1、· 第九章 分子生物學研究方法  1課程教學內容 (1)核酸技術1基本操作 (2)核酸技術2克隆技術 (3)核酸技術3測序 (4)基因表達和表達分析基因定點誘變 (5)蛋白質與核酸的相互作用 (6)其他（熱點）技術 2課程重點、難點 基因克隆技術、雜交技術、測序技術、蛋白質與核酸的相互作用檢測技術 3課程教學要求 掌握基因克隆技術、雜交技術、測序技術、蛋白質與核酸的相互作用檢測等各種技術的原理。  本章內容           核酸的凝膠電泳   

2、0;       DNA分子的酶切割           核酸的分子雜交           基因擴增           基因的克隆和表達           細菌的轉化

3、60;         DNA核苷酸序列分析           蛋白質的分離與純化           研究DNA與蛋白質相互作用的方法 一、   核酸的凝膠電泳 基本原理：當一種分子被放置在電場當中時，它們會以一定的速度移向適當的電極。 電泳的遷移率：電泳分子在電場作用下的遷移速度，它同電場的強度和電泳分子本身所攜

4、帶的凈電荷成正比。 由于在電泳中使用了一種無反應活性的穩定的支持介質，如瓊脂糖和丙烯酰胺，從而降低了對流運動，故電泳的遷移率又同分子的摩擦系數成反比。 在生理條件下，核酸分子的糖-磷酸骨架中的磷酸基團，是呈離子化狀態的。從這個意義上講，DNA和RNA的多核苷酸鏈可叫做多聚陰離子，因此，當核酸分子放置在電場中時，它就會向正極移動。 在一定的電場強度下，DNA分子的這種遷移率，取決于核酸分子本身大小和構型。分子量較小的DNA 分子，比分子量較大的 分子，具有較緊密的構型，所以其電泳遷移率也就比同等分子量的松散型的開環DNA分子或線性DNA分子要快些。  Gel matrix (

5、膠支持物) is an inserted, jello-like porous material that supports and allows macromolecules to move through. Agarose (瓊脂糖): (1)    a much less resolving power than polyacrylamide, (2)    but can separate DNA molecules of up to tens of kb DNA can be visualized by staining t

6、he gel with fluorescent dyes, such as ethidium bromide (EB 溴化乙錠) Polyacrylamide (聚丙稀酰胺): (1)    has high resolving capability, and can resolve DNA that differ from each other as little as a single base pair/nucleotide. (2)    but can only separate DNA over a narrow size

7、 range (1 to a few hundred bp). Pulsed-field gel electrophoresis (脈沖電泳) (1)    The electric field is applied in pulses that are oriented orthogonally (直角地) to each other. (2)    Separate DNA molecules according to their molecule weight, as well as to their shape and top

8、ological properties. (3)    Can effectively separate DNA molecules over 30-50 kb and up to several Mb in length.  二、DNA分子的酶切割 Restriction endonucleases (限制性內切酶) cleave DNA molecules at particular sitesRestriction endonucleases (RE) are the nucleases that cleave DNA at particular

9、sites by the recognition of specific sequences. RE used in molecular biology typically recognize (識別) short (4-8bp) target sequences that are usually palindromic (回文結構), and cut (切割) at a defined sequence within those sequences. e.g. EcoRI The random occurrence of the hexameric (六核苷酸的) sequence: 1/4

10、096 (4-6=1/46) (1) Restriction enzymes differ in the recognition specificity: target sites are different.(2) Restriction enzymes differ in the length they recognized, and thus the frequencies differ.(3) Restriction enzymes differ in the nature of the DNA ends they generate: blunt/flush ends (平末端), s

11、ticky/staggered ends (粘性末端).(4) Restriction enzymes differ in the cleavage activity.  三、核酸的分子雜交 原理：帶有互補的特定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA，當它們混合在一起時，其相應的同源區段將會退火形成雙鏈的結構。如果彼此退火的核酸來自不同的生物有機體，那么如此形成的雙鏈分子就叫做雜種核酸分子。 在大多數的核酸雜交反應中，經過凝膠電泳分離的DNA或RNA分子，都是在雜交之前，通過毛細血管作用或電導作用被轉移到濾膜上，而且是按其在凝膠中的位置原封不動地吸印上去。 常用的濾膜有尼龍膜、硝酸纖維素濾膜

