1、超濾對當歸多糖組分總糖含量和蛋白含量的阻礙劉新友，周四元，程建峰，張琰，劉琳娜，梅其炳【摘要】目的探討超濾分離當歸多糖組分的可行性及其對各組分總糖含量和蛋白含量的阻礙。方式新鮮岷縣當歸經80%無水乙醇 回流除去脂溶性成份，水提醇沉提取當歸粗多糖。將當歸粗多糖用蒸 儲水溶解，反復凍融除蛋白后，超濾分離出不同分子量的當歸多糖組 分，并測定各組分的總糖含量及蛋白含量。結果超濾取得分子量別離 為1030 kd, 30300 kd和>300 kd的3個組分，其顏色別離 為棕褐色、淡黃色、類白色；總糖含量別離為%, %和;蛋白含量別離 為%, %和%;當歸多糖中以分子量>300 kd的當歸多糖

2、組分為主， 占當歸干重的。結論超濾分離當歸多糖，可取得總糖含量較高而蛋白 含量較低的要緊組分，且操作簡單，適于規模化生產。【關鍵詞】超濾分離當歸多糖含量測定abstract:objectiveto explore the feasibility of isolating angelica sinensis polysaccharide fractions by ultrafiltration and the effect of ultrafiltration on total sugar content and protein content of these fractions. metho

3、dsthe fresh plant danggui from min-xian county was circumfluenced in 80% ethanol to remove the lipophilic fraction. rude polysaccharide was obtained by adding ethanol to its concentrated solution extracted in distilled water. the rude polysaccharide was dissolved in distilled water and was deprotein

4、ized by repeated freeze thawing, then the different polysaccharide fractions were isolated by ultrafiltration. the contents of the total sugar and the protein of these fractions were three fractions with different molecular weight of 10 30 kd, 30 300 kd and > 300 kd were obtained. the colors of t

5、hese fractions were dark brown, light yellow and off-white color, respectively. the total sugar content was %, % and %, respectively. the protein content was %, % and %, respectively. the main component of angelica sinensis polysaccharide was the fraction with large molecular weight (>300kd), whi

6、ch accounted for % of dry danggui. conclusionthe main fraction of angelica sinensis polysaccharide obtained by ultrafiltration has higher total sugar content and lower protein content and the isolation by ultrafiltration is easy to operate, hence, it is suitable to isolate angelica sinensis polysacc

7、haride fractions in large scale.key words:ultrafiltration; isolation; angelicasinensis polysaccharide; content determination當歸多糖是一種多組分多糖，分子量范圍很廣，因為藥材產 地、搜集時刻和提取方式的不同其組成會有專門大轉變。現代藥理學 研究證明，當歸多糖具有增強免疫1、提高造血功能2、保肝3、 抗腫瘤4、抗輻射損傷5及增進胃腸道黏膜上皮細胞的移行與增 殖，拮抗潑尼松龍引發的外周血白細胞減少，加速胃腸道損傷黏膜修 復等作用6,還能作為載體合成具有結腸靶向遞藥特性的地塞米

8、松 前體藥7o但當歸多糖常采納凝膠柱進行分離，效率低，本錢高。 本實驗擬采納超濾分離當歸多糖組分，并對各組分的總糖含量和蛋白 含量進行分析。1材料與儀器甘肅岷縣新鮮當歸，于每一年霜降后采收。無水乙醇，無水 葡萄糖，濃硫酸，磷酸均為分析純；重蒸苯酚（陜西建華生物）；serva blue-g-250染料（華麗生物工程公司）；牛血清白蛋白（bsa） （sigma-aldrich）o mm12型食物絞碎機（廣東省韶關市食物機械廠）, 10l調溫式電熱套（北京科偉永興儀器），re52-05型旋轉蒸發儀（上 海亞榮生化儀器廠），cr21f型高速離心機（hitachi）,真空泵（河南 鞏義市英裕予華儀器廠）

9、，冷凍干燥機（fts systems）, du-800紫外 分光光度計（beckman）, pellicon標準超濾儀和pellicon-2超濾膜 包為millipore公司生產。2方式與結果當歸藥材的預處置岷縣新鮮當歸，清水洗凈后，用食物絞碎 機絞碎，浸泡于無水乙醇中保留。取醇浸當歸，以85%乙醇回流提取3 次，2 h/次。醇提當歸渣自然晾干，備用。當歸總多糖的提取取處置后的干當歸渣500 g,加入20倍 蒸儲水回流提取3次，時刻別離為3 , 3 , 2 h。歸并3次提取液， 60 減壓濃縮至5 000 ml,放冷，3 000 r/min離心10 min,上清 液繼續濃縮至呈稠膏狀，加入3倍

