1、第七講 植物種質資源的保存 種質資源保存的方式廣西河池地區的九萬山自然保護區桂林花坪國家自然保護區 占地面積6.7畝，采用種莖盆栽保存，有圍墻、噴灌和遮光設施。現有圃管理和研究人員5人，已保存國內外野生稻及其近緣種27個種共4383份資源。國家種質廣州野生稻圃中國輕工總會甘蔗糖業研究所海南三亞市崖城鎮的海南甘蔗育種場的種質資源圃，保存有甘蔗種質資源2003份 水稻品種資源的保存離體保存的意義離體保存： 短期保存按保存時間長短 中期保存 長期保存 一般保存按保存方式不同 緩慢生長法保存 超低溫保存一般保存：在常規培養條件下對培養物通過不斷繼代的方法進行保存的方式，屬于短期培養。 如華中農大采用該

2、種方法保存柑橘胚性愈傷組織達16年之久。 優點：有利于種質的交換運輸和去病毒，可以隨時進行擴繁，便于利用。缺點：保存過程比較繁雜，需要不斷繼代培養，如果不慎，易導致材料的污染和混淆，且由于連續繼代，常會導致遺傳變異的發生。緩慢生長保存法：通過調節培養條件，抑制保存材料的生長，實現延長繼代時間，減少操作和勞力的保存方法。具體的技術措施:（l）降低培養環境中的氧氣濃度：如在保存材料上覆蓋一層礦物油(CaPlin 1959；Bill etal, 1989)或直接減少環境中的氧氣濃度(Engelmann etal，1990)。如印度蘿芙木的保存中，10和5保存的材料在3個月內相繼死去，用聚丙醇帽代替棉

3、塞封試管口，在15下培養物保存9個月,成活率達100%;（2）高滲保存法： 在培養基中加入高滲物質提高培養基滲透壓，抑制培養物生長的保存方法。 高滲物質：甘露醇、山梨醇、蔗糖、 PEG（分子量6000-8000） 高滲保存配合低溫條件效果更好，如6-10 低溫下，培養基+4%甘露醇，可使馬鈴薯保存1-2年，存活率最高達90%。龍眼的愈傷組織： MS+1.0mg/L2,4-D+2%甘露醇，使繼代時間由20天延長至35-40天，配合16的低溫，可使繼代時間延長至60天。(3)營養控制（饑餓法）： 降低培養基中的養分，延緩材料的生長速度，達到保存的目的。 如菠蘿試管苗在無菌水和1/4MS中保存一年，

4、存活率81%，且比保存在完全的MS培養基中的試管苗活力強,這一技術己在美國Hilo國家無性系資源圃菠蘿種質保存中應用。 甘蔗頂芽在不添加生長調節劑的1/2MS培養基中在18保存14個月。 香蕉莖尖在只含核糖的棉花基質中,17下可保存2年。(4)培養基中加入一定量的生長抑制劑： ABA、CCC、PP333、B9、青鮮素等如在獼猴桃離體保存時,培養基中加入0.1PPmABA 和50PPmB9 能夠有效地抑制試管苗的生長，在室溫下能保存9個月(郭延平等,1992)。 馬鈴薯試管苗：4C，MS+CCC600mg/L，繼代時間由100天左右延長到240天以上。 如木薯種質資源離體保存：將試管苗繼代培養在

5、生長抑制培養基中 ：MS+0.2mg/L NAA+80mg/L Kana +30g/L蔗糖+9g/L瓊脂,pH=5.8。 試管苗能正常生長保存2224個月以上,是對照(不加Kana)保存時間的1012倍,且試管苗的根系較發達、節間顯著縮短、莖節數顯著增加、莖桿明顯增粗、葉色濃綠, 溫室移栽成活率高達90%以上,是對照的58倍?；蚣尤肟股?幾種方法結合取得更好效果： 9低溫下，培養基中加入甘露醇,芋每3a繼代一次，保存時間超過8年，仍有90%以上的培養物保持活力,但其再生率顯著低于2年繼代一次的材料(Bessembinder etal, 1993)。 Seibi等用1/4MS培養基加入多效唑的