12、，疊氮苯氧甲基纖維素濾紙和二乙氨基乙基纖維素濾膜 核酸雜交通常包括兩個步驟：第一，將核酸樣品轉移到固體支持物濾膜上，這個過程稱為核酸印跡轉移 第二，將具有核酸印跡的濾膜同帶有放射性標記或其它標記的DNA或RNA探針進行雜交。 Southern Blotting：根據毛細管作用的原理，使在電泳凝膠中分離的 DNA片段轉移并結合在適當的濾膜上，然后通過同標記的單鏈DNA 或RNA探針的雜交作用檢測這些被轉移的DNA片段，這種實驗方法叫做DNA 印跡雜交技術。是由E.Southern于1975年首先設計出來的，故又叫做Southern DNA印跡技術。 Northern Blotting1979年，

13、J.C.Alwine 等人發展出的一種用于RNA雜交的新方法。將電泳凝膠中的RNA轉移到疊氮化的或其它化學修飾的活性濾紙上，通過共價交聯作用而使它們永久地結合在一起。稱為Northern Blotting 將蛋白質從電泳凝膠中轉移并結合到硝酸纖維素濾膜上，然后同放射同位素標記的特定蛋白的抗體反應，這種技術叫做Western Blotting. 定義：將RNA分子從電泳凝膠轉移到硝酸纖維素濾膜或其他化學修飾的活性濾紙上，進行核酸雜交的一種實驗方法。  斑點印跡雜交（dot Blotting）：基本原理和操作步驟是通過抽真空的方式將加在多孔過濾進樣器上的核酸樣品，直接轉移到適當的雜交濾膜

14、上，然后同Southern 印跡一樣的方式同核酸探針分子雜交。 菌落（噬菌斑）雜交：1975 年，Mgrunstein和D Hogness根據檢測重組體DNA分子的核酸雜交技術原理，對Southern 吸引技術做了一些修改，發展出了一種雜交技術。 在1977年，W.D.Benton和R.W.Davis又發展出了與此類似的篩選含有克隆DNA噬菌體的雜交技術。 菌落雜交或噬菌斑雜交有時也叫做原位雜交，因為生長在培養基平板上的菌落或噬菌斑，按其原來的位置不變地轉移到濾膜上，并在原位發生溶菌、DNA變性和雜交。  四、   基因擴增 基因擴增的五個方面的內容：第一，在體外

15、應用聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction） 技術和合成的寡核苷酸引物，導致特定基因的拷貝數發生快速大量的擴增。 第二，通過體外 DNA重組，將目的基因插入到高拷貝數的質粒載體分子上，并轉化到適當的寄主細胞，于是在體內隨著載體分子的大量復制，目的基因的拷貝數也得到了有效的擴增。 第三，在有些外界環境因子的脅迫下，真核生物的有關細胞被誘發產生適應性反應，從而導致相應的保衛基因的產生和明顯的擴增。 第四，程序基因擴增 第五，在生物的進化過程中發生的基因加倍與擴增，結果使相關基因在基因組上聚集成簇。 聚合酶鏈式反應：是美國Cetus公司人類遺傳研究室的科學家K

16、B Mullis于1983年發明的一種在體外快速擴增特定基因 或DNA序列的方法。 PCR技術 的 基本原理：首先使雙鏈的DNA分子變性為單鏈DNA分子 然后DNA聚合酶以單鏈DNA為模板并利用反應混合物中的四種脫氧核苷三磷酸合成新生 DNA 互補鏈。 DNA聚合酶需要有一小段雙鏈DNA來啟動新鏈的合成。因此新合成的DNA鏈的起點，是由加入在反應混合物中的一對寡核苷酸引物在模板DNA鏈兩端的退火決定的。 在為每一條鏈均提供一段寡核苷酸引物的情況下，兩條單鏈都可以作為合成新生互補鏈的模板。 在每一條新合成的DNA鏈上都具有新的引物結合位點，然后反應混合物經再次加熱使

