1、臨床醫學論文-聚酮合成酶底物專一性的硏究進展【摘要】 聚酮合成酶能夠合成包括許多大環內酯類抗生素在內的聚酮類天然產 物，它的結構和功能的模塊性為組合生物合成的產生和發展奠定了基礎。聚酮合 成酶的酰基轉移酶功能域可以特異性地決定所選擇酰基輔酶a的種類，決定產物 的結構。近年來，針對許多來源不同、結構各異的聚酮合成酶的底物專一性已經 從氨基酸序列、結構和功能等方面進行了大量的硏究，為更有效地應用聚酮合成 酶開發新型抗生素奠定了基礎。【關鍵詞】聚酮合成酶；底物專一性；組合生物合成；酰基轉移酶progress in substrate specificity of polyketide synthas

2、eabstract polyketide synthases catalyze the synthesis of complex natural products including macrolide antibiotics from simple precursors such as propionyl coa and methylmalonyl coa the structural and functional modularity of these multienzyme systems has raised the possibi1ity that polyketide biosyn

3、thetic pathways might be rationally reprogrammed by combinatorial manipulation. previous studies have shown that the choice of these substrates is primarily controlled by individual acyltransferase (at) domains within each pks and the intracellular acylcoa pools an essential prerequisite for harness

4、ing this biosynthetic potential is a better understanding of the molecular rccognition features of polyket ide synthases wi thin this decade, a variety of genetic, biochemical, and chemical investigations have yielded insights into thespecificity of several architecturally different polyketide synth

5、asesthe results of these studies, together wi th thei r implicat ions for biosynthetic engineering, are summarized in this review.key words polyketide synthase; substratespecificity; combinatorial biosynthesis; acyl transferase聚酮類化合物是一類由聚酮合成酶(polyketide synthase ks)催化合成的 結構復雜、用途廣泛的天然產物。聚酮合成酶通過催化前體物質

6、進行反復的縮合 反應，可以形成多種聚酮體，再經過甲基化、氧化還原、糖基化等修飾反應形成 各種各樣結構復雜的聚酮類化合物。日前，在微生物中發現的聚酮合成酶主要有 兩大類：i型聚酮合成酶是以模塊形式存在的多功能酶，每一模塊含有一套獨特 的、非重復使用的催化功能域，主要催化合成大環內酯、聚烯及聚醍類化合物， 如紅霉素糖昔6 脫氧紅霉內酯b(6 deoxyerythronol ide b j 6 deb)的生 物合成1； ii型聚酮合成酶為多酶復合體，含有一組可重復使用的單元，主 要催化芳香族聚酮類化合物的生物合成，如放線菌紫素等2。i型聚酮合成 酯和ii型聚酮合成嗨都包括一個或多個模塊，每個模塊含有

7、三個關鍵催化功能 位點：b酮酰基硫酯合成酶(b ketosynthase ? ks)可催化鏈的延伸；酰基 載體蛋白(acyl carrier protein acp)為催化過程中的中間體提供一個帶有疏 基的傳輸臂；酰基轉移酶(acyl transferase，at)可以結合酰基輔酶a的酰基部 分并將其傳遞給酰基載體蛋白。另外，i型聚酮合成酶的有些模塊中還存在以下 催化功能域：b酮酰基還原酶(b ketoreductase，kr)能夠立體特異地將酮基還原成疑基；脫水酶(dehydratase，dh)能催化疑基脫水產生烯 脂酰載體蛋白；烯還原嗨（enoyl reductase，er）能還原上一步得

8、到的烯脂 酰基載體蛋白3。自然界中也存在一些結構特殊的聚酮合成曲°sthapit等2004年從 streptomyces carzinostat icus中首次發現能催化合成芳香化合物的細菌i型 聚酮合成酶4° cheng 等從 streptomyces atrool ivaceus s 140 克隆得到 leinamycin（lnm）生物合成基因簇，包括兩個pks基因lnml和inmj »共編碼6 個聚酮合成酶模塊，每個模塊內都沒有at催化位點，而由聚酮合成酶基因簇之 外的inmg基因編碼酰基轉移嗨。inmg、lnml或inmj的失活都將終止lnm的生 物合成。

