SDS-PAGE教程1 SDS-PAGE原理SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進(jìn)SDS（十二烷基硫酸鈉）， SDS會(huì)與變性的多肽，并使蛋白帶負(fù)電荷，由于多肽結(jié)合SDS的量幾乎總是與多肽的分子量成正比而與其序列無(wú)關(guān)，因此SDS多肽復(fù)合物在丙稀酰胺凝膠電泳中的遷移率只與多肽的大小有關(guān)，在達(dá)到飽和的狀態(tài)下，每克多肽可與1.4 g去污劑結(jié)合。當(dāng)分子量在15 KDa到200 KDa之間時(shí)，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對(duì)數(shù)呈線(xiàn)性關(guān)系，符合下式：log MW = K bX，式中：MW為分子量，X為遷移率，k、b均為常數(shù)，若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對(duì)分子量對(duì)數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，未知蛋白質(zhì)在相同條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上求得分子量。SDS-PAGE Laemmli法這種方法帖出來(lái)，大家是不是感覺(jué)非常的陌生呢？其實(shí)這種發(fā)方法很普遍，現(xiàn)在大部分的實(shí)驗(yàn)室都是用Laemmli法跑電泳的。如今實(shí)驗(yàn)室中用的最多的蛋白電泳是源于Laemmli于1970年發(fā)表在nature上的一篇文章中的方法，這篇文章很特別,不僅被引用的次數(shù)較多，而且該篇并不是專(zhuān)門(mén)闡述蛋白電泳方法上的提出和改進(jìn)問(wèn)題，而是對(duì)噬菌體頭部包裝過(guò)程中的蛋白進(jìn)行分析過(guò)程中用到電泳分析方法而已，所以闡述如何操作的文字只有那么一小段（但相當(dāng)經(jīng)典），這是SDS-PAGE（不連續(xù)系統(tǒng)）的首次成功應(yīng)用?，F(xiàn)在我們?cè)趯?shí)驗(yàn)室進(jìn)行的SDS-PAGE試劑的配方仍然是沿用了它的數(shù)據(jù),許多論文在描述其SDS-PAGE時(shí)引用Laemmli方法，目前常用的具有濃縮膠和分離膠的不連續(xù)SDS-PAGE的基礎(chǔ)的確來(lái)自Laemmli方法，但也略有差別例如一些緩沖液的具體組成。你也許會(huì)恍然大悟：原來(lái)我們用的就是Laemmli！SDS-PAGE各試劑配制方法30%聚丙烯酰胺溶液-30%（w/v）Acrylamide 【組分濃度】各種組分名稱(chēng)體積(mL)或質(zhì)量(g)備注30%Acr-Bis(29:1)100 mL實(shí)驗(yàn)室配制時(shí)用量(100 mL)29% Acrylamide(丙烯酰胺)29 g29.2 g1% BIS(N,N-亞甲丙烯酰胺)1 g0.8 g【配制方法】將29克丙烯酰胺和1克N,N-亞甲丙烯酰胺溶于總體積為60ml溫?zé)幔?7左右）的去離子水中，充分?jǐn)嚢枞芙猓a(bǔ)加水至終體積為100ml。0.45m微孔濾膜過(guò)濾除菌和雜質(zhì)，儲(chǔ)于棕色瓶，4避光（用鋁箔紙包扎起來(lái)）保存。嚴(yán)格核實(shí)pH不得超過(guò)7.0，因可以發(fā)生脫氨基反應(yīng)是光催化或堿催化的。使用期不得超過(guò)兩個(gè)月，隔幾個(gè)月須重新配制。如有沉淀，可以過(guò)濾?！颈４鏃l件】4避光（用鋁箔紙包扎起來(lái)）保存【注意事項(xiàng)】丙烯酰胺具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性并可通過(guò)皮膚吸收，其作用具有累積性。稱(chēng)量丙烯酰胺和N,N-亞甲丙烯酰胺時(shí)應(yīng)戴手套和面具?？烧J(rèn)為聚丙烯酰胺無(wú)毒，但也應(yīng)謹(jǐn)慎操作，因?yàn)樗€可能含有少量未聚合材料。