17、新舊鏈分開，并加入下輪的反應循環，即引物雜交、 DNA合成和鏈的分離。 PCR反應的最后結果是，經過幾次循環之后，反應混合物中所含有的雙鏈DNA分子數，即兩條引物結合位點之間的DNA區段的拷貝數，理論上的拷貝數2n . PCR技術的兩個特點：第一，能夠知道特定DNA序列的合成；第二，特定的DNA區段得到了迅速大量的擴增。例如，經過30次循環，便可使靶DNA得到109 倍的擴增。 PCR反應及多次重復進行的溫度周期，而每一個溫度循環周期均是由高溫變性、低溫退火及適溫延伸等三個步驟：首先是將含有待擴增DNA樣品的反應混合物放置在高溫環境加熱1分鐘，使雙鏈 DNA發生變性，分離出單鏈的模板DNA；然

18、后降低反應溫度使專門設計的一對寡核苷酸引物與兩條單鏈模板DNA發生退火作用，結合在靶DNA區段兩端的互補序列位置上；最后，將反應混合物的溫度上升到72度左右保溫1.5分鐘,這時 在DNA 聚合酶的作用下，鏈得到延伸。 寡核苷酸引物： 引物長度：通常在15-30mers 簡并引物：是一類由寡核苷酸組成的混合物，彼此僅有一個或幾個核苷酸的差異。 嵌套引物 Taq DNA聚合酶：Klenow片段熱敏感，易失活；反應溫度低，出現錯配堿基；1986年，從75度的熱泉中的細菌中分離純化出Taq酶。與大腸桿菌DNA聚合酶相比， Taq酶使PCR的特異性和敏感性高 PCR 技術的應用：基因組克隆、反

19、向PCR和染色體步移、 不對稱 PCR 與DNA序列測定、RT-PCR 與RNA分析、基因的體外誘變、基因組的比較研究  五、基因的克隆和表達 Processes (過程) of DNA cloning： 1）    Form the recombinant DNA molecules (重組DNA) by inserting your interested DNA fragments into a proper vector (載體). (Require restriction enzymes and ligase) 2）  Tra

20、nsform (轉化) the recombinant DNA molecules into competent cells (感受態細胞). 3）  Propagation of the cells containing the recombinant DNA to form a clone (克隆), a set of identical cells containing the same recombinant DNA. 4）    Select the desired clones using the selective marker. 5）&#

21、160;   Host organisms/cells（宿主） : where the plasmids get multiplied and propagated faithfully, which is crucial for DNA cloning. -Prokaryotic host(原核宿主): E. coli ( most cases) -Eukaryotic host（真核宿主）: Yeast Saccharomyces cerevisiae (large fragments of human genome) General features of a Vec

22、tor（作為載體的一般特征）：1）They contain an origin of replication and can autonomously replicating DNA independent of hosts genome. 2）Easily to be isolated from the host cell. Most are circular, some are linear (e.g. YAC vector). 3）Contains at least one selective marker, which allows host cells containing the

23、vector to be selected amongst those which do not. 4）Contains a multiple cloning site (MCS) to be cut by restriction enzymes for DNA manipulation. Cloning vectors (克隆載體): allowing the exogenous DNA to be inserted, stored, and manipulated at DNA level. E. coli cloning vector (circular): plasmids (質粒)、

24、bacteriophages (l and M13) (噬菌體)、plasmid-bacteriophage l hybrids (cosmids) (考斯質粒質粒和噬菌體雜和體)。 Yeast cloning vector: yeast artificial chromosomes (YACs，酵母人工染色體) (Linear)。 Plasmids: small, extrachromosomal circular molecules, from 2 to 200 kb in size, which exist in multiple copies within the host cells

25、. Contain an origin of replication（復制起點）, at least one selective marker（選擇標記） and multiple cloning site（多克隆位點）. Example of selective marker: ampr gene encoding the enzyme b-lactamse which degrades penicillin antibiotics such as ampicillin.（抗氨芐） The commonly used plasmid are small in size ( 3 kb) Lib