10、量（體積）無水乙醇，邊加邊攪拌, 靜置自然沉淀。傾去上層乙醇液，余下部份以3 000 r/min離心10 min, 取得淡黃色的當歸粗多糖。反復凍融除蛋白取離心取得的當歸粗多糖，按濕重加入4 倍量的蒸馀水溶解，于-20 反復凍融8次，3 000 r/min離心20 min 除蛋白。超濾分離當歸多糖組分除蛋白后的當歸多糖液加兩倍量的蒸儲水稀釋，用um的 微孔濾膜過濾，以10 kd的超濾膜透析除去小分子雜質，然后依次用300 kd, 100 kd和30 kd的超濾膜分離。將分離的組分液減壓濃縮, 冷凍干燥，取得分子量別離為1030 kd, 30300 kd和>300 kd 3個當歸多糖組分。

11、超濾取得的當歸多糖組分，隨分子量的增加，其 顏色慢慢變淺；當歸多糖中以大分子的當歸多糖為主，其中分子量 >300 kd組分占當歸干重的乳 結果見表lo表1當歸多糖組分的 性狀及收率組分顏色收率（略）收率以所得多糖占干當歸渣干重的百分比表示。總糖含量測定方式采納改良的苯酚一硫酸法測定總糖含量8。重蒸苯酚用蒸 儲水配成60 g/l的溶液。周密稱取105 干燥至恒重的無水葡萄糖 15 mg,用蒸儲水定容至100 ml,使成150 u g/ml的葡萄糖儲蓄液。標準曲線制備別離周密量取葡萄糖儲蓄液，ml于10 ml具塞圓底試 管中，各加蒸儲水至1ml,振搖混勻，使成， ug/ml的葡萄糖 標準工作

12、液。于各管中別離加入60 g/l的苯酚溶液ml,濃硫酸3ml, 漩渦振蕩器振蕩均勻，放置15 min,于490 nm處測定吸光度，每一個 濃度平行做3組，計算平均吸光度值。空白校正用蒸儲水1ml按上法 平行操作。以測得的平均吸光度值(y)對葡萄糖標準工作液的濃度(x, u g/ml)作線性回歸，得測定總糖含量的標準曲線回歸方程為y= 6 x+ 4, r= 6,線性范圍 u g/mlo準確度和周密度實驗別離配制，u g/ml的葡萄糖溶液，按標準曲線制備方式操 作，同1日內持續測定5次，計算平均回收率及日內rsd； 3個濃度天 天各測定1次，持續測定5 d,計算日間rsd。結果見表2。表2總糖 含

13、量測定方式的準確度和周密度(略)蛋白含量測定方式采納servablue-g染料結合法9測定當歸多糖中的蛋白 含量。serva blue-g 儲蓄液的配制：稱取 serva blue-g-250 70 mg, 用95%乙醇20 ml溶解，加入85%磷酸40 ml,搖勻，于室溫寄存。serva blue-g匚作液的配制:取serva blue-g儲蓄液3 ml, 95%乙醇ml, 85%磷酸3 ml用雙蒸水定容于50 ml,棕色瓶寄存，室溫保留，用前 過濾。牛血清白蛋白(bsa)儲蓄液配制：周密稱取bsa 4 mg,用生 理鹽水溶解并定容于100 ml容量瓶中，使之成濃度為40 ug/ml的 bs

14、a儲蓄液。標準曲線制備取bsa儲蓄液用生理鹽水別離配制濃度為，u g/ml的 bsa系列標準溶液。取bsa系列標準溶液各1ml,別離置于1次性聚 乙烯試管中，每管均加入serva blue-g匚作液1 ml,漩渦振蕩器混 勻。空白校正用生理鹽水1 ml平行操作。2 min后于595 nm測定吸 光度，lh內測定完畢。每一個濃度平行做3組，求出平均吸光度值。 以測得的平均吸光度值(y)對bsa系列標準溶液濃度(x, h g/ml)作 線性回歸，取得測定蛋白的標準曲線回歸方程為y= 3x+ 3,廠8, 線性范圍 u g/ml0準確度和周密度實驗取bsa儲蓄液用生理鹽水別離配制濃度為，ug/ml的