1 M Tris-HCl（pH6.8）(濃縮膠buffer)【組分濃度】1 M Tris-HCl名稱(chēng)用量備注Tris12.1g去離子水80ml濃鹽酸9ml(36%的濃鹽酸)預(yù)實(shí)驗(yàn)已確定去離子水加入去離子水定容至100ml后，室溫保存【配制方法】稱(chēng)量12.1 g Tris堿溶于80 mL的去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙?，加約9 mL的濃HCl調(diào)節(jié)至所需要的pH值，將溶液定容至100 mL，高溫高壓滅菌后，室溫保存。應(yīng)使溶液冷卻至室溫后再調(diào)定pH值，因?yàn)門(mén)ris溶液的pH值隨溫度的變化差異很大，溫度每升高1，溶液的pH值大約降低0.03個(gè)單位。【保存條件】室溫保存?！咀⒁馐马?xiàng)】對(duì)人體有刺激性，請(qǐng)注意適當(dāng)防護(hù)。1.5 M Tris-HCl（pH 8.8）(分離膠buffer)【組分濃度】1.5 M Tris-HCl名稱(chēng)用量備注Tris18.17 g去離子水80 mL濃鹽酸3 mL(36%的濃鹽酸)預(yù)實(shí)驗(yàn)已確定去離子水加入去離子水定容至100 mL后，室溫保存【配制方法】100 mL稱(chēng)量18.17 g Tris堿溶于80 mL的去離子水中，充分?jǐn)嚢枞芙猓蛹s3 mL濃HCl調(diào)節(jié)至所需要的pH值，將溶液定容至100 mL，高溫高壓滅菌后，室溫保存。【保存條件】室溫保存【注意事項(xiàng)】應(yīng)使溶液冷卻至室溫后再調(diào)定pH值，因?yàn)門(mén)ris溶液的pH值隨溫度的變化差異很大，溫度每升高1，溶液的pH值大約降低0.03個(gè)單位。10% 十二烷基硫酸鈉SDS溶液-10%(w/v)SDS 【組分濃度】10% (w/v) SDS名稱(chēng)用量備注SDS1 g去離子水8 mL加入去離子水定容至10 ml后，室溫保存【配制方法】稱(chēng)取2 g高純度的SDS置于100200 mL燒杯中，加入約16 mL的去離子水，于68 加熱溶解，滴加濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.2，定容至20mL后，室溫保存。【保存條件】室溫保存【注意事項(xiàng)】保存條件：4保存。注意事項(xiàng)：易燃，有腐蝕性，請(qǐng)注意防護(hù)。易揮發(fā)，使用后請(qǐng)蓋緊瓶蓋。為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。保存條件：4保存。注意事項(xiàng)：易燃，有腐蝕性，請(qǐng)注意防護(hù)。易揮發(fā)，使用后請(qǐng)蓋緊瓶蓋。為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套對(duì)人體有害，請(qǐng)注意防護(hù)。10% 過(guò)硫酸銨溶液-10% (w/v) APS【組分濃度】10% (w/v) 過(guò)硫酸銨(APS)名稱(chēng)用量備注過(guò)硫酸銨0.1 g去離子水1 mL現(xiàn)配現(xiàn)用【配制方法】稱(chēng)取0.1 g過(guò)硫酸銨置于1.5 mL離心管，加1 mL去離子水吹打溶解，亦可以加倍，即稱(chēng)取1 g過(guò)硫酸銨，加入10 mL的去離子水后攪拌溶解。4 保存?！颈４鏃l件】4保存【注意事項(xiàng)】10%過(guò)硫酸銨溶液在4保存時(shí)，可使用2周左右，超過(guò)期限會(huì)失去催化作用。5Tris-甘氨酸電泳緩沖液-5Tris-Glycine buffer （SDS-PAGE電泳緩沖液）【組分濃度】各種組分名稱(chēng)配制不同體積所需各成分的體積(mL)或質(zhì)量(g)1000ml500ml0.125M Tris15.1g1.25M glycine(甘氨酸)94.0g0.5%(W/V)SDS5.0g【配制方法】稱(chēng)取15.1 g Tris，94.0g甘氨酸（glycine），5.0gSDS，用800mL蒸餾水或去離子水溶解，充分?jǐn)嚢枞芙猓ㄈ葜?000 mL，室溫保存。