1、抗腫瘤藥物篩選抗腫瘤藥物篩選 侯桂琴侯桂琴 鄭州大學(xué)藥學(xué)院鄭州大學(xué)藥學(xué)院內(nèi)容提要內(nèi)容提要一一 細胞篩選細胞篩選二二 微生物學(xué)篩選方法微生物學(xué)篩選方法三三 精原細胞法精原細胞法四四 利用分子靶點篩選利用分子靶點篩選五五 動物模型動物模型六六 基因芯片技術(shù)基因芯片技術(shù)一一 細胞篩選細胞篩選篩選方法篩選方法1.1.四氮唑藍（四氮唑藍（mttmtt）還原法）還原法原理原理：活細胞中脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶于活細胞中脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶于水的藍紫色產(chǎn)物（水的藍紫色產(chǎn)物（formazan)formazan)，并沉淀在細胞中，并沉淀在細胞中，而死細胞沒有這種功能。二甲亞砜（而死細胞沒有這種功能。二甲

2、亞砜（dmsodmso）能）能溶解沉積在細胞中藍紫色結(jié)晶物，溶液顏色深溶解沉積在細胞中藍紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與所含的淺與所含的formazanformazan量成正比。再用酶標儀測量成正比。再用酶標儀測定定odod值值 實驗組光吸收值（實驗組光吸收值（a a）細胞存活率細胞存活率= = 100% 對照組光吸收值（對照組光吸收值（a a）可用細胞存活率對劑量作圖求出可用細胞存活率對劑量作圖求出ic50ic50值值應(yīng)用：應(yīng)用：生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細胞毒性試驗以及腫瘤放射敏腫瘤藥物篩選、細胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。感性測定等

3、。特點：特點：靈敏度高、經(jīng)濟。靈敏度高、經(jīng)濟。 缺點缺點：產(chǎn)物不溶于水，需被溶解后才能檢測。：產(chǎn)物不溶于水，需被溶解后才能檢測。步驟：步驟：（1 1）制備）制備單細胞懸液單細胞懸液； (2)(2)對細胞計數(shù)后接種于對細胞計數(shù)后接種于9696孔板，一般孔板，一般50005000個個/ /孔（可孔（可先做先做細胞倍增試驗細胞倍增試驗確定每孔中最佳細胞數(shù)）；確定每孔中最佳細胞數(shù)）；（3 3）將培養(yǎng)板放入）將培養(yǎng)板放入co2co2培養(yǎng)箱，過夜培養(yǎng)；培養(yǎng)箱，過夜培養(yǎng)；（4 4）24h24h后更換培養(yǎng)基，并在每孔細胞中加入不同濃后更換培養(yǎng)基，并在每孔細胞中加入不同濃度藥物，繼續(xù)培養(yǎng)；度藥物，繼續(xù)培養(yǎng)；（5

4、 5）2424或或48h48h以后，加入以后，加入mttmtt溶液，再培養(yǎng)溶液，再培養(yǎng)3-6h,3-6h,停止停止培養(yǎng)，棄取培養(yǎng)基培養(yǎng)，棄取培養(yǎng)基, ,加入加入dmsodmso，每孔，每孔150ul150ul，輕微震，輕微震蕩混勻；蕩混勻；（6 6）把）把9696孔板放入酶標儀中，孔板放入酶標儀中，490nm490nm測定吸光度。測定吸光度。 注意：設(shè)好對照注意：設(shè)好對照cck-8cck-8法法2.2.集落形成法：集落形成法：注意：適合貼壁細胞，細胞要分散均勻，操作注意：適合貼壁細胞，細胞要分散均勻，操作要柔和。要柔和。3.3.臺盼藍排斥試驗臺盼藍排斥試驗特點：懸浮細胞較方便，貼壁細胞要特點：

5、懸浮細胞較方便，貼壁細胞要進行消化，此步誤差大。進行消化，此步誤差大。二二 微生物學(xué)篩選方法微生物學(xué)篩選方法 ( (抗腫瘤抗生素抗腫瘤抗生素) )1.1.噬菌體法噬菌體法2.2.細菌變種法細菌變種法3.3.抗代謝法抗代謝法1.1.噬菌體法噬菌體法噬菌體：是一類能感染微生物的病毒噬菌體：是一類能感染微生物的病毒（1 1）抗噬菌體法：）抗噬菌體法：干擾干擾dnadna代謝的抗生素如放線菌代謝的抗生素如放線菌素、博來霉素常能抑制噬菌體在細菌細胞內(nèi)的生長，素、博來霉素常能抑制噬菌體在細菌細胞內(nèi)的生長，從而不產(chǎn)生噬菌體顆粒而出現(xiàn)抗噬菌體的現(xiàn)象。從而不產(chǎn)生噬菌體顆粒而出現(xiàn)抗噬菌體的現(xiàn)象。（2 2）溶原性菌

