1、2010/11/15:炎癥動物免疫試驗方案(天津科技大學食品與生物技術實驗室)一目的從類黃酮和異黃酮針對黃n票吟氧化酶(xanthine oxidase)和環氧合酶-2(cyclooxygenase-2) 雙酶抑制劑通過計算機虛擬篩選出的九種天然產物在小鼠體內屮免疫保護效果的研究，為制 定炎癥通風的臨床研究方案和藥物提供實驗依據。二材料 從類黃酮和異黃酮篩選出的九種天然產物：luteolin, apigenin, scutellarein, quercetin, myricetin, genistein, isoquercitrin, rutin, hyperoside. xo及cox-2是痛

2、風治療過程屮的兩個重要靶點，篩選xo和cox-2雙重抑制 劑可以從多靶點的途徑有效的控制炎癥相關疾病如痛風的發生和發展。另外，x0以及 cox-2也是各種癌癥及其他重要疾病的重要靶點，本試驗室己從天然產物采用計算機輔助 篩選x0及cox-2的雙重抑制劑，得到的天然產物黃酮為九種：luteolin, apigenin, scutellarein, quercetin, myricetin, genistein, isoquercitrin, rutin, hyperoside.由于淋巴細胞是人體最主要的免疫細胞，由該細胞介導的這種炎癥反應在各種風濕、 痛風等疾病，尤其是類痛風炎癥病理過程川起著主

3、導作用，這類免疫性炎癥模型對研究抗炎 抗痛風藥物具有重要價值。因此在細胞水平上建立t淋巴細胞模型-這類免疫性炎癥模型對 研究抗炎抗痛風藥物具有重要價值。動物：1. 小鼠品系及特點balb/c小鼠，雄性，15只體重(20±2)g。該品系為白化小鼠，對致癌因子敏感;自發高血壓癥;一般無互相侵襲勻性，較容易群養，對 放射線極度敏感等品系特征，故已越來越廣泛地被用于腫瘤、生翟、免疫等方面的研究和單 克隆抗體制作等新技術。2. 飼養條件(包括動物房及飼料等)飼養條件：清潔級動物房，溫度2123°c,相對濕度44 65%。自由飲水，飲食。試劑：1. cox2、rpmi1640 培養基(

4、gibcobrl)；胎牛血清(fetal calf serum)(蘭州民海 生物工程有限公司);concanavalin a (con a) il-1 (美國 sigma),臺盼藍(trydanblue) (美國 sigma)； cycloheximide (chx), mtt, dmso (dimethyl sulphoxide), t 淋巴細 胞分離液(china,dakewe), dmso。藥品：xo, xanthine, allopurinol, myricetin, and isoquercitin (sigma); apigenin, quercetin, luteolin, sc

5、utellarein, and rutin (nanjing tcm institute of chinese materia medica); hyperoside (national institute.)2. 流式分析：fitc anti-mousc cd-4; pe anti-mousc cox-23. 儀器：二氧化碳細胞培養箱，滅菌鍋，制冰機，倒置顯微鏡，nikon出品；spectrum max190酶標儀(美國md公司)，細胞培養板(美國costar公司)，微量加樣器(10ml, 200ml和looopl)(德國eppendoff),無菌實驗臺；臺式離心機；電子天平，millex微

6、孔濾膜(0.22pm)(愛爾蘭carrighwohill公司)。4. 耗材：解剖剪，鉞子，15/50ml離心管，移液器，加樣槽，tip頭，吸管。5篩選產物對急性痛風炎小鼠前列腺組織屮環氧化酶-2(cox-2) mrna表達的彫響： rna提取試劑盒，引物)為：？三設計思路與實驗設計設計思路：通過使用虛擬篩選出來的天然產物，重點研究：(1)細胞水平反映的是藥物對細胞的整 體作用。(2)動物水平反映的天然產物使用時間后的免疫保護效果差異。實驗設計：1. 分子水平：方法：使用試劑盒 cox fluorescent inhibitor screening assay kit (cayman.) 本實驗

7、室己做。2. 細胞水平2.1試劑:rpmi1640培養基;fbs;雙抗；mtt溶液的配制：mtt溶于pbs(0. 01 mol r, ph7。4)配成5mg / ml貯備液, 溶解后用0. 22pm的微孔濾膜除菌。4°c避光保存。兩周有效。刺激劑：concanaval in a (con a) /il-1 ；臺盼藍儲液配制：稱取4. og臺盼藍，加少量蒸憎水研磨，之后加雙蒸水至looml, 4°c保存。使用時用pbs稀釋成0. 4%的濃度。2.2實驗流程：利用t淋巴細胞模型進行篩選評價a. 解剖正常小鼠，分離脾臟b. 從脾臟里分離pbmc 注意無菌操作c. 分別用ill,c