得0.125 mol/L Tris-1.25 mol/L甘氨酸電極緩沖液。臨用前稀釋5倍?！颈４鏃l件】室溫保存，兩年有效?！咀⒁馐马?xiàng)】配制好的電泳液使用時(shí)間不宜超過(guò)兩周。電泳緩沖液可以回收，回收后可再使用1-2次，但為了取得最佳的電泳效果，應(yīng)使用新電泳液。 5SDS-PAGE加樣緩沖液-5SDS-PAGE Loading Buffer 【組分濃度】0.25 M Tris-HCl (pH 6.8)；10% (W/V)SDS；0.5% (W/V) BPB(溴酚藍(lán))；50% (V/V) 甘油；5% (W/V) -巰基乙醇(2-ME)或0.5 M DTT(二硫蘇糖醇)各種組分名稱(chēng)配制用量備注總體積10 mL1 M Tris-HCl (pH 6.8)2.5 mLSDS1 gBPB(溴酚藍(lán))50 mg甘油5 mL（0.5 mL/份）分裝，室溫保存，使用前加25 L 2-ME/小份，保存一個(gè)月左右。-巰基乙醇(2-ME) 0.5 mL【配制方法】量取1.25 mL 1 M Tris-HCl（pH 6.8），0.5 g SDS，25 mg BPB，2.5 mL甘油，置于10 mL塑料離心管中，加去離子水溶解后，定容至5 mL，小份（0.5 mL/份）分裝，于室溫保存。使用前將25 L的2-ME加入到每小份中。加入2-ME的Loading Buffer可在室溫下保存一個(gè)月左右?！颈４鏃l件】-20保存，至少一年有效。 【注意事項(xiàng)】SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5X)中含少量DTT或-巰基乙醇，有輕微刺激性氣味，必須完全溶解后再使用。二者作用相似，但DTT 的刺激性和毒性都低于-巰基乙醇，且粉末的穩(wěn)定性也高于-巰基乙醇。DTT的最佳工作pH范圍為7.1-8.0，但DTT價(jià)格略高一些。蛋白巰基還原實(shí)驗(yàn)DTT的常用工作濃度是1-10 mM。摘自Takara 商品目錄-實(shí)驗(yàn)室常規(guī)試劑配制方法 TEMED原液直接使用考馬斯亮藍(lán)R-250染色液 【組分濃度】0.1%(w/v)考馬斯亮藍(lán)R-250，25%(v/v)異丙醇，10%(v/v)冰醋酸各種組分名稱(chēng)配制不同體積所需各成分的體積(mL)或質(zhì)量(g)1000 ml備注考馬斯亮藍(lán)R-2501.0 g可以多加點(diǎn)，最好在搖床上搖搖，多溶解些。異丙醇250 mL攪拌溶解，可用甲醇或乙醇替代。甲醇固定效果好，但甲醇難聞且對(duì)身體有害。乙醇濃度太大會(huì)使膠皺縮。冰醋酸100 mL攪拌均勻去離子水650 mL攪拌均勻，濾紙快速過(guò)濾除去顆粒物，室溫保存考馬斯亮藍(lán)R250染色，染色時(shí)間控制在0.5-1h。（注意：（1）保存考馬斯亮藍(lán)R250可回收使用，可保存很長(zhǎng)時(shí)間，但一般不超過(guò)6個(gè)月；（2）染色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)難以脫色，過(guò)短染色效果不佳；）考馬斯亮藍(lán)染色脫色液【組分濃度】10%(v/v)醋酸，5%(v/v)乙醇名稱(chēng)用量備注冰醋酸100 mL乙醇250 mL一般加的量與染色液相同，只是不加R-250去離子水650 mL充分混勻后使用脫色（三個(gè)小時(shí)后應(yīng)換次脫色液，再重新加入脫色液且約需脫色24小時(shí)，直到背景清晰為止）（1）蒸餾水中沖洗2-3次（2）7冰乙酸固定（3）7冰乙酸 10乙醇83ml蒸餾水脫色（4）7冰乙酸保存（要檢測(cè)脫色后的膠，則需保存于7冰乙酸中）蒸餾水沖洗7冰乙酸（關(guān)鍵步驟），10乙醇脫色脫色液：7冰乙酸 ，10乙醇，83ml蒸餾水7冰乙酸保存（蒸餾水沖洗后用7冰乙酸保存且約二四天后再照膠，條帶更為清晰）。