6、誘導(dǎo)法：）溶原性菌誘導(dǎo)法：除烈性噬菌體外，還有一種除烈性噬菌體外，還有一種噬菌體，其基因組直接螯合到細菌染色體噬菌體，其基因組直接螯合到細菌染色體dnadna，不復(fù)，不復(fù)制，因其大部分基因功能受到了制，因其大部分基因功能受到了“阻遏物阻遏物”阻抑，阻抑，這種帶前噬菌體的菌株稱溫和性或溶原性菌。但是這種帶前噬菌體的菌株稱溫和性或溶原性菌。但是當當“阻遏物阻遏物”的量由于細胞內(nèi)或環(huán)境因子（物理、的量由于細胞內(nèi)或環(huán)境因子（物理、化學(xué)）而降低時，溶原性就不能維持，前噬菌體開化學(xué)）而降低時，溶原性就不能維持，前噬菌體開始生長，是細菌裂解，稱為誘導(dǎo)作用。一些抗腫瘤始生長，是細菌裂解，稱為誘導(dǎo)作用。一些抗腫

7、瘤抗生素有誘導(dǎo)能力?？股赜姓T導(dǎo)能力。2.2.細菌變種法細菌變種法(1)(1)人工培育變種人工培育變種 如如: :使細菌模仿腫瘤細胞的某些代謝特點使細菌模仿腫瘤細胞的某些代謝特點 使使細菌細菌對核酸或蛋白合成抑制劑敏感對核酸或蛋白合成抑制劑敏感(2)(2)檢測突變作用檢測突變作用 如如: :依賴鏈霉素的菌株依賴鏈霉素的菌株3.3.抗代謝法抗代謝法 抗代謝物在無機氮源的合成培養(yǎng)基中顯抗代謝物在無機氮源的合成培養(yǎng)基中顯示抗菌作用，而在普通有機氮源的營養(yǎng)培養(yǎng)示抗菌作用，而在普通有機氮源的營養(yǎng)培養(yǎng)基中無抗菌作用（因為有機氮源可將具有抗基中無抗菌作用（因為有機氮源可將具有抗菌作用的物質(zhì)代謝），利用此特點

8、，選擇無菌作用的物質(zhì)代謝），利用此特點，選擇無機氮源試驗有抗菌作用的物質(zhì)，作為抗代謝機氮源試驗有抗菌作用的物質(zhì)，作為抗代謝的初篩方法。的初篩方法。三三 精原細胞法精原細胞法( (抗生素和植物藥抗生素和植物藥) )1.1.建立依據(jù)建立依據(jù) b b型精原細胞具有高度敏感性型精原細胞具有高度敏感性2.2.實驗方法及判定實驗方法及判定 222228g28g雄性小鼠，藥物直接注入睪丸，雄性小鼠，藥物直接注入睪丸，不同濃度，每一濃度用不同濃度，每一濃度用2 23 3只，注射只，注射3 3天，處天，處死動物，睪丸固定，石蠟包埋切片，蘇木精死動物，睪丸固定，石蠟包埋切片，蘇木精伊紅染色，顯微鏡觀察。伊紅染色，

9、顯微鏡觀察。四四 利用分子靶點篩選利用分子靶點篩選1.1.抑制血管生成的篩選模型抑制血管生成的篩選模型體外：血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)體外：血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)體內(nèi)：動物眼角膜囊體內(nèi)：動物眼角膜囊 地鼠頰囊地鼠頰囊 裸鼠外耳皮下裸鼠外耳皮下 雞胚絨毛尿囊膜雞胚絨毛尿囊膜雞胚絨毛尿囊膜模型雞胚絨毛尿囊膜模型 雞胚的生物學(xué)構(gòu)造雞胚的生物學(xué)構(gòu)造尿囊尿囊卵黃囊卵黃囊對照組低濃度藥物實驗組中濃度藥物實驗組高濃度藥物實驗組操作步驟：操作步驟：（1 1）于實驗前）于實驗前72h72h孵育受精蛋孵育受精蛋（2 2）實驗進行前以照蛋箱透照孵育的種蛋，凡已正常發(fā)育的）實驗進行前以照蛋箱透照孵育的種蛋，凡已正常發(fā)育的種蛋可照見胚

