1、1 第八節第八節 基因治療與基因診斷基因治療與基因診斷 2 一、基因治療的概念一、基因治療的概念 基因治療（gene therapy）就是向有功能 缺陷的細胞補充相應功能基因，以糾正或補償 其基因缺陷，從而達到治療的目的。 3 Gene Therapy Principles 4 原位修復(基因修復）：對有缺陷的基因在原來 位置上進行修復，使該基因恢復正常 基因替代療法：治療策略是切除發生缺陷的基 因，再轉入有功能的正常 基因增強：將目的基因導入靶細胞，目的基因 的表達產物可以補償缺陷細胞的功能 基因抑制：導入外源基因以抑制原有的基因， 目的在于阻斷有害基因的表達 二、基因治療的策略二、基因治療

2、的策略 5 基因治療的前景分析 基因治療：降低成本 理論上所有治療基因（包括非分泌蛋白）均可開展基因治療 基因治療：技術上難度大，有效性和安全性要求高 基因治療：僅10余年歷史，技術不夠成熟，風險大 6 三、基因治療的兩大途徑 7 1體細胞基因治療：把外源基因導入患者的體細胞， 以治療或預防基因接納者個人的疾病，只有特定的個 體受益，但不能遺傳給后代。 2種系細胞的基因治療：在生殖細胞（精子、卵子 或未分化的受精卵）中引入正常基因或修復缺陷基因 以校正遺傳缺陷。引入的外源基因（整合到基因組） 能遺傳給后代。 優點：目的基因轉移到機體的所有組織并遺傳給后代。 目前尚未開展，一是涉及倫理學問題；二

3、是技術困難 （診斷困難、引起新的插入突變的危險） 8 又稱間接體內基因轉移，基本途徑是： 個體供者組織或細胞移植物 組織培養 治療基因或標記基因培養細胞 選擇或富集轉基因細胞 I.轉染細胞實驗動物或受試病人的靶器官 1.通過回體（ex vivo）基因轉移的治療途徑 9 又稱直接體內基因轉移，將插入目的基因的表達載體直接導入 體內的方法。基本途徑是： 含治療基因表達載體直接注射/與介質結合后直接注射或用基 因槍導入體內 包裝細胞系中包裝好的復制缺陷型病毒顆粒 優點：簡便省時省力，能很快觀察到外源基因的表達及作用 缺點：DNA在體內不易進入細胞，易被降解，以病毒顆粒的形 式導入人體則易引起免疫反應

4、和被補體滅活。 2. 通過體內（in vivo）基因轉移的途徑 10 四、基因轉移的方法 病毒載體 逆轉錄病毒載體 腺病毒載體 單純皰疹病毒載體 非生物學方法 直接注射 脂質體 受體介導 11 （一）基因治療的病毒載體 應該具有的基本條件： 攜帶外源基因并能組裝成病毒顆粒 介導外源基因的轉移和表達 I.對機體沒有致病能力 12 充分了解載體病毒的基因組結構和功能（編碼區/非編 碼區、結構蛋白/非結構蛋白、必須基因/非必須基因、 包裝容量等） 外源基因插入病毒基因組的非必須區 致病基因（裂解細胞、癌基因使細胞轉化）刪除 插入外源基因長度受限刪除非必須基因/必須基因 （由輔助病毒或宿主細胞提供該基

5、因的功能） 病毒載體的產生 13 反轉錄病毒(Retrovirus, RV)載體 優點：基因轉移的效率 高，細胞宿主范圍較廣 泛，DNA整合效率高于 其它病毒載體等。 缺點：只感染分裂狀態 的細胞，載體容量小（ 8kb），目的基因在 未分化的細胞中常丟失 ，隨機整合潛在致癌的 危險。 14 優點： 安全，不整合到染色體上 不需要宿主細胞的分裂增殖就能進入細胞 缺點： 免疫原性較強 不能整合到宿主細胞基因組使得外源基因 表達持續時間有限 I.插入外源DNA的能力也有限（7kb）。 腺病毒(AV)載體 15 優點： 嗜神經組織 能插入較長外源基因（20kb或略長些 缺點： 較大的基因組使得遺傳操作