8、ona刺激分成兩組d. mtt檢測吸收值e. 流式儀分析cd4+/cox-2：通過血常規技術結合流式分析可得到cd4細胞的絕對計數和cox-2的表達量。2.3實驗方法：2.3.1工作液的制備：培養基:10%fbs的1640+1%雙抗+1%谷氨酰胺樣品制備：2.3.2淋巴細胞懸液的制備a. 斷頸處死小鼠，浸入75%的乙醇屮浸泡12分鐘。b. 在超凈臺中小心剪開小鼠的腹部外皮，用大頭針固定，再剪開小鼠的腹腔, 用銀子取出小鼠脾臟。注意無菌操作。c. 在35mm培養皿屮放入45ml ez-sep1 mouse ix淋巴細胞分離液（使 用前搖勻淋巴細胞分離）。用鍍子固定尼龍網，然后用注射器活塞輕輕研磨

9、小鼠脾臟，使得 分散的單細胞透過尼龍網進入淋巴細胞分離液中。（每研磨一只脾臟花費的時間最好控制 在5分鐘之內，防止在研磨過程中液體揮發，使得密度與滲透壓改變，影響分離效果）d. 把懸有脾臟細胞的分離液立即轉移到離心管屮，離心前再覆蓋上大約 200ul的1640培養基。2.3.3細胞活性的計數取一定濃度的細胞，于倒置顯微鏡下加入少量臺盼藍進行染色測定，鏡下觀察活 細胞數。2.3.4細胞測定的方法分別加入一定濃度的100ul細胞懸液和10ul的待測藥物于96孔細胞培養板屮， 混勻后放入5%co2、370 c培養箱孵育60min,再加入10ul的con a（終濃度為 10ug/ml）,繼續培養一定時

10、間。培養結束后，每孔加入不同量的mtt染色液， 反應不同時間后去上清，加入150ul的dmso,震蕩溶解并在酶標儀上檢測（最佳 測定條件進行考察）。a最大吸收波長的考察->b加入cona后反應時間的考察>c刺激指數（stimulation index, si）的測定*d mtt加入量的考察->e加入mtt后反應時間的考察a無菌制備細胞懸液，取100 ul的細胞懸液，最后所得溶液充分溶解后用酶標儀在400 750nm波長范圍內依次掃描，測定最大吸收波長。b按上法制備細胞懸液，分別考察加入10 ul的con a和il-1 （終濃度為10ug / ml）后0、24、48、72、和9

11、6h的a值。測定在多少h的時候具有最大的吸收值。time024487296conail-1the absorbance at different time after adding con a il -1c文獻報道胞密度為6x10'9/l時，具有最大的刺激指數。d mtt加入量的考察：按上述方法制備細胞懸液，然后分別加入5, 10, 15, 20, 25和30ul 的 mtt（5mg/ml,即相當于每孔加入 25, 50, 75, 100, 125 和 150ul 的 mtt）,測定mtt (ug)255075100125150a valuethe effect of differen

12、t quantity mtt on the absorbrancee加入mtt后反應時間的考察：于上述方法培養的淋巴細胞，加入con as il-1后反應b 項檢測結果的時間后加入mtt液后，在反應的1、2、4、6和8小時時，分別進行測定，檢 測在多長時i'可具有最大的吸收值time1246810con a(a value)il-1(a value)the absorbance at different time after mtt was added to cultured splenocytes2.4.實驗布局分組il-1con a對照 allopurinol luteolin,h

13、yperosideaa相關技術：分離pbmc：一脾臟實驗器材1. ez-sep mouse ix淋巴細胞分離液2. 無菌35mm培養皿3. 200目尼龍網，裁成90mm*90mm正方形，滅菌4. loml玻璃注射器內活塞，滅菌5. 不同規格躡子、剪刀若干，滅菌6. 細胞實驗常用器材，如離心管，移液管，加樣槍，離心機等 實驗方法1. 斷頸處死小鼠，浸入75%的乙醇屮浸泡12分鐘。2. 在超凈臺屮小心剪開小鼠的腹部外皮，用大頭針固定，再剪開小鼠的腹腔，用銀子取岀 小鼠脾臟。注意無菌操作。3. 參考圖一，在35mm培養皿中放入45ml ez-sep mouse ix淋巴細胞分離液（使用 前搖勻淋巴細