15、bsa溶液，按標準曲線制備方式操作，同1日內持續測定5次，計算 平均回收率和日內rsd； 3個濃度天天測定1次，持續測定5 d,計算 日間rsd。結果見表3。表3蛋白含量測定方式的準確度和周密度(略)各組分總糖含量和蛋白含量的測定周密稱取當歸多糖各組分25 mg,別離用蒸馀水溶解定容至50 ml,使成500 mg/ml的樣品溶液。取樣品溶液ml按總糖含量測定方式項下方式操作，于490 nm測定吸光度，每一個樣品平行做3組, 同時以蒸儲水1ml平行做空白校正。以測得的平均吸光度值代入測定 總糖含量的標準曲線回歸方程，計算各組分總糖含量。取樣品溶液1 ml,按蛋白含量測定方式項下方式操作，于595

16、 nm測定吸光度，每一 個樣品平行做3組，計算平均吸光度值，同時以生理鹽水1ml平行做 空白校正。以測得的平均吸光度值代入測定蛋白含量的標準曲線回歸 方程，計算各組分蛋白質含量。測定結果說明，隨著當歸多糖組分分 子量的增大，其總糖含量增加，蛋白含量降低，其中分子量大于300 kd 組分的總糖含量高達%,蛋白含量僅為九結果見表4。表4當歸多糖 組分的總糖含量及蛋白含量（略）表中的未超濾多糖為反復凍融除蛋白后的凍干品。3討論當歸為塊狀根莖類，在干燥進程中由于其所含的酶類可能會 使多糖的組分發生轉變，因此市售干當歸提取的多糖其質量不易操縱。 有些藥商在炮制進程中采納了硫磺熏制的方法，在當歸切片時為了

17、避 免粘連還涂抹了油性物質，用這種飲片提取的當歸多糖性狀較差，醇 沉后粘性大，總糖含量低，質量難以操縱。鑒于此，咱們選用了新鮮 當歸，將新鮮當歸藥材絞碎后，以無水乙醇浸泡的方式對當歸藥材進 行預處置。無水乙醇浸泡能夠除去一部份脂溶性成份，破壞細胞脂膜, 有利于水提時當歸多糖的浸出，同時還能破壞當歸藥材中的酶類，使 多糖的組分維持穩固，最大程度上保證了提取的當歸多糖的質量可控 性。當歸多糖提取純化的關鍵步驟是除色素和蛋白，乙醇預處置 雖可除去一部份色素，但提取的多糖仍然有較深的顏色。咱們最初考 慮用活性炭脫色，但在實驗進程中發覺，當歸多糖溶液粘性較大，加 入的活性炭很難除去。另外加活性炭處置取得

18、的當歸多糖總糖含量較 低，可能是活性炭吸附了大量的多糖，而對其它雜質的吸附較少所致, 這可能對其組成產生專門大阻礙。因此，咱們以為活性炭不適合于當 歸多糖的脫色。當歸多糖中含有的植物蛋白會阻礙其內在質量。常規 除蛋白多采納三氯乙酸法和糅酸法，但在酸性條件下可能造成多糖的 降解；sevag法在幸免多糖降解方面成效較好，但試劑消耗量大，也 可能造成氯仿等有機溶劑的殘留。商澎等10將當歸多糖液置于 -20 反復凍融除蛋白，因此咱們采納了反復凍融的方式除蛋白。超 濾結果說明，分子量小的組分顏色較深，而分子量300 kd以上組分為 類白色；蛋白含量測定說明，隨分子量組分的增大，蛋白含量降低， 300 k

19、d以上組分所含的蛋白是反復凍融除蛋白后當歸多糖的%，是10 30 kd組分的,因此超濾有利于除去大分子量多糖組分中的色素和游 離蛋白。從總糖含量測定結果能夠發覺，高分子量當歸多糖組分的總 糖含量高，而分子量越低的組分，其總糖含量越低，說明當歸多糖的雜質主若是低分子量的物質。超濾分離當歸多糖組分的收率說明，當 歸多糖中以分子量300 kd以上組分為主，達到藥材干重的5%以上， 且該組分的總糖含量亦高達80%以上。綜上所述，超濾可用于分離當歸多糖組分，而且能夠起到去 除要緊組分(>300 kd)中色素和蛋白的作用，而且超濾法操作簡 單，適于規模化生產。【參考文獻】1楊鐵虹，盧保華，賈敏，等.當歸多糖對小鼠免疫功能 的阻礙j.中國藥理學通報,2003, 19(4):448.2李靜，王亞平.當歸多糖對骨髓巨噬細胞的阻礙及其 與造血調控的關系與1 .中草藥,2005, 36(1): 69.3操剛，趙驥，陳紅光，等.當歸多糖對小鼠實驗性肝損 傷的阻礙j.咸寧學院學報(醫學版)，2004, 18(5):332.4左增艷，柳鐘勛，李鍵蕊一等.新型生物反映調劑劑：當歸