銀氨染色用凝膠固定液（質(zhì)譜用）【組分濃度】 50% (V/V) 甲醇，10% (V/V) 醋酸名稱(chēng)用量備注甲醇500 mL醋酸100 mL去離子水400 mL充分混勻后室溫保存銀氨染色用凝膠處理液【組分濃度】50% (v/v) 甲醇，10% (v/v) 戊二醛名稱(chēng)用量備注甲醇50 mL戊二醛10 mL去離子水40 mL充分混勻后室溫保存銀氨染色用凝膠染色液【組分濃度】0.4% (w/v) AgNO3，1% (v/v) 濃NH3H2O，0.04% (w/v) NaOH名稱(chēng)用量備注20% AgNO32 mL濃NH3H2O1 mL4% NaOH1 mL去離子水96 mL充分混勻后室溫保存【配制方法】取上述試劑加入100 200 mL的試劑瓶中，均勻混合。該溶液應(yīng)為無(wú)色透明狀。如果氨水濃度過(guò)低時(shí)溶液會(huì)呈混濁狀，此時(shí)應(yīng)補(bǔ)加濃氨水直至透明。本染色液應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，不宜保存。銀氨染色用顯影液【組分濃度】0.005% (w/v) 檸檬酸，0.02% (v/v) 甲醛名稱(chēng)用量備注檸檬酸50 mg甲醛0.2 mL去離子水定容至1 L后充分混勻，室溫保存SDS-PAGE凝膠配方1) 根據(jù)目的蛋白的分子量大小選擇合適的凝膠濃度，再按照下面的表格配制SDS-PAGE的分離膠(即下層膠)：丙烯酰胺在凝膠中的百分比分離膠最佳分離范圍5%60-212 kDa7.5%30-120 kDa10%18-75 kDa12%12-60 kDa15%15-45 kDa來(lái)源于蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè)汪家政每種濃度的變性膠的分離范圍不是指能跑出哪個(gè)范圍分子量的蛋白質(zhì)，而是指在這個(gè)區(qū)間內(nèi)，蛋白質(zhì)遷移率基本和分子量成正比，也就是線(xiàn)性關(guān)系，為了數(shù)據(jù)的可靠性，大家盡量根據(jù)這個(gè)來(lái)選擇自己配膠的濃度。成分配制不同體積SDS-PAGE分離膠所需各成分的體積（毫升）6%膠510152025304050蒸餾水2.65.37.910.613.215.921.226.530%Acr-Bis(29:1)1.02.03.04.05.06.08.010.01.5 M Tris,pH8.81.32.53.85.06.37.510.012.510%SDS0.050.10.150.20.250.30.40.510%過(guò)硫酸銨0.050.10.150.20.250.30.40.5TEMED0.0040.0080.0120.0160.020.0240.0320.04成分配制不同體積SDS-PAGE分離膠所需各成分的體積（毫升）8%膠510152025304050蒸餾水2.34.66.99.311.513.916.523.230%Acr-Bis(29:1)1.32.74.05.36.78.010.713.31.5 M Tris,pH8.81.32.53.85.06.37.51012.510%SDS0.050.10.150.20.250.30.40.510%過(guò)硫酸銨0.050.10.150.20.250.30.40.5TEMED0.0030.0060.0090.0120.0150.0180.0240.03成分配制不同體積SDS-PAGE分離膠所需各成分的體積（毫升）10%膠510152025304050蒸餾水1.94.05.97.99.911.915.919.830%Acr-Bis(29:1)1.73.35.06.78.310.013.316.71.5 M Tris,pH8.81.32.53.85.06.37.510.012.510%SDS0.050.10.150.20.250.30.40.510%過(guò)硫酸銨0.050.10.150.20.250.30.40.5TEMED0.0020.0040.0060.0080.010.0120.0160.02成分配制不同體積SDS-PAGE分離膠所需各成分的體積（毫升）12%膠510152025304050蒸餾水1.63.34.96.68.29.913.216.530%Acr-Bis(29:1)2.04.06.08.010.012.016.020.01.5 