6、較難進行 不整合到宿主細胞基因組，表達持續的時間 受限 I.包含大量功能基因，安全水平尚待進一步觀 察 皰疹病毒（HSV）載體 16 優點： 安全，痘病毒在人類歷史上已經廣泛應用 外源基因的容量可達30 kb 適用廣泛的細胞型（可感染非分裂的細胞） 缺點： 不整合入細胞基因組，故外源基因表達的時間不能持久 載體過大，受免疫系統的影響也較大。 痘病毒（Poxvirus, PV）載體 17 （二）非病毒載體 1. 裸裸DNA 2. 脂質體脂質體/DNA復合物復合物 3. 多聚物多聚物/DNA復合物復合物 4. 其它方法其它方法 18 1. 裸DNA 方法：直接注射或基因槍轟擊 溶液類型對基因表達有

7、影響： 重組DNA可貯存于5%-30%的蔗糖溶液中 也可用生理鹽水或PBS 19 2. 脂質體/DNA復合物 形成高效包裝DNA的人造膜，與細胞膜極為相似。 形成脂質雙層包圍水溶液的脂質微球，與細胞融合后被 細胞內吞。 20 無毒性和免疫原性 可生物降解，不會在體內堆積 可制成球狀(0.03-50 m)，包容大小不同的生物分子 可帶有不同的電荷 具有不同的膜脂流動性、穩定性、及溫度敏感性，能適 應不同的生理要求 人工脂質體膜具有如下特點 21 陽離子多聚體 DNA帶負電 細胞表面帶負電 3. 多聚物/DNA復合物 22 受體介導基因轉移技術 磷酸鈣共沉淀法 電穿孔法 顯微注射法 4.其它方法

8、23 轉入功能基因（單基因遺傳病） 血友病B 薛京倫等用逆轉錄病毒載體將IX因 子的cDNA至血友病B患者的皮膚成纖維細胞中， 再回植患者皮下，患者凝血因子IX的表達明 顯增高，癥狀得到改善 重癥綜合性免疫缺乏癥（SCID） 五、基因治療的應用 24 n腺苷脫氨酶（腺苷脫氨酶（ADAADA）缺乏癥是常染色體隱性遺傳的）缺乏癥是常染色體隱性遺傳的 致死性疾病，患者由于致死性疾病，患者由于ADAADA缺乏導致脫苷腺氨酸增多，缺乏導致脫苷腺氨酸增多， 改變了甲基化能力，致使淋巴細胞受損，從而導致改變了甲基化能力，致使淋巴細胞受損，從而導致 免疫缺陷免疫缺陷 n19901990年，首次將年，首次將AD

9、AADA轉基因轉基因T T淋巴細胞注射到淋巴細胞注射到 人體骨髓組織人體骨髓組織（患有腺苷脫氨酶（患有腺苷脫氨酶（ADAADA） 缺乏癥的缺乏癥的4 4歲兒童歲兒童） ，治療SCID 25 基因治療基因治療SCID的過程的過程 26 轉基因治療的問題與危險性轉基因治療的問題與危險性 有效的目的基因過少；有效的目的基因過少； 安全性安全性: :導入的基因缺乏調導入的基因缺乏調 控手段；控手段； 有效性和穩定性：有效性和穩定性：缺少高效缺少高效 和導向的載體系統；和導向的載體系統； 目前人們多重視分子水平的目前人們多重視分子水平的 研究而忽略了整體研究，對研究而忽略了整體研究，對 整體宏觀水平缺乏

10、了解。整體宏觀水平缺乏了解。 1999年年9月月17日，美日，美 國國Arizona州州18歲的歲的 青年青年格爾辛格格爾辛格在賓夕在賓夕 法尼亞大學人類基因法尼亞大學人類基因 治療研究所接受基因治療研究所接受基因 治療治療4天后不幸死亡，天后不幸死亡， 成為基因治療實施以成為基因治療實施以 來第來第1個直接死于這個直接死于這 種試驗的病人。種試驗的病人。 生物技術與醫藥衛生生物技術與醫藥衛生 27 六、基因治療關鍵問題 1.靶向性基因導入系統 基因治療的關鍵問題是將治療基因送入特定得靶細 胞，并在該細胞中得到高效表達； 2.外源基因表達的可控性 導入基因后無調控表達將會產生嚴重后果。最理想

11、的可控性是模擬人體內基因本身的調控形式； 3.治療基因過少 28 29 30 31 Fig.1.MapofrecombinantAd.RGD.mda-7and Ad.RGD.pK7.mda-7adenovirusvectorsgenomes encodingmda-7. 32 Fig.2.Figureshowingtheenhancedtumorkillingeffectof geneticallymodifiedAd.RGD.pK7.mda-7andAd.RGD.mda-7 virusescomparedtounmodifiedAd.mda-7. 33 Fig.3.PBS(A)orcontr