6、方法對近200個梨品種進行了離體保存(Seibi andTakao，1997)。(5)降低培養溫度： 采用控制溫度來降低或完全抑制保存材料生長的研究更為普遍。 其原理：組織的代謝活動隨著溫度的降低而減弱甚至完全停止,對保存冷敏性的熱帶植物,低溫保存往往不易進行。 常用的溫度范圍有四種： 常溫(1030) 常低溫(0-10) 低溫(0-80) 超低溫(-80以下)超低溫保存法： 在-80以下的超低溫中保存種質資源的技術方法。超低溫常用的冷源有干冰（-79)、超低溫冰箱（-80）、液氮（-196)及液氮蒸汽相（-140) 優點：超低溫保存可以克服常溫及低溫保存過程中,由于不斷繼代而產生的遺傳變異,

7、并且還可以減少工作量,減少污染等。 不同的植物材料如愈傷組織、胚軸、莖尖、花粉、根尖、休眠芽、原生質體等。 至今已有70多種植物采用芽及莖尖分生組織成功地進行超低溫保存,超低溫保存的理論基礎（一）細胞冰凍結冰與傷害理論：冰凍產生的傷害： 1、 胞內結冰使細胞結構破壞-機械傷害。 2、 使原生質體過度脫水，細胞內無機鹽濃度升高，破壞蛋白質和酶的結構，膜的完整性受到傷害，即產生溶液效應。在冷凍期間，細胞 間隙的水分 比細胞原生質體 中的水分先結冰 ，甚至低到 一15的冷凍溫度下 ，原生質體仍能維持其過冷狀態 。細胞 內過冷 的水分比細胞外的冰晶體具有較高的蒸汽壓和 自由能，因而胞內的水分通過細胞壁

8、流向胞外 ，致使胞外冰晶體不斷增長，胞 內部的溶液濃度不斷提高 ，這種狀況直至胞內水分凍結為止 。果蔬組織 的冰點以及結冰速度都受到其 內部可溶性 固形物 ，如鹽類 、糖類和酸類等濃度的控制。 在緩凍的情況下 ，冰晶體主要是在細胞間隙中形成 ，胞內水分不斷外流 ，原生質體中無機鹽濃度不斷上升 ， 達到足以沉淀蛋白質 ，使其變性或發生不可逆 的凝 固 ，造成細胞死亡 ，組織解體 ，質地軟化 。在速凍 的情況下則不同。如速凍的番茄 ，其薄壁細胞組織在顯微鏡下觀察，揭示出在細胞 內和胞壁 中存在的 冰晶體都是非常細小的，細胞 間隙沒有擴3v，原生質緊貼著細胞壁，阻止水分外移，這種微小的冰 晶體對組織

9、結構的影響很小 。在較快的解凍 中觀察到對原生質 的損害也極其微小 ，質體保存較完整 ，液泡膜有時未受損害 。保持細胞膜的結構完整，對維持細胞 內靜壓是非常等，都可防止褐變。 一 般認為，冷凍造成 的果蔬組織破壞，引起 的軟化、流汁等，不是 由于低溫的直接影響，而是 由 于晶體的膨大而造成的機械損傷。同時，細胞間隙的結冰引起細胞脫水，鹽液濃度增高，破壞原生質的膠體性質 ，造成細胞死亡，失去新鮮特性的控制能力。 在超低溫保存過程中，如能避免細胞內水分結冰并防止解凍過程中細胞內水分再次結冰，即可達到保存植物材料的目的。 方法和技術：進行預處理和加冷凍保護劑 （二）溶液的玻璃化理論溶液結冰過程：經晶

10、核形成和晶核生長過程而固化。 溶液在降溫時,如果沒有均一晶核或晶核生長缺乏足夠的時間,就首先形成過冷的溶液,它是低于冰點而不結冰的液態。如果降溫速度不夠快，就形成尖銳的冰晶;降溫速度足夠快,均一晶核很少或幾乎沒有形成，或均一晶核生長缺乏足夠的時間，溶液就進入不定形的玻璃化狀態，玻璃化狀態下細胞內分子沒有發生重排, 不會產生溶液效應對細胞的損傷,也不會造成胞內結冰產生機械傷害。影響超低溫冷凍保存的因素： 預處理方法和技術 冷凍降溫速度 保存時間 材料的性質和特點 冷凍保護劑的種類及其濃度 作為冷凍保護劑應具備下列特性： 分子量較小 易與溶劑混合 能快速滲入細胞 無毒或毒性較小 易洗脫按保護劑功能

