1、克隆文庫分析leolvcxm99L內 容 文庫評價 序列的拼接 載體去除 嵌合子去除 BLAST比對 RDP歸類 系統發育樹構建 序列提交文庫評價 文庫評價：主要是指對構建的克隆文庫中酶切的克隆子個數是否能夠代表整個環境絕大多數微生物類群，以及如何科學性的進行選擇酶切克隆子數。酶切克隆子個數選擇策略 單文庫：每次以100個克隆為基數進行酶切，切完后對庫中只出現一次的條帶進行統計，簡單計算其所占比重，覆蓋率達到80%左右即可。 多文庫：每次以50個克隆為基數進行酶切，分別進行計算覆蓋率，其中任何一個達到60%左右即可。例. 單個文庫可以盡量的選擇到曲線變的平滑階段，例. 多個文庫對比性的去取，其

2、中任何一個樣品若出現有變得緩慢即可停止。對比性的去取，其中任何一個樣品若出現有變得緩慢即可停止。稀有度曲線分析 采用EstimateS 8.0軟件進行稀有度分析。 (/estimateS) 軟件使用如下：數據錄入文庫名稱文庫名稱OTUs數：首行為總個數數：首行為總個數酶切的克隆個數：首行寫總個數，酶切的克隆個數：首行寫總個數，次行從次行從1開始按自然數排列開始按自然數排列格式行：此行全部為寫為格式行：此行全部為寫為1格式行：此行全部為寫為格式行：此行全部為寫為-1，表，表示結束示結束軟件操作結果稀有度曲線制作以 individuals 為橫

3、坐標，Sobs為縱坐標在Excel 中作曲線。稀有度曲線序列拼接 序列拼接：是指測序反應將一個長度大于1000bp的序列分別于兩端進行測序所得的兩個序列進行拼接在一起。 使用軟件contig軟件操作測序返回的結果測序返回的結果ab1格式的文件是指帶有測序峰圖的序列文件，序列拼格式的文件是指帶有測序峰圖的序列文件，序列拼接首選該文件接首選該文件。載體去除 由于測序常常使用的是載體上的序列，因此需要將所測序的結果進行去載體。 載體的去除，使用NCBI數據庫中的sequence analysis 中的vecscreen. /載體去除嵌合子剔除 運用

4、CHECK_CHIMERA (http:/wdcm.nig.ac.jp/RDP/cgis/chimera)對測序所得的細菌16S rRNA 基因序列進行嵌合子序列的檢查和剔除 BLAST序列比對 登錄NCBI主頁（/） 選擇BLAST 然后選擇BLAST序列比對輸入序列輸入菌株編號比對結果比對結果處理 對比對得到的結果進行處理：建立一個word文檔將相似性較高的序列復制粘貼進文檔。如圖這樣做的這樣做的目的是能目的是能夠快速，夠快速，方便的對方便的對標準菌株標準菌株進行選擇進行選擇。標準菌株的選擇 標準菌株的選擇：根據自己未來所要寫的文章的內容

5、的論據來進行選擇。由于克隆由于克隆文庫所得的序列大部分為不可培養類群，文庫所得的序列大部分為不可培養類群，因而標準菌株的選擇要選取與你環境相似，因而標準菌株的選擇要選取與你環境相似，并且在分類上具有較為詳細的分類的菌株并且在分類上具有較為詳細的分類的菌株。 總體標準：盡量選擇具有相似性高的純培養菌。RDP歸類 克隆文庫所得序列往往是一些不可培養類群，因而很難確定其具體分類地位，因此選擇使用RDP Classifer在線歸類系統。（/index.jsp）RDP歸類RDP歸類輸入序列RDP分類置信度調至95%此處為具體分類，但需要進一步的看歸類的置信度RD

6、P分類帶有置信度的分類重新開始點此處系統發育樹的構建 系統發育樹的構建：目的是用于對克隆序列進行進一步的精確地歸類。 注意事項：1）克隆的序列不能有反向序列克隆的序列不能有反向序列（主要是測序時產生的）2）標準菌株的選標準菌株的選擇擇（盡量選擇具有具體種屬信息的序列，或者相似環境下的序列）3）對樹要多計算對樹要多計算幾次來評估樹的穩定性幾次來評估樹的穩定性。系統發育樹構建 如何判斷序列是反向序列： 1）第一種：在BLAST序列比對時對自己的序列與網上的序列進行比較看你們的序列是否是從小到大排列對應的（也就是說你的序列是8F應該對應的是別人的8F或者小的） 2）第二種：預先將所有的序列構建一次系

7、統發育樹，如果有出現進化距離特別遠的序列，該序列為反向序列的可能非常大。此處序列為反此處序列為反向序列向序列反向序列修正系統發育樹構建 系統發育樹構建使用軟件MEGA 4.0。具體方法參考進化樹制作過程。序列提交 序列提交目的是為了獲得Genebank登錄號，一般的文章都需要并且非常重要。 序列提交首先要使用軟件sequin進行編輯。 其次將編輯好的序列用郵件發送至Genebank編輯郵箱，一星期左右就會得到序列登錄號。序列編輯 首先將確定分類的序列進行編輯，可以將同類（同門）菌株放入同一個文件夾。 格式：建立一個*.TXT的文檔，里面鍵入的格式如圖。sw-xj83 organism=uncu

8、ltured actinobacteriumstrain=sw-xj83 uncultured actinobacterium clone sw-xj83 16S ribosomal RNA gene sequence.序列另起一行頂格輸入序列另起一行頂格輸入Sequin序列編輯選擇所提交的數據庫選擇所提交的數據庫開始提交開始提交輸入一個名字，名字可以是你未來要發表文章的名字或者也可以填寫輸入一個名字，名字可以是你未來要發表文章的名字或者也可以填寫Direct submission。輸入名字，郵件電話等，此步很重要！輸入名字，郵件電話等，此步很重要！若每次只提交一個序列可以選擇這個選項若每次只提交一個序列可以選擇這個選項此處為此處為批量提批量提交交此處導入序列此處導入序列此處可以忽略此處可以忽略此處必須進行修訂，雙擊此處