M Tris,pH8.81.32.53.85.06.37.510.012.510%SDS0.050.010.150.20.250.30.40.510%過(guò)硫酸銨0.050.010.150.20.250.30.40.5TEMED0.0020.0040.0060.0080.010.0120.0160.02成分配制不同體積SDS-PAGE分離膠所需各成分的體積（毫升）15%膠510152025304050蒸餾水1.12.33.44.65.76.99.211.530%Acr-Bis(29:1)2.55.07.510.012.515.020.025.01.5 M Tris,pH8.81.32.53.85.06.37.510.012.510%SDS0.050.10.150.20.250.30.40.510%過(guò)硫酸銨0.050.10.150.20.250.30.40.5TEMED0.0020.0040.0060.0080.010.0120.0160.02注：如果配制非變性膠，參考上述配方，不加10%SDS即可配制成非變性PAGE膠。1) 按照如下表格配制SDS-PAGE的濃縮膠(也稱(chēng)堆積膠、積層膠或上層膠)：成分配制不同體積SDS-PAGE濃縮膠所需各成分的體積（毫升）5%濃縮膠123456810蒸餾水0.681.42.12.73.44.15.56.830%Acr-Bis(29:1)0.170.330.50.670.831.01.31.71 M Tris,pH8.80.130.250.380.50.630.751.01.2510%SDS0.010.020.030.040.050.060.080.110%過(guò)硫酸銨0.010.020.030.040.050.060.080.1TEMED0.0010.0020.0030.0040.0050.0060.0080.01TBST 緩沖液每2L體積中含：1M TrisHCL(pH7.5)100mLNacl16gKCL0.4g吐溫1mlWestern blot用的緩沖溶液。1) 抗體去除液每50mL抗體去除液中含：0.5M TrisHCL（pH6.8）6.25mL10%SDS10mLBeta-ME0.175mL水33.75mLSDS-PAGE操作方法1、20uL 收集液，加入 5樣品緩沖液 5ul，在 80水浴鍋中煮 5min。按照上面配方制 SDS-PAGE 凝膠，安裝好電泳儀，在槽中加入電極緩沖液。3、按一定順序在加樣孔中加入樣品，根據(jù) SDS-PAGE 電泳玻璃板間隙厚度不同，選擇加入樣品量，一般 0.75mm 間隙 15 孔的上樣量10uL/孔,1mm 間隙 10 孔的上樣量20ul/孔。上樣量根據(jù)實(shí)際經(jīng)驗(yàn)自己掌握。4、打開(kāi)電源將電壓調(diào)到 80v（一般 15min 左右），待樣品跑過(guò)壓縮膠后將電壓調(diào)到 120v 至樣品電泳到膠底部為止。5、將凝膠小心取下放入容器中，加入染色液，用搖床搖 23h6、待條帶清晰后倒出染色液，加入脫色液過(guò)夜7、將脫色液倒掉，可以用 Quality One，或者相應(yīng)的成像系統(tǒng)拍照、分析、估算蛋白濃度。SDS-PAGE膠的凝結(jié)速度受溫度影響很大，隨著溫度的升高，凝結(jié)速度越來(lái)越快，溫度降低則反之。所以，夏天時(shí)膠凝結(jié)的比較快，而冬天膠的凝結(jié)速度則變慢，甚至不能凝結(jié)，解決此類(lèi)問(wèn)題較可行的方法是：冬天在原配方的基礎(chǔ)上加倍過(guò)硫酸銨和TEMED的使用量，可很好的解決膠凝結(jié)速度過(guò)慢的問(wèn)題。借鑒Tricine-SDS-PAGE中添加甘油或者尿素來(lái)提高分辨率的成功經(jīng)驗(yàn)，在普通的SDS-PAGE中加入約13%的甘油，同樣可以提高分辨率，有效防止小分子量蛋白的彌散。只要把原來(lái)配方中的水換成60%的甘油，就可以了。在分離膠中加尿素和甘油都可以，加上尿素和甘油改變膠的孔徑！特別是對(duì)分離糖蛋白的時(shí)候很有用處！一方面可以把條帶壓窄，減少拖尾現(xiàn)象的產(chǎn)生,另一方面對(duì)分離小分子量的蛋白有好處!一般加的量在0.53g尿素/12ml分離膠！