶活力的影響圖4 自由酶和固定化酶的熱穩定性4. 儲存穩定性在無底物存在的情況下，將固定酶和自由酶在70下分別保存20 min120 min, 迅速冷卻后, 測其活力(圖5)，固定化酶的穩定性曲線比自由酶要高，表明固定化酶的穩定性有顯著地提高。5. Km米氏常數Km是酶的一個重要參數，它的物理意義就是催化反應速度達到最大速度一半時的底物濃度。Km一般用來檢驗酶與底物形成復合物的親和能力。自由酶和固定化酶的米氏常數的測定(圖6),納米粒固定酶后，對酶與底物之間的結合影響很小。固定化酶的Km為0.36，比

13、自由酶的0.68略低，表明固定化酶加強了酶與底物的親和力。原因可能是固定化過程對酶的構象有影響，以及納米粒與酪蛋白之間的電荷作用或疏水作用也加強了酶對底物的親和力。其機制還需要進一步研究。這一結果也與Tang等(2007)的研究結果一致，這使其在將來的應用性上更有吸引力 (Tang et al. 2007) 。圖5 自由酶和固定化酶的儲存穩定性圖6 自由酶和固定化酶的Line-weaver Burk 曲線參 考 文 獻Akiyoshi, K. , Kobayashi, S. , Shichibe, S. , et al.1998. Self-assembled hydrogel nanopar

14、ticle of cholesterol-bearing pullulan as a carrier of protein drugs: Complexation and stabilization of insulin, J. Control. Release, 54: 313320 Akiyoshi, K. , Sasaki, Y. , Sunamoto, J. . 1999. Molecular chaperone-like activity of hydrogel nanoparticles of hydrophobized pullulan: thermal stabilizatio

15、n with refolding of carbonic anhydrase B, Bioconjugate Chem. , 10: 321324Arica, M. Y. . 2000. Epoxy-derived pHEMA membrane for use bioactive macromolecules immobilization: Covalently bound urease in a continuous model system, J. Appl. Polym. Sci. , 77:20002008Bryjak, J. , Kolarz, B. N. 1998. Immobil

16、ization of trypsin on acrylic copolymers, Process Biochem. , 33: 409417Harada, A. , Kataoka, K. 1998. Novel polyion complex micelles entrapping enzyme molecules in the core: Preparation of narrowlydistributed micelles from lysozyme and poly (ethylene glycol)-poly (aspartic acid) block copolymer in a

17、queous medium, Macromolecules, 31: 288294Harada, A. , Kataoka, K. . 2001. Pronounced activity of enzymes through the incorporation into the core of polyion complex micelles made from charged block copolymers, J. Control. Release, 72: 8591Hsieh, H. J. , Liu, P. C. , Liao, W. J. 2000. Immobilization o

18、f invertase via carbohydrate moiety on chitosan to enhance its thermal stability, Biotechnol. Lett. , 22: 14591464Karim, M. R. , Hashinaga, F. 2002. Preparation and properties of immobilized pummelo limonoid glucosyltransferase, Process Biochem. , 38: 809814Li, J. , Wang, J. Q. , Gavalas, V. G. , et

19、 al. .2003. Alumina-Pepsin Hybrid Nanoparticles with Orientation-Specific Enzyme Coupling, NANO Lett. , 3, 5558Liu, C. G. , Chen, X. G. , Park, H. J. .2005. Self-assembled nanoparticles based on linoleic-acid modified chitosan: Stability and adsorption of trypsin, Carbohyd. Polym. , 62: 293.298Liu,

20、C. G. , Fan, W. , Chen, X. G. . 2007. Self-assembled nanoparticles based on linoleic-acid modified carboxymethyl-chitosan as carrier of adriamycin (ADR), Curr. Appl. Phys. , 7S1 e125e129Nomura, Y. , Ikeda, M. , Masahiro, I. , et al. 2003.Protein refolding assisted by self-assembled nanogels as novel

21、 artificicial molecular chaperone, Febs Lett. , 553: 271276Takehiro, N. , Kazunari, A. , Junzo, S. . 1994.Supramolecular Assembly between Nanoparticles of Hydrophobized Polysaccharide and Soluble Protein Complexation between the Self-Aggregate of Cholesterol-Bearing Pullulan and -Chymotrypsin, Macro

22、molecules, 27: 76547659Tang, Z. X. , Qian, J. Q. , Shi, L. E. , 2007, Characterizations of immobilized neutral lipase on chitosan nano-particles, Mater. Lett. , 61: 37-40.Tanioka, A. , Yokoyama, Y. , Miyasaka, K. 1998.Preparation and properties of enzyme- immobilized porous polypropylene films, J. C

23、olloid Interf. Sci. , 200:185187Tu, M. B. , Zhang, X. , Kurabi, A. , et al. . 2006. Immobilization of -glucosidase on Eupergit C for lignocellulose hydrolysis, Biotechno. Lett. , 28: 151156Wu, S. G. , Liu, B. L. , Li, S. J. 2005. Behaviors of enzyme immobilization onto functional microspheres, Int.

24、J. Biol. Macromol. , 37: 263267Yodoya, S. , Takagi, T. , Kurotani, M. , et al. . 2003.Immobilization of bromelain onto porous copoly (-methyl-L-glutamate/L-leucine) beads, Eur. Polym. J. , 39: 173180Yuan, X. , Yamasaki, Y. , Harada, A. , et al. .2005.Characterization of stable lysozyme-entrapped polyion complex (PIC) micelles with crosslinked core by glutaraldehyde, Polymer, 46: 77497758STUD ON LINOLEIC ACID MODIFIED CARBOXYMEHYL CHITOSAN NANOPARTI