9、體外實驗結果進一步證明，inmg編碼的酰基轉移酶能夠有效、特異地 向pks的6個模塊提供內二酰輔酶a 5。1 pks起始碳單元的選擇聚酮合成酶能夠催化多種小分子竣酸進行縮合反應，經過不同程度的還原合 成大量結構復雜、生物活性多樣的天然產物。pks模塊中at功能域可以選擇特 定的酰基輔酯a，通過acp傳遞到ks的活性位點上并完成縮合反應，即at對于 反應底物的選擇具有關鍵的作用。pks的負載域根據其模塊結構（即聚酮合成的起始方式）主要可以分為兩類： 一類負載域除了 at和acp之外，還有一個具有脫竣酶活性的ksq（ks高度保守的 半胱氨酸殘基活性位點被谷氨酸即q取代）功能域。這種負載域（如竹桃霉

10、素、尼 達霉素、苦霉素生物合成pks中的負載域）以二元竣酸輔酶a（如丙二酰輔酶a、甲基丙二酰輔嗨a）為起始碳單位。起始碳單位在加載到第一個延伸模塊之前必 須經過脫竣反應，ksq在這個過程中起關鍵作用6。另一類負載域出現于如 紅霉素、苦霉素的pks中，只有at和acp。它們利用一元竣酸輔酶a（如丙酰輔 « a、異丁酰輔酶a）作為底物，將這些酰基輔甌a加載到相應pks的第一個延伸 模塊上。在這個體系中，聚酮合成的起始過程沒有經過脫竣反應。這類負載域對 于聚酮化合物的合成不是必不可少的，例如滅活6脫氧紅霍內酯b合成酶的負 載域，極大程度地降低了紅霉素的產量，但并不能完全終止紅霉素的合成7。

11、除此之外，自然界中還發現了一些特殊的pks負載域fk506的生物合成pks 的負載域包括了 cas（ di hydrocyclohexenyl carbonyl coa synthetase）、er 和 acp功能域，但沒有起始at。cas和er催化莽草酸形成fk506生物合成的起始 wi dihydrocyclohexenylcarbonyl coa，acp用丁固定起始單位并將其傳遞給 pks模塊1的3氧酰基（acp）合成酶功能域的半胱氨酸活性位點8。另外， julien等發現cpothiloncs（埃博霉素）生物合成pks負載域是由ksy（ks高度保守的半胱氨酸殘基活性位點被酪氨酸即y取代

12、）、at、er和acp組成9。 brautaset等克隆的制霉菌素（nystatin）生物合成pks的負載域nysa，包括 kss（ks高度保守的半胱氨酸殘基活性位點被絲氨酸即s取代）、at、dh和acp 10。但ksy和kss的功能尙不清楚。2 pks延伸碳單元的選擇丙二酰輔酌a和甲基丙二酰輔酌a常用于聚酮鏈的延長，如紅霉素的6個延 伸模塊都選擇甲基丙二酰輔酶a作為催化底物。利福霉素b產生菌amycolatopsis mcditerranei中的pks既能利用甲基丙二酰輔嗨a又能利用丙 二酰輔酶a，其中模塊2和模塊9特異選擇丙二酰輔酶a，其余八個模塊特異選 擇甲基丙二酰輔酶a作為底物11。r

13、eeves等在吸水鏈霉菌屮發現子囊霉素 (ascomycin)生物合成pks的at8能夠利用甲氧基丙二酰輔嗨a12° reeves 等還在子囊霉素pks中發現了合成延伸單位乙基丙二酰輔酶a的基因，乙基丙二 酰輔酶a為子囊霉素的c 21提供了乙基側鏈13。通常情況下，聚酮鏈延伸模塊at功能域具有嚴格的底物專一性，也有一些 at功能域可以同時利用不同的底物。2000年，julien從纖維堆囊菌中克隆了 epothilones的生物合成基因簇，其模塊4可以利用甲基丙二酰輔酶a和丙二酰 輔酶a合成兩種產物epothi lones a和epothi lones b9。其它pks也出現 過這種不