自己可以跑來(lái)實(shí)驗(yàn)一下你跑9KD分子量的蛋白，建議用tricine-sds-page電泳來(lái)跑！也可以在分離膠中加尿素！以我經(jīng)驗(yàn)來(lái)看，加尿素會(huì)好于甘油！電泳在二液槽中安放鉑金絲電極；正極在下，負(fù)極在上。接通電源進(jìn)行電泳，電場(chǎng)強(qiáng)度10伏/厘米左右，視室溫高低而定。室溫較高時(shí)宜用較低的電壓以免發(fā)熱過(guò)度影響分離。蛋白質(zhì)向正極移動(dòng)。待染料前沿移動(dòng)至管底近處，停止電流。電泳時(shí)間為1-2小時(shí)。加入染色液后，先放入微波爐里加熱5-10秒，使染色液微熱即可（千萬(wàn)不要加熱太久，否則冰醋酸就揮發(fā)了）。然后放水平搖床上搖20分鐘，最多半小時(shí)就染好了。脫色也很簡(jiǎn)單，不用脫色液，直接用去離子水，放微波爐里煮沸5分鐘左右，然后將水倒掉，再換上新的去離子水煮，這樣反復(fù)幾次，就可以了。效果可能比正常的脫色稍差一點(diǎn)點(diǎn)，不如那樣清楚，只要電泳時(shí)比平時(shí)多上1/5的樣品就可以了，關(guān)鍵是這樣省時(shí)省材料（用不著含甲醇和冰醋酸的脫色液）。方便快捷！放心，反復(fù)煮膠不會(huì)把膠煮壞的。拍膠時(shí)的“黑十字”聚焦法！很多人用相機(jī)的微距聚焦都無(wú)法使識(shí)別框變綠，其實(shí)你只需要在膠所在的平面劃一個(gè)黑十字就可以很好的聚焦，尤其是western blot的圖，直接在膜的邊上劃就可以聚焦SDSPAGE的話(huà)可以找個(gè)顏色深東西放在膠的邊上就可以了，把鏡頭對(duì)準(zhǔn)它。SDS-PAGE注意事項(xiàng)1、膠凝的快慢不在于TEMED多少，在于APS的量，APS提供自由基，TEMED幫助自由基作用，是催化劑，對(duì)凝固速度影響不是太大，可以試試加大APS的量。2、下層也就是陽(yáng)極緩沖液的作用當(dāng)然是導(dǎo)電，用普通TRIS緩沖液做陽(yáng)極緩沖液，一樣跑得好，陰極就不一樣了，需要提供離子強(qiáng)度和SDS環(huán)境，而在電泳過(guò)程中，陰極緩沖液的一些離子損失，而且與樣品接觸，不適合再次使用。至于有些時(shí)候跑太大濃度的膠，因?yàn)樗幤?，BUFFER配制過(guò)程的一些問(wèn)題，導(dǎo)致會(huì)出現(xiàn)蛋白帶無(wú)法電泳到分離膠的最下方，膠跑得難看情況比較多，一般來(lái)說(shuō)，15%的膠已經(jīng)能夠跑出大約15 KDa左右的蛋白，對(duì)于普通SDS-PAGE已經(jīng)幾乎到了極限，還跑不出來(lái)的MARK帶，就不必去追究商品的問(wèn)題了。3、做SDS-PAGE的時(shí)候，除了蛋白量上樣一致，最好體積也一致，這樣跑出來(lái)的膠各個(gè)泳道之間的band能做到一樣寬，方便后面的比較，特別是WB。做法就是拿1X的上樣緩沖液補(bǔ)全要加的樣做到體積一致，否則跑出來(lái)會(huì)有的寬有的窄，特別是上樣體積相差較大的。SDS-PAGE問(wèn)題匯總Q：蛋白質(zhì)條帶為什么走到下面逐漸變寬發(fā)散？回答：多數(shù)情況是因?yàn)樾》肿釉谀z里的運(yùn)動(dòng)不規(guī)律，這種情況常發(fā)生在高濃度膠或凝固不一致的膠里，你可以加大陰極的緩沖液濃度，可能會(huì)有點(diǎn)改善。Q：在做蛋白表達(dá)的時(shí)候，包涵體的出現(xiàn)常常令大家頭疼不已， 現(xiàn)在給大家推薦鹽離子染SDS-PAGE的方法，這種方法簡(jiǎn)單快速還干凈，適合于切膠免疫的同學(xué)，具體操作就是把配好的0.5M的氯化鉀放在冰箱預(yù)冷，然后加在膠上慢慢晃動(dòng)，大約5分鐘就可以看見(jiàn)你的蛋白條帶，切膠回收后直接乳化免疫，不會(huì)有什么影響。如果無(wú)法識(shí)別，還可以再用實(shí)驗(yàn)室傳統(tǒng)的方法染色！Q：配膠緩沖液系統(tǒng)對(duì)電泳的影響？