10、胎的影子，用鉛筆做記號，棄取未發(fā)育種蛋種蛋可照見胚胎的影子，用鉛筆做記號，棄取未發(fā)育種蛋（3 3）用碘酒、酒精消毒蛋殼。敲碎蛋殼把雞胚移入平皿中，）用碘酒、酒精消毒蛋殼。敲碎蛋殼把雞胚移入平皿中，加入加入eaglefseaglefs培養(yǎng)液培養(yǎng)液5-10ml5-10ml，然后，可選擇在雞胚尿囊膜血管，然后，可選擇在雞胚尿囊膜血管網(wǎng)的任何位置放置小塊明膠海綿作為篩選抗血管生成藥物的網(wǎng)的任何位置放置小塊明膠海綿作為篩選抗血管生成藥物的載體，然后加入不同濃度的血管生成抑制劑。載體，然后加入不同濃度的血管生成抑制劑。（4 4）于加藥后）于加藥后24h24h、48h48h和和72h72h分別在顯微鏡下觀察

11、藥物作用分別在顯微鏡下觀察藥物作用結(jié)果，并照相。結(jié)果，并照相。（5 5）血管計數(shù)。可結(jié)合自動圖像分析系統(tǒng)、攝像等技術(shù)完成）血管計數(shù)?？山Y(jié)合自動圖像分析系統(tǒng)、攝像等技術(shù)完成血管生成抑制率（對照組血管面積藥物組血管面積）血管生成抑制率（對照組血管面積藥物組血管面積）/ /對對照組血管面積照組血管面積1001002.2.以端粒酶為靶點的藥物篩選以端粒酶為靶點的藥物篩選端粒：真核細胞染色體末端的特殊結(jié)構(gòu)。維端粒：真核細胞染色體末端的特殊結(jié)構(gòu)。維持染色體穩(wěn)定性。持染色體穩(wěn)定性。 “生命的時鐘生命的時鐘” “” “有絲分裂的計數(shù)器有絲分裂的計數(shù)器”端粒酶功能：通過其逆轉(zhuǎn)錄酶活性復(fù)制和延端粒酶功能：通過其逆

12、轉(zhuǎn)錄酶活性復(fù)制和延長端粒長端粒dnadna來穩(wěn)定染色體來穩(wěn)定染色體dnadna端粒的長度。端粒的長度。端粒酶活性測定方法端粒酶活性測定方法端粒酶抑制劑端粒酶抑制劑3.3.細胞凋亡通路靶點細胞凋亡通路靶點 細胞周期調(diào)控靶點細胞周期調(diào)控靶點 與侵襲相關(guān)的靶點與侵襲相關(guān)的靶點 耐藥相關(guān)的分子靶點耐藥相關(guān)的分子靶點 靶點選擇原則：特異性、有效性、綜合靶點選擇原則：特異性、有效性、綜合性、個性化性、個性化五五 動物模型動物模型 整體動物實驗法是評價一個藥物是否有效整體動物實驗法是評價一個藥物是否有效的最主要方法的最主要方法 整體動物在腫瘤藥理學(xué)研究中的作用：整體動物在腫瘤藥理學(xué)研究中的作用： 1.1.研

13、究新開發(fā)藥物對腫瘤的防治作用；研究新開發(fā)藥物對腫瘤的防治作用； 2.2.抗腫瘤藥物篩選及抗腫瘤機理探索；抗腫瘤藥物篩選及抗腫瘤機理探索； 3.3.探索藥物和目前常規(guī)腫瘤治療方法的探索藥物和目前常規(guī)腫瘤治療方法的 綜合應(yīng)用以提高療效。綜合應(yīng)用以提高療效。常用宿主動物：常用宿主動物： 裸小鼠裸小鼠（“活的試管活的試管”） 特點：特點：先天無毛，無胸腺，先天無毛，無胸腺，t t淋巴細胞功能淋巴細胞功能 完全缺失，對異種移植不產(chǎn)生排斥反應(yīng)。完全缺失，對異種移植不產(chǎn)生排斥反應(yīng)。 缺點：缺點：費用高，飼養(yǎng)條件高，不宜大量繁殖。費用高，飼養(yǎng)條件高，不宜大量繁殖。 一般不用于初篩。一般不用于初篩。 應(yīng)用：應(yīng)用