14、嚴謹的at底物專一性，例如immunomycin 14和monensin(莫能星)15的生物合成酶，既能夠利用甲基丙二酰輔酶a 乂能夠利用乙基丙二酰輔酶 a °3生物信息學方法分析pks的模塊結構和底物專一性16yadav等以大腸埃希菌的丙二酰輔酶a載體蛋白轉酰酶(malonylcoa:acyl carrier protein tran sacylase j mat)17、天藍色鏈霉菌 a3(2) 的mat18等酰基轉移酶的晶體結構以及大量聚酮合成酶的基因、生化、化學 實驗數據為基礎，開發了一種用于評估pks模塊結構和底物專一性的軟件，所得 到的分析結果儲存在數據庫pksdb(pol

15、yket ide synthase data base)中。該軟件在一定程度上揭示了聚酮合成酶氨基酸序列和聚酮產物之間的關系，并可以 輔助預測新發現pks的聚酮產物。該軟件提出了特異識別丙二酰輔酶a、甲基丙二酰輔酶a的酰基轉移酶的特 征：如基序qqghs qm1grsht nsv出現于特異識別甲基丙二酰輔a的at 中，而qqc5hs lvifa mgrfphantgedsnhq v是特異識別丙二酰 輔酶a的at的特征基序。由于目前發現的特異識別較稀少酰基輔酶a（如乙基丙 二酰輔酶a）的at功能域的例子極少，因此該軟件還不能夠找到特異識別稀少酰 基輔酶a的at的識別模式。不過，該軟件提出了一個區

16、分特異識別一元竣酸輔 « a、二元竣酸輔嗨a的at的特征一一117位氨基酸。特異識別二元竣酸（如丙 二酰、甲基丙二酰）的at在117位上是一個保守的arg ；當argll7變成非極性 的氨基酸時，at功能域可以特異地識別一元竣酸底物如丙酸、苯甲酸、2甲基 丁酸和3甲基丁酸。4通過功能域置換的方法改變pks酰基轉移酶at的底物專一性自發現pks這種特殊結構的蛋白以來，引起了人們極大的關注，日益完善的 基因工程技術為利用聚酮合成酌合成復雜結構的非天然的聚酮化合物提供了充 分的條件。以紅霉素合成基因為例，紅色糖多抱菌的6脫氧紅霉內酯b合成酶 （6 deoxyerythronol ide b

17、 synthase j debs）包括 6 個模塊，催化了由一個丙 酰輔酶a起始單位和六個甲基丙二酰輔酶a延仲單位聚合形成6脫氧紅霉內酯 的反應。1996年,oliynykl等通過將debs1 te（thioesterase 硫酯酶，位 于pks末端且起到將合成的聚酮長鏈從pks上解離下來的作用）的at置換成雷帕 霉素（rapamycin）聚酮合成酶基因模塊2的at，合成了兩個新的三酮內酯'這兩 個新產物在c 4上都沒有甲基基團，證明可以通過功能域置換的方法產生有活性的“雜合”聚酮合成酶19。liu等通過用特異識別丙二酰輔酶a的酰基轉 移酶置換6 debs的酰基轉移酶，產生了 6 de

18、b的類似物20。此后，通 過用特異識別丙二酰輔酶a、乙基丙二酰輔酶a和甲氧基丙二酰輔酶a的at取 代6 debs中特異識別甲基丙二酰輔酶a的at得到了許多紅霉素的類似物（20 24。多數情況下，通過功能域置換所得到的“雜合”聚酮合成酶催化非天然聚酮 合成的產率遠遠低于野生型pks。可能的原因有：細胞內處于穩態的雜合pks 濃度很低；雜合的蛋白不能有效折疊或蛋白水解敏感性較高；在催化過程中 外源的功能域無法識別其它功能域;雜合模塊的其它催化位點或下游模塊對延 仲單位的限制。為了解at功能域的置換對pks模塊結構和活性的影響，hans等 對debs的模塊6的一系列“雜合”模塊（原來的at被來自de