11、和性質分類： 凍干保護劑：在凍結和干燥過程中，可以防止活性組分發生變性的物質，如甘油、二甲亞砜（DMSO）、海藻糖、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）等； 填充劑：能防止有效組分隨水蒸氣一起升華逸散，并使有效組分成形的物質，如甘露醇、乳糖、明膠等； 抗氧化劑：防止植物組織和細胞在冷凍干燥過程以及貯藏過程中發生氧化變質的物質，如維生素D、維生素E、維生素C、蛋白質水解物、硫代硫酸鈉等； 酸堿調整劑：在冷凍干燥過程和貯藏過程中，能將生物制品的pH值調整到活性物質的最穩定區域的物質，如磷酸、山梨醇、EDTA（乙二胺四醋酸二納）、氨基酸等。冷凍保護劑的作用： （1）降低冰點，促進過冷卻和“玻璃化”狀態的形

12、成。 （2）增加細胞膜透性，加速水分外滲。 （3）提高溶液的粘滯性，阻止冰晶形成。 （4）穩定細胞內大分子的結構，防止低溫對膜的傷害。常用的小分子冷凍保護劑： 蔗糖、海藻糖、脯氨酸、甘油； DMSO 甘露醇、山梨醇（通常作填充劑）等。此外，一些大分子聚合物如聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、牛血清（BSA）、右旋糖苷（dextran）、聚乙二醇（PEG）等也具有保護作用。聚合物類保護劑的作用和特點： 在凍結過程中優先析出； 具有一定的表面活性； 在蛋白質分子之間產生位阻作用； 提高溶液黏度； 顯著提高玻璃化轉變溫度； 抑制小分子（如蔗糖）的結晶； 抑制溶液pH的降低。保護劑保護劑濃度對保護效果的影響濃

13、度對保護效果的影響 凍干PFK活性恢復率（%）海藻糖濃度（mM）海藻糖濃度對磷酸果糖激酶（PFK）的凍干保護效果的影響 超低溫保存常用的方法： 玻璃化法 包埋/脫水法玻璃化法的特點： 在冰凍前,使用高濃度的冰凍保護劑，在25或O處理一段時間,誘導組織脫水，然后直接浸入液氮中,使冰凍保護劑溶液和保存材料一同進入玻璃化狀態。包埋/脫水法： 參照人工種子的技術,結合低溫保存的需要,將包埋和脫水結合起來,應用于超低溫保存中。 具體方法：用藻酸鹽包埋莖尖，在含高濃度蔗糖的培養基中預培養后，在通風櫥中處理26h或用硅膠處理，通過空氣蒸發脫水,然后進行超低溫保存。包埋/脫水法優點： 操作簡便，脫水過程比較緩

14、慢，一次能處理較多材料,避免使用一些對細胞有毒性的冰凍保護劑。缺點：某些植物成苗率低，與玻璃化法相比，組織恢復生長較慢，脫水所需的時間長。超低溫保存后細胞和組織活力檢測 根本方法：再培養 染色法：FDA、酚藏花紅、TTC 如王永林的試驗：將馬鈴薯試管苗10mm長的莖尖，用MS+5%DMSO的培養基中預培養3-4天，切取2-3mm長的莖尖置于冷凍管中，用冷凍保護劑（30%(W/V)甘油+15%(W/V)乙二醇+15%(W/V)二甲亞砜+0.4 mol/L蔗糖）室溫下處理20-30min，置于液氮中冷凍10、20、30、40、50、60 min保存。在37的水浴中快速解凍2 min，用MS+1.2

15、 mol/L蔗糖液體培養基洗滌2次,每次10 min后進行恢復培養，莖尖成活率為38. 7%-42. 5%。在60min內冷凍時間對成活率沒有明顯影響。荔枝胚性愈傷的冷凍保存：摘自郭玉瓊的博士論文預處理： 1、預培養：荔枝胚性愈傷繼代生長15d后,轉接于Ms+50mL/LDMSO+lmg/L2,4-D+20g/L蔗糖+6g/L瓊脂糖的預培養基上,在5下低溫預培養1-5d。2、冷凍保護劑預處理：將經預培養后的胚性愈傷移入1.8mL專用凍存管中,每管含有0.39g胚性愈傷，于常溫下用60%玻璃化溶液(2PVS2)處理20min;再于0下用玻璃化溶液(PVS2)溶液平衡40min;移去PVS2溶液,加入新鮮的PVS2保護劑;3、冷凍保存：迅速將冷凍管投入液氮中保存1周。4、進行解凍和恢復培養，愈傷成活率為 28.46%-36.31%。冷凍保護劑：PVS2：Ms+0.4moL/L蔗糖+30%甘油 +l5%乙二醇+l5%DMSO2PVS2：0.15mol/L蔗糖液體培養基+PVS2 溶液體積比為40：60解凍方法： 40水浴、室溫(25左右)化凍、