A：在SDSPAGE不連續(xù)電泳中，制膠緩沖液使用的是TrisHCl緩沖系統(tǒng)，濃縮膠是pH6.7，分離膠pH8.9；而電泳緩沖液使用的Tris甘氨酸緩沖系統(tǒng)。在濃縮膠中，其pH環(huán)境呈弱酸性，因此甘氨酸解離很少，其在電場(chǎng)的作用下，泳動(dòng)效率低；而Cl離子卻很高，兩者之間形成導(dǎo)電性較低的區(qū)帶，蛋白分子就介于二者之間泳動(dòng)。由于導(dǎo)電性與電場(chǎng)強(qiáng)度成反比，這一區(qū)帶便形成了 較高的電壓剃度，壓著蛋白質(zhì)分子聚集到一起，濃縮為一狹窄的區(qū)帶。當(dāng)樣品進(jìn)入分離膠后，由于膠中pH的增加，呈堿性，甘氨酸大量解離，泳動(dòng)速率增加，直接緊隨氯離子之后，同時(shí)由于分離膠孔徑的縮小，在電場(chǎng)的作用下，蛋白分子根據(jù)其固有的帶電性和分子大小進(jìn)行分離。所以，pH對(duì)整個(gè)反應(yīng)體系的影響是至關(guān)重要的，實(shí)驗(yàn)中在排除其他因素之后仍不能很好解決問(wèn)題的情況，應(yīng)首要考慮該因素。Q：樣品如何處理？A：根據(jù)樣品分離目的不同，主要有三種處理方法：還原SDS處理、非還原SDS處理、帶有烷基化作用的還原SDS處理。1、還原SDS處理：在上樣buffer中加入SDS和DTT（或-巰基乙醇）后，蛋白質(zhì)構(gòu)象被解離，電荷被中和，形成SDS與蛋白相結(jié)合的分子，在電泳中，只根據(jù)分子量來(lái)分離。一般電泳均按這種方式處理，樣品稀釋適當(dāng)濃度，加入上樣Buffer，離心，沸水煮5min，再離心加樣。2、帶有烷基化作用的還原SDS處理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并經(jīng)久牢固的保護(hù)SH基團(tuán)，得到較窄的譜帶；另碘乙酸胺可捕集過(guò)量的DTT，而防止銀染時(shí)的紋理現(xiàn)象。100ul樣品緩沖液中10ul 20的碘乙酸胺，并在室溫保溫30min。3、非還原SDS處理：生理體液、血清、尿素等樣品，一般只用1SDS沸水中煮3min，未加還原劑，因而蛋白折疊未被破壞，不可作為測(cè)定分子量來(lái)使用。Q：SDS-PAGE電泳凝膠中各主要成分的作用？A：聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺與為蛋白質(zhì)電泳提供載體，其凝固的好壞直接關(guān)系到電泳成功與否，與促凝劑及環(huán)境密切相關(guān)；制膠緩沖液：濃縮膠選擇pH6.7，分離膠選擇pH8.9，選擇trisHCl系統(tǒng)，具體作用后面介紹；TEMED與APS：促凝作用，加速聚丙烯酰胺的凝固；十二烷基硫酸鈉（SDS）：陰離子去污劑，作用有四：去蛋白質(zhì)電荷、解離蛋白質(zhì)之間的氫鍵、取消蛋白分子內(nèi)的疏水作用、去多肽折疊。Q：提高SDS-PAGE電泳分辨率的途徑？A：1、聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝膠的分辨率。建議做法：待凝膠在室溫凝固后，可在室溫下放置一段時(shí)間使用。忌即配即用或4 冰箱放置，前者易導(dǎo)致凝固不充分，后者可導(dǎo)致SDS結(jié)晶。一般凝膠可在室溫下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。2、一般常用的有氨基黑、考馬斯亮藍(lán)、銀染色三種染料，不同染料又各自不同的染色方法，具體可參照郭堯君編著的蛋白質(zhì)電泳技術(shù)手冊(cè)P82-103。Q：“微笑”（兩邊翹起中間凹下）形帶原因？A：主要是由于凝膠的中間部分凝固不均勻所致，多出現(xiàn)于較厚的凝膠中。處理辦法：待其充分凝固再作后續(xù)實(shí)驗(yàn)。Q：“皺眉”（兩邊向下中間鼓起）形帶原因？A：主要出現(xiàn)在蛋白質(zhì)垂直電泳槽中，一般是兩板之間的底部間隙氣泡未排除干凈。處理辦法：可在兩板間加入適量緩沖液，以排除氣泡。Q：為什么帶出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象？A：主要是樣品融解效果不佳或分