19、bs其它模塊的at 取代）的生化性質進行了深入硏究。實驗結果顯示更換at功能域減弱了模塊催化 鏈延伸的能力，原因在于外源at改變了 acp和ks之問的功能域的相互作用。進 一步的實驗表明，引入的這個外源的at功能域使得kr和acp功能域之間的一個 位點（距引入的at功能域c端幾百個氨基酸處）對胰蛋白酶更敏感。這個發現對 模塊的重組具有指導意義25。5定點突變的方法改變酰基轉移酶的底物專一性通過功能域置換改變聚酮合成酚的底物專一性'有時并不能得到理想的結 果。例如，debs模塊4的幾次at置換，在標準條件下都未能夠檢測到聚酮產物，顯示置換模塊4的at，對debs的蛋白結構影響很大，使de

20、bs喪失了催化聚酮 合成的能力13。christopher等通過比對不同聚酮合成酶模塊的at功能域 的序列，并對照大腸埃希菌脂肪酸合成酶的酰基轉移酶晶體結構，希望找到at4 中可以改變其底物專一性且最小程度地影響debs蛋白折疊的基序。結果發現有 三個獨立的基序與at4特異選擇甲基丙二酰輔酶a有關。通過定點突變的方法將 其變成了特異選擇丙二酰輔嗨a的基序。每個基序單獨突變以及三個位點全部突 變都能夠得到有功能的debs，這些debs除能夠合成天然聚酮化合物6脫氧紅 霉內酯b外還能產生預期的新的類似物6去甲基6脫氧紅霉內酯bu3。 后者的合成說明這些突變的基序的確改變了 at的專一性。這個實驗的

21、成功為改 變聚酮合成酶pks的酰基轉移酶的底物專一性提供了一個可行的方法。kumar等26首先用點突變的方法滅活debs模塊6的at，得到的debs與來自leinamycin合成酶的mat5共表達從而得到了 6 脫氧紅霉內酯b的類似物2去甲基6脫氧紅霉內酯b。在這個工作中“雜合”聚酮合成與野生型聚酮合成酶在體內、體外催化聚酮合成的速率基本相同。6改變酰基輔酶a成分，合成特定聚酮化合物pks能夠利用的起始/延伸單位包括乙酰輔酶a、丙醜輔酶a、異丁酰輔酶a、 異戊酰輔酶a、丙二酰輔酶a、甲基丙二酰輔酶a、乙基丙二酰輔酶a、丙基丙二 酰輔酶a、疑基丙二酰輔酶a、甲氧基丙二酰輔酶a 27。在微生物體內

22、，聚 酮途徑所需要的酰基輔酌a通常存在一個以上的合成途徑28。對于那些稀有 的酰基輔酶a（如疑基丙二酰輔酶a或3氨基5疑基苯甲酰輔酶a），其生 物合成基因往往位于利用該底物的pks基因簇內28。例如wu等在fk520生 物合成基因簇中發現了稀有聚酮合成單位乙基丙二酰輔酶a和甲氧基丙二酰輔 酶a的合成基因29。liu等在肉桂地鏈霉菌中發現了丁酰輔酶a的合成途徑 30。特定模塊的酰基轉移嗨功能域通常傾向于利用某種特異的酰基輔嗨a。但當 細胞內缺少這種酰基輔酶a時，它也能夠利用其它酰基輔酶a合成相應的聚酮化 合物的衍生物。fu等發現在缺少丙二酰起始單位時，土霉素生物合成pks能夠 利用乙酸起始聚酮鏈