14、胞分離）。用銀子固定尼龍網，然后用注射器活塞輕輕研磨小鼠脾臟，使得 分散的單細胞透過尼龍網進入淋巴細胞分離液屮。（每研磨一只脾臟花費的時間最好控制 在5分鐘z內，防止在研磨過程屮液體揮發。使得密度與滲透壓改變，影響分離效果）4. 把懸有脾臟細胞的分離液立即轉移到離心管屮，離心前再覆蓋上大約200ul的1640 培養基。注意：o 1離心前在細胞懸液上面加蓋一層1640培養基，既有利于漂浮上來的淋巴細胞的聚 集，又有利于下一步的吸取操作。覆蓋層不必太厚，200ul足矣。o 2如果實驗者一次實驗要處理很多只小鼠，需要注意兩點：其一，每研磨完一只小鼠, 立即把脾細胞懸液從培養皿轉入離心管屮，注意蓋嚴管

15、蓋，切不可敞口放在超凈臺屮。否則, 液體揮發，密度與滲透壓都會改變，嚴重影響分離效果。其二，在所有的小鼠脾臟處理完后, 統一再加1640覆蓋層。如果加早了，兩層液體會相互擴散，造成最終離心后的淋巴細胞層 下移。5. 800g離心30分鐘。注意離心設置較慢的加速度和減速度（如果有十檔，一般設 置在第三檔）。離心結束后淋巴細胞會漂浮上來，在1640覆蓋層下面聚集，細胞分 層如圖二所示。6. 吸出淋巴細胞層，再加入10ml 1640培養基，250g離心10分鐘。傾倒上清液, 加入 3-5ml lympho-spot7. 無血清培養基重懸，細胞計數。二全血7. edta抗凝血分別取100ul全血兩管做

16、流式染色、血常規8. 將所有血轉移至15ml離心管，24°c 1700rpm 10分鐘9. 取血漿每個凍存管加0.30.4ml （提rna做viral load）10. 每個15ml離心管加入12ml 1*pbs,充分混勻（血:pbs= 1： 4）11. 將每個50ml離心管加入10ml分層液12. 將稀釋的血液緩慢加到分層液表面，注意不要破壞液面13. 24°c 600克力30分鐘，加速度為4,減速度為014. 將分層液上面一層白膜吸出至另一 50ml離心管中15. 加入1*pbs 15ml,充分顛倒混勻16. 24°c 1700rpm 10分鐘，倒掉上清，打散

17、細胞團，加入1640培養基（含2%胎牛血清） 定容至5ml,取50ul計數17. 加入1640培養基（含2%胎牛血清）15ml,充分顛倒混勻18. 24°c 1700rpm 10分鐘，倒掉上清，打散細胞團，補充1640培養基（含20%胎牛血清、 1%抗肝和1%il2） 15ml圖一.小鼠脾臟研磨的達科為方法尼龍網鋪在皿口，用注射器活塞向下按壓時，尼龍網向 下凹陷，同時產生一個向上的彈力。這個彈力的力度剛好可 以把脾臟夾在二者中間，同時又不對脾臟細胞造成傷害.操作中有兩點需要注意：第一，尼龍網不能接觸到皿底，否則就無法控制研磨的 力度，容易造成大批細胞死亡；第二，皿的口徑不能太大，否則

18、尼龍網不能產生有效的 彈力。經我們驗證，35mm和60mm的培養皿可以取得良好的 效杲，而90mm的皿就太大了，尼龍網容易塌陷到皿底。輟子在一邊夾住尼龍網，防止尼龍網在研磨過程中滑動。細胞碎片過多, 導致界面模糊 與混亂沒有 明顯的淋巴細 胞層普通小鼠淋巴 細胞分離液紅細胞及其它細 胞和部分死細胞 碎片細胞培養基圖二左:ez-sepim mouse ix 分離小 鼠脾臟細胞的分層示意圖。即使死亡細 胞和細胞碎片很多，也不影響淋巴細胞 的分層；圖二右:普通小鼠淋巴細胞分離裁在死 亡細胞和細胞碎片過多時，不能形成淋 巴細胞層。流式染色：（edta抗凝）:1. 每管每種抗體各5ul2. 加入全血或細胞looul/管，震蕩混勻，避光20分鐘3. 震蕩同時加入融血素500ul,放置10分鐘，直到呈透亮狀4. 震蕩同時加入1*pbs lml5. 1500