12、olvirus Ad.GFPtreatedanimals(B),or Ad.RGD.Pk7.GFPtreated animals 34 Fig.4.Significantinhibitionoftumorgrowthand bloodyasciteswasshowninAd.mda-7treated animals(C)andAd.RGD.pK7.mda-7treated animals(E). 35 基因治療在未來人類重大疾基因治療在未來人類重大疾 病的預防和治療上必將發病的預防和治療上必將發 揮越來越大的作用！揮越來越大的作用！ 36 七、基因診斷（七、基因診斷（Gene Diagnosi

13、sGene Diagnosis） G G到到T T一個堿基的改變，決定了一個堿基的改變，決定了 一個人的命運一個人的命運 小皓珩出生小皓珩出生2323個月就出現皮疹、個月就出現皮疹、 便血等病狀，患上了罕見的原發便血等病狀，患上了罕見的原發 性免疫缺陷病。性免疫缺陷病。 DNADNA序列分析，證實了小皓珩序列分析，證實了小皓珩WASWAS 蛋白基因的蛋白基因的13881388位核苷酸由位核苷酸由G G突突 變為變為T T，使編碼谷氨酸的密碼，使編碼谷氨酸的密碼GAGGAG 突變為終止密碼突變為終止密碼TAGTAG WASWAS蛋白突變為無功能的蛋白突變為無功能的WASWAS蛋白，蛋白， 導致患

14、兒血小板減少，淋巴細胞導致患兒血小板減少，淋巴細胞 形態和功能異常形態和功能異常 希望：希望：WASWAS目前已經可以用骨髓目前已經可以用骨髓 移植或干細胞移植根治移植或干細胞移植根治 通過從患者體內提取樣本 (DNA)用基因檢測方法來 判斷患者是否有基因異常 或攜帶病原微生物的方法， 就是基因診斷。 生物技術與醫藥衛生生物技術與醫藥衛生 37 傳統與基因診斷的比較 傳統的診斷 望 問 聽 觸經驗 化驗/檢驗微生物、 免疫學、生物化學、病 理學等對細胞、組織、 酶、代謝物等檢測 影像學X線、B超、CT、 核磁共振、內窺鏡等 特殊檢查肌電/腦電/ 心電、骨密度等 基因診斷 應用分子生物學方法：如

15、應用分子生物學方法：如 PCRPCR技術或技術或PCRPCR與分子雜交與分子雜交 標記標記 主要應用于主要應用于 先天遺傳性疾患（苯丙酮尿先天遺傳性疾患（苯丙酮尿 癥、血紅蛋白病）癥、血紅蛋白病） 后天基因突變引起的疾病后天基因突變引起的疾病 （腫瘤、糖尿病）（腫瘤、糖尿病） 病原生物的侵入（流感、肝病原生物的侵入（流感、肝 炎、艾滋病）炎、艾滋病） 個體識別、法醫物證個體識別、法醫物證 生物技術與醫藥衛生生物技術與醫藥衛生 38 感染性疾病檢測感染性疾病檢測 n 利用PCR技術或PCR與分 子雜交標記相結合，可以 快速準確地檢測出病原性 物質 n乙型肝炎病毒 n丙型肝炎病毒 n結核桿菌和瘧原

16、蟲的分型 39 公安司法系統公安司法系統罪犯及受罪犯及受 害人的身份識別及親子鑒定害人的身份識別及親子鑒定 部隊部隊 傷亡士兵的身份傷亡士兵的身份 識別；印尼海嘯中死難人員識別；印尼海嘯中死難人員 身份識別身份識別 保安保安 個人個人DNADNA身份證，身份證， 用于人員識別用于人員識別 個體識別個體識別 14歲智障少女懷孕 親子鑒定牽出70歲嫌犯 40 作業：作業： “英國研究人員英國研究人員2007年年4月月12日宣布，他們在世界上首次日宣布，他們在世界上首次 確認了一個與肥胖相關的等位基因，他們將之稱為確認了一個與肥胖相關的等位基因，他們將之稱為FTO。 這一研究成果發表在這一研究成果發表在科學科學雜志上。雜志上。”如果你是一名肥如果你是一名肥 胖癥患者，你將如何根據這一新發現對自己進行治療？請胖癥患者，你將如何根據這一新發現對自己進行治療？請 簡要寫出治療方案。簡要寫出治療方案。 “統計表明，全世界統計表明，全世界HBV（乙型肝炎）感染者和攜帶者達（乙型肝炎）感染者和攜帶者達 3.5億人之多。我