23、的形成31。richardson等在硏究6甲基水楊酸合成 酶(6 methylsalicylic acid synthase » msas)的底物專一性時發現，在缺少 內二酰輔酶a的情況下，msas甚至能夠利用malonyls nac(malonyl sacetylcysteamine)作為延仲單位32°因此，可以通過基因工程手段改變細胞內輔嗨a組成，從而改變酰基轉移甌 功能域的底物專一性，也可以達到合成特定聚酮產物的目的。在大腸埃希菌中引 入甲基內二酰輔酶a變位酶 甲基內二酰輔酶a差向異構酶代謝途徑，產生了大 腸埃希菌中缺乏的(2s)甲基丙二酰輔酶a，該酰基輔酶a能夠被在

24、大腸埃希菌 中異源表達的6 debs利用，產生聚酮化合物6 脫氧紅霉內酯b(6 deb)33° kato 等將 act inosynncma prct iosum 中的安絲菌素(ansami tocin)生物 合成基因簇中與特殊鏈延伸單位甲氧基丙二酰 酰基載體蛋白合成有關的5個 基因asml317與紅色糖多鞄菌的6debs基因在變鉛青鏈霉菌中共表達(該6debs的甲基丙二酰特異的at6已經被吸水鏈霉菌的fk520合成基因簇的甲氧 基丙二酰特異的at8所代替），重組菌株產生了預期的產物2去甲基2甲 氧 脫氧紅霉內酯b（沒有asml317時，產物為6 脫氧紅霉內酯b和2去 甲基6脫氧紅霉

25、內酯b） 34。以上硏究表明，通過改造微生物酰基輔酶a的組 成，能夠成功地合成新的聚酮化合物，使通過構建基因工程菌株生產有重要藥用 價値的聚酮化合物成為可能。冃前，大腸埃希菌和天藍色鏈霉菌已經被成功地改 造成為聚酮化合物合成的工程菌33。7展望近二十年來，從天然產物中篩選新的抗生素變得越來越困難。另外，由于人 們對抗生素的過度使用，使抗生素的耐藥性問題日漸嚴重。尋找新抗生素的需求 比以往更加緊迫，但用傳統方法篩選冇價値的前體化合物工作十分繁重，效率較 低。因此，利用新技術開發新抗生素逐漸成為人們關注的熱點。聚酮化合物是一類結構多樣的天然產物，很多具有重要的藥用價値，如大環 內酯類、四環素類、蔥

26、環類、聚瞇類的許多抗生素都屬于該類化合物。目前已知 的天然存在的聚酮化合物有7000多種，其中1%具有藥物活性。更重要的是，聚 酮合成酶由于其功能和結構的模塊性使得組合生物合成成為可能。自從1985年，hopwood等35首次報道應用遺傳工程的手段合成“非天 然”的產物isochromanequinone以來'組合生物學得到了蓬勃發展'目前通過 組合生物學的力法已經合成了大量聚酮類化合物。改變生物合成途徑具有以下的 優勢：悔有足夠的精確性修飾特定的位點，而不會導致副產物的產生；可以改變 那些化學方法所不能改變的原子、基團。當然，聚酮合成酶是結構復雜的生物大分子物質，其蛋白間、蛋

27、白內的相互 作用機制十分復雜，蛋白質結構的微小改變，都可能對其催化活性產生極大影響。 只有充分了解聚酮合成曲結構、功能、反應機理，才能有效地進行改造并用來合 成新的有價値的化合物。通過對聚酮合成酶具體功能域的硏究，尤其是對at功 能域的硏究，可以充分了解at功能域中具體的氨基酸組成與聚酮產物的關系。 pksdb軟件可以用于預測“雜合”聚酮合成酶的產物，有利于設計、幵發新型聚 酮類抗生索。at功能域作為聚酮合成屮控制起始單位和延伸單位選擇的關鍵因 素，其結構與功能關系的硏究十分重要，對于應用組合生物學合成新的非天然“天 然”聚酮化合物的開發硏究也具有重要的指導作用。【參考文獻】1haydock

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