26、raries of DNA molecules can be created by cloning (Genomic library and cDNA library)： A DNA library (DNA文庫) is a population of identical vectors that each contains a different DNA insert. Genomic Library (基因組文庫) : the DNA inserts in a DNA library is derived from restriction digestion or physical she

27、aring of the genomic DNA. cDNA library (cDNA文庫) : the DNA inserts in a DNA library is converted from the mRNAs of a tissue, a cell type or an organism. cDNA stands for the DNA copied from mRNA. cDNA library generation：The mRNAs are firstly reverse transcript into cDNA, and these cDNA, both full leng

28、th and partial, are cloned to make the cDNA library. Colony screening ： 1）Antibiotic screening (抗生素選擇)： only the recombinant plasmids grow on the antibiotic-containing plate. 2）Blue-white screening (藍白斑選擇): DNA insertion in the vector shuts down the LacZ gene expression, and turns the colony（菌落） to

29、white. 3）Colony hybridization screening (菌落雜交篩選) from a library. Analysis of a clone ：1）Restriction mapping: digestion of the plasmid prepared from a clone with restriction enzymes to investigate if the interested DNA is inserted the recombinant plasmid. 2）Sequencing the cloned DNA to see if the ins

30、erted DNA maintains the correct sequence.  六、細菌的轉化 轉化：指一種細菌菌株由于捕獲了來自另一種細菌菌株的DNA，而導致性狀特征發生遺傳性改變的生命過程。 感受態：處于感受態的細胞，某種蛋白能夠同核酸作用的復合形式。 大腸桿菌的轉化：1）用CaCl2處理大腸桿菌細胞，制備感受態細胞；2）將正在生長的大腸桿菌在0度下加入到低滲的氯化鈣溶液中，便會造成細胞膨脹（形成原生質球）；3）同加入在轉化混合物中的質粒DNA形成一種粘著在細胞表面上的對Dnase抗性的復合物。4）轉移到42 度下作短暫的熱應激，這種復合物便會被細菌吸收；5）在富裕培養基中

31、生長一段時間，再涂布在選擇性的培養基中分離轉化子。 細菌轉化效率 影響細菌轉化效率的因素：DNA濃度、純度和構型，轉化細胞的生理狀態及其在 CaCl2處理和貯藏之后的成活率，以及轉化的環境條件（溫度、PH值、離子濃度）。 環型的質粒DNA分子進入細胞，能夠抗御細胞中固有的核酸酶的作用，而線性的DNA分子，則對自由末端的降解作用是極其敏感的，環型DNA比線性的高出10-100倍。 對于同樣的轉化DNA而言，大分子量的轉化效率要比小分子量的低一些。以每微克質粒DNA 出現的轉化子菌落數表示的轉化頻率。 應用與大腸桿菌轉化程序相類似的方法，也可以成功地轉化各種真核細胞，將酵母用酶處理消化細胞壁之后，

32、就會變成原生質體 在具有PEG和CaCl2的轉化反應體系中，讓酵母原生質體同轉化DNA接觸，那么由于原生質體在生理上得到恢復并再生出細胞壁后，將其涂布在選擇性培養基上便可以鑒定出轉座子。  七、                 DNA核苷酸序列分析 1、Sanger 雙脫氧鏈終止法： 利用DNA聚合酶和雙脫氧鏈終止物測定DNA核苷酸順序的方法，是由英國科學家 Sanger 等1977年發明的。 其基本原理是利用了DNA聚合酶所具有的兩種酶催化反應的特性：第一，DNA聚合酶能夠利用單鏈的DNA作模板，合成出其互補鏈；第二，DNA聚合酶能夠利用2 ,3- 雙脫氧核苷三磷酸作底物，使之參入到寡核苷酸鏈的3末端，從而終止 鏈的生長。 2）Maxam-Gilbert化學修飾法： 原理：用化學試劑處理具末端放射性標記的DNA片段，造成堿基的特異性切割，由此產生不同長度的 鏈的反應混合物，經凝膠電泳