AnalyticalMethodDevelopmentandValidation 分析方法的建立和驗證28March2008 Outline總綱 HPLCMethodDevelopment高效液相方法建立HPLCTrouble shootingGuideHPLC問題解答MethodOptimization方法優化MethodValidation方法驗證SystemSuitabilityRequirements系統適應性要求GMP Mind set GMP理念 MethodDevelopment MethodClassification方法開發 分析方法分類 AssayMethod含量方法ImpurityProfile雜質情況 RelatedSubstances有關物質ChiralPurity手性純度ContentUniformity含量均一性DissolutionCleaningValidation清潔驗證Identity Fingerprint鑒別 指紋法 MethodDevelopment方法開發 UsefulInformation有用的信息 ChemicalstructureandMW化學結構和分子量Solventsolubility溶劑中的溶解度pKaandpHsolubility酸性解離常數和PH溶解度UVspectrum紫外光譜Processimpurities工藝雜質Possibledegradationimpurities可能的降解雜質LiteratureReferences參考文獻MSDS Materialsafetydatasheets安全數據表 MethodDevelopment方法開發 ResourcePlanning Gathering資源計劃收集 Solventsandreagents溶劑和試劑Placebomaterials安慰劑Individualformulationcomponents各個處方成分Relatedsubstancestandards有關物質標準品APIReferenceStandards活性成分標準品Acceleratedstresssample強降解樣品 MethodDevelopment方法開發 HPLCColumn色譜柱 Reversedphase C18 USPL1 C8 L7 反相 C18 USPL1 C8 L7 Normalphase Silica CN andNH2Silica CN andNH2Ion Exchange Dionexcolumn離子交換 DionexcolumnIonpairChromatography C18 C8 CN離子對色譜法 C18 C8 CNSizeExclusionChromatography排阻色譜法Chiralseparation手性分離 MethodDevelopment HPLCColumn cont 色譜柱 ColumnDimension 柱子的尺寸4 6mmx25cm4 6mmx15cm4 6mmx10cmParticleDiameter 粒徑10 m 5 m 3 5 m 1 8 mPoresize Surfacearea Endcapping孔徑 表面積 封尾 MethodDevelopment方法開發 HPLCColumn色譜柱 考考你 ParticleSize粒徑Length長度ExpectedN要求3 5 m5cm42003 5 m10cm 5 m25cm1200010 m25cm ParticleSize粒徑Length長度Resolution分離度3 5 m5cm1 53 5 m10cm MethodDevelopment方法開發 HPLCColumn cont 色譜柱 GuardColumn預柱ColumnWash柱子沖洗ColumnTemperature 35 C 60 C 柱溫 35 C 60 C ColumnStorage柱子的儲存 MethodDevelopment方法開發 HPLCcolumnselectionsummary色譜柱選擇 總結 C18Column firstchoiceC18柱 首選Shortlength 10cmor15cm短柱 10cmor15cmSmalldiameter 3 5 mor5 m小的粒徑 3 5 mor5 mEnd capped封尾 MethodDevelopment方法開發 HPLCMobilePhase流動相 Strongsolventcomponent 強溶劑組份Methanol甲醇Acetonitrile乙腈Tetrahydrofuran四氫呋喃Weaksolventcomponent 弱溶劑組份Water水Buffer緩沖液Dilutedacid 0 1 H3PO4 MethodDevelopment HPLCMobilePhase Buffer流動相 緩沖液 BufferSelectionPrinciple 緩沖液選擇原則ThepHofthemobilephasebuffershouldNOTbewithin 2pHunitsofthepKavaluesoftheanalytes 流動相緩沖液的pH值不應在樣品酸性解離常數值pH單位的 2范圍內Thisensuresreproducibleretentiontimesandgoodpeakshapes 這保證了保留時間的重復性和良好的峰形 MethodDevelopment HPLCMobilePhase Buffer流動相 緩沖液 Henderson HasselbalchEquation公式 pH pKa log A HA BuffersforuseinHPLCseparations 色譜分離使用的緩沖液BufferpKaBufferRangeUVCutoffPhosphate2 11 1 3 1 200nm磷酸鹽Acetate4 753 75 5 75210nm醋酸鹽Citrate3 12 1 4 1230nm檸檬酸鹽 MethodDevelopment方法開發 HPLCDetectors HPLC檢測器 UVabsorption紫外吸收Fixed wavelengthUVdetector固定波長紫外檢測器Variable wavelengthUVdetector可變波長紫外檢測器Photodiodearraydetector二極管陣列檢測器Fluorescencedetector熒光檢測器Massspectrometer LC MS 質譜儀 液質聯用 Electrochemicaldetector電化學檢測器Conductivitydetector電導率檢測器Evaporativelightscatteringdetector蒸發光散射檢測器 MethodDevelopment方法開發 HPLCUVDetectors紫外檢測器 MethodDevelopment OtherChromatographicConditions其它色譜條件 Flowrate流速 1 0 0 5mL minInjectionVolume進樣量 10 L 100 LSampletemperature樣品溫度 5 C roomtemperature室溫Isocraticvs Gradient等度VS 梯度 MethodDevelopment方法開發 InitialChromatographicConditionsInitial色譜條件 Column柱 WatersSymmetryC184 6mmx15cm 3 5 mColumntemperature柱溫 35 CSampletemperature樣品溫度 RoomTemperature室溫流動相MobilephaseA 0 1 H3PO4inwaterMobilephaseB 0 1 H3PO4inacetonitrile流速FlowRate 1 0mL min進樣量InjectionVolume 20 L檢測器Detector Photodiodearraydetector梯度GradientProfile 10 B 80 Bin60min HPLCTrouble shooting 高效液相問題解答 Sourcesofpeaktailing 拖尾的原因 pH問題pHissue問題柱子 柱床壞掉 Badcolumn packedbeddamaged 化學效應 與硅烷醇結合 Chemicaleffects interactwithsilanol 柱過載Columnoverloaded不正確的稀釋液Wrongdiluent 100 ACN 死體積Deadvolume溫度問題Temperatureissue等等etc HPLCTrouble shooting Sourcesofghostpeak 鬼峰的原因 Contaminatedsolution溶液受到污染Badreagents不合格的試劑Carry over殘留物DetectorCell檢測池 MethodOptimization方法優化 RegulatoryRequirements法規要求TechnicalRequirements技術要求PracticalRequirements實踐要求ValidationRequirements驗證要求 MethodOptimization Four S 方法優化 4S Simple簡 不復雜Short短 時 Sensitive靈敏Suitable適合 MethodDevelopment方法開發 methodoptimizationsample方法優化舉例 柱Column WatersSymmetryC184 6mmx25cm 5 m柱溫Columntemperature 20 C流動相MobilephaseA 0 01 HACinwater流動相MobilephaseