1、1. GFP在蛋白質相互作用研究中的應用在活體內檢測蛋白與蛋白相互作用，對我們理解生物學過程至關重要。研究蛋白質相互作用的經典技術是酵母雙雜交系統。它是一個基于轉錄因子模塊結構的遺傳學方法，由Fields和Song等人于1989年首次建立，隨后在蛋白相互作用研究領域廣泛應用。酵母雙雜交系統的實驗過程，就是將已知蛋白作為誘餌蛋白，在系統中捕獲與其相互作用的蛋白質。來源于水母的GFP在此系統中得到了廣泛應用，人們可用它直接監測蛋白質與蛋白質的相互作用。科學家利用兩個增強型GFP（EGFP）片段重建功能，從而開發出一種新型的報告系統以應用于酵母雙雜交系統。該系統在基因水平上將EGFP片段分別與誘餌蛋

2、白及要捕獲的蛋白融合，在體內共表達，從而研究蛋白與蛋白間的相互作用。與現有的酵母雙雜交系統相比，EGFP系統中的誘餌、靶蛋白載體的報告基因和復制控制元件均得到了改進。在酵母中，當蛋白與蛋白發生相互作用時，分開的EGFP能夠重新結合而發出熒光(圖7)1.1 構建分離的EGFP報告質粒以分離的EGFP作為酵母雙雜交系統的報告基因有明顯的優勢，因為它不需要外源底物及輔助因子就能發出熒光。從理論上講，該報告系統的基礎是酵母中蛋白與蛋白間發生相互作用后，被分開的熒光蛋白片段會再次互相結合從而發出熒光。EGFP報告質粒包括pNEGFP和pCEGFP。構建模式見圖8。在乙醇脫氫酶1（ADH1）啟動子控制下，

3、誘餌蛋白質粒編碼的EGFP N-末端（NEGFP, 1-158位氨基酸）及靶蛋白質粒編碼的EGFP C-末端（CEGFP, 159-239位氨基酸）能夠被組成型表達，其轉錄被ADH1終止子序列終止。構建的EGFP報告質粒pNEGFP和pCEGFP分別為色氨酸和亮氨酸選擇性，并且它們都是攜帶有低拷貝數起始位點（CEN6/ARS4起始位點）的著絲粒質粒。這些低拷貝數的質粒降低了蛋白表達水平，從而解決了酵母細胞中的蛋白毒性問題。為了克隆操作的方便，在質粒的多克隆位點（MCS）還引入了BamH I、Sal I及Pst I等其它克隆位點。另外，為了評價周圍的結構域會否會產生空間位阻效應，研究人員還分析了

4、由多種不同方法構建的EGFP報告系統，進行構象優化。下文將以酵母GAL4DD與GAL11P的相互作用為例，說明該系統的功能。1.2 以分離的EGFP為報告系統的酵母雙雜交系統為了驗證當酵母中的蛋白間發生相互作用時，被分離的EGFP會互補結合，研究人員以GAL4DD作為誘餌蛋白，GAL11P作為靶蛋白進行了實驗。在蛋白與蛋白相互作用的研究中，經常使用這兩種蛋白作為對照。實驗中，研究人員將含有GAL11P的pCEGFP質粒（pCEGFP:GAL11P）與包含GAL4DD的pNEGFP:GAL4DD質粒一起轉入酵母細胞，這樣酵母就會含有pCEGFP:GAL11P和pNEGFP:GAL4DD兩個質粒，

5、這兩個質粒均可用于研究熒光重建。另外，由于EGFP片段（NEGFP和CEGFP）的空間位阻效應可能會影響到熒光發色基團的形成，為了確定合適的融合蛋白空間結構，研究人員構建了不同組合的EGFP報告質粒，它們能夠表達不同的EGFP片段組合（圖9）。將NEGFP和CEGFP融合載體轉入YM4217酵母中（該酵母是ura3-52、his3-200、leu2-3和trp1-901突變株），同時添加Ura、His、Leu和Trp。為了確定酵母細胞是否含有相應的質粒，采用表1中NEGFP和CEGFP融合蛋白特異引物進行PCR擴增。得到的PCR產物經1%瓊脂糖電泳分離后，分別得到594bp（1N-5N）、47

6、4bp（6N）、513bp（1C-4C, 6C）、243bp（5C）的擴增產物。如圖10a所示，相應的594bp（1N-5N）、474bp（6N）、513bp（1C-4C, 6C）、243bp（5C）PCR產物只存在于轉入后的酵母中，不存在于用作對照的YM4217酵母中，這說明在酵母雙雜交系統中可以使用不同的選擇標記。為了確定酵母雙雜交系統能否產生熒光，研究人員在共聚焦顯微鏡下觀察表達NEGFP和CEGFP融合蛋白的YM4271酵母。計數發出熒光的酵母細胞后，他們發現在不同的NEGFP和CEGFP構建方式下，熒光重建效率不同，說明空間效應會影響熒光蛋白的互補結合。如圖10b所示，以全長EGFP

7、作為陽性對照，熒光重建率（R/E）為67%；而陰性對照，即未轉染的酵母細胞根本不發出熒光。表2總結了相關的熒光重建率百分比。設定酵母細胞轉染效率為100%，另外還評估了分離的EGFP相對于陽性對照的重建率百分比，數據為三個獨立樣品的平均值。如圖10b和表2所示，以pNEGFP和pCEGFP兩個空載體轉染作為空白對照，EGFP重建率為14.9%。NEGFP:GAL4DD與CEGFP:GAL11P發生相互作用（圖9組合1），與EGFP陽性對照相比，EGFP重建率達到40.1%。與此形成鮮明對比的是，NEGFP:GAL4DD與GAL11P:CEGFP融合蛋白的重建率只有19.4%（圖9組合2）。正如

8、預料一樣，NEGFP:GAL4DD與pCEGFP空載體（圖9組合5）不會發生相互作用，作為非特異性對照，其與空白對照（空載體，NEGFP+CEGFP）重建效率相當。pNEGFP空載體與pCEGFP:GAL11P質粒（圖9組合6）共轉染的重建效率也相當低，只有17.9%，并且不會發出熒光。此外，GAL4DD: NEGFP融合蛋白無論與CEGFP:GAL11P還是GAL11P: CEGFP（圖9組合3、4）的重建效率都很低，分別為19.4%和13.4%，都不會發出熒光。這些發現表明，分子結構造成的空間位阻效應使得熒光沉積失敗。研究證明，如果NEGFP和CEGFP分別在誘餌蛋白和靶蛋白的N-末端就不會產生嚴重的空間位阻，從而形成熒光團發出熒光。總之，在以EGFP為報告基因的酵母雙雜交系統中，當誘餌蛋白與靶蛋白相互作用