14、：觀察藥物對癌細胞逆轉(zhuǎn)作用，觀察藥物對癌細胞逆轉(zhuǎn)作用， 抑制增殖及誘導(dǎo)凋亡作用。抑制增殖及誘導(dǎo)凋亡作用。c57bl/6c57bl/6小鼠小鼠 特點特點：黑毛，體型小，性情溫順，：黑毛，體型小，性情溫順， 易飼養(yǎng)，藥敏性好，為研究易飼養(yǎng)，藥敏性好，為研究 lewislewis肺癌首選。肺癌首選。 應(yīng)用：應(yīng)用：藥物體內(nèi)初篩。藥物體內(nèi)初篩。模型建立方法模型建立方法實體瘤建立實體瘤建立1.1.小塊瘤體接種法小塊瘤體接種法2.2.腫瘤細胞懸液接種法腫瘤細胞懸液接種法3.3.培養(yǎng)細胞移植法培養(yǎng)細胞移植法治療方案：治療方案：接種后生長至接種后生長至可觸及可觸及即可治療，依藥物即可治療，依藥物特性及研究目的確

15、定方案，可給藥一次，或連續(xù)特性及研究目的確定方案，可給藥一次，或連續(xù)幾次，或一周幾次連續(xù)幾周。幾次，或一周幾次連續(xù)幾周。療效評價：療效評價：腫瘤抑制率（對照組瘤重給藥組瘤重）腫瘤抑制率（對照組瘤重給藥組瘤重）/ /對照組對照組瘤重瘤重100100腹水瘤建立及評價：腹水瘤建立及評價：評價：對照組通常評價：對照組通常2-32-3周內(nèi)死亡，治療組一般觀察周內(nèi)死亡，治療組一般觀察50d50d左右，計左右，計算生命延長率。算生命延長率。生命延長率（治療組平均存活天數(shù)對照組平均存活天數(shù)）生命延長率（治療組平均存活天數(shù)對照組平均存活天數(shù)）/ /對照組平均存活天數(shù)對照組平均存活天數(shù)100100注意事項：注意事

16、項：1.1.取材時取實質(zhì)部位，不要取壞死、液化部位，防止污染。取材時取實質(zhì)部位，不要取壞死、液化部位，防止污染。2.2.試驗前先飼養(yǎng)裸鼠一周，以適應(yīng)新環(huán)境，若死亡超過試驗前先飼養(yǎng)裸鼠一周，以適應(yīng)新環(huán)境，若死亡超過10%10%不不可用，一般可用，一般18-22g18-22g，4-64-6周齡。周齡。3.3.飼養(yǎng)環(huán)境及鼠籠、墊料、飼料嚴格消毒飼養(yǎng)環(huán)境及鼠籠、墊料、飼料嚴格消毒4.4.保持恒溫，一般保持恒溫，一般252511，濕度，濕度40-60%40-60%，每天，每天10h10h光照、光照、14h14h黑暗。黑暗。 1 3 5 7 9 11 13 15dayst u m o r valume (

17、mm3)acabcdba b六六 基因芯片技術(shù)基因芯片技術(shù)1.1.原理原理 是一種建立在雜交測序基本理論上的全新是一種建立在雜交測序基本理論上的全新技術(shù)，它利用固定在芯片上的幾萬至幾十萬技術(shù)，它利用固定在芯片上的幾萬至幾十萬條探針與樣品進行雜交，在一步實驗中獲取條探針與樣品進行雜交，在一步實驗中獲取大量的信息。大量的信息。2.2.基本技術(shù)路線基本技術(shù)路線基因的選擇與實驗設(shè)計基因的選擇與實驗設(shè)計根據(jù)表達譜數(shù)據(jù)庫選擇根據(jù)表達譜數(shù)據(jù)庫選擇5000-100005000-10000個與發(fā)育及疾病相關(guān)的基因，制備藥個與發(fā)育及疾病相關(guān)的基因，制備藥物篩選芯片。物篩選芯片。芯片的制備芯片的制備細胞的培養(yǎng)與藥物刺激細胞的培養(yǎng)與藥物刺激根據(jù)目的藥物及表達譜芯片數(shù)據(jù)庫中細胞根據(jù)目的藥物及表達譜芯片數(shù)據(jù)庫中細胞表達譜選擇適當?shù)募毎担眠m當計量的藥物表達譜選擇適當?shù)募毎担眠m當計量的藥物加入細胞培養(yǎng)液中，不同的時間取樣，抽提刺加入細胞培養(yǎng)液中，不同的時間取樣，抽提刺激前后的激前后的mrnamrna。大白鼠飼養(yǎng)與藥物刺激大白鼠飼養(yǎng)與藥物刺激用常規(guī)方法飼養(yǎng)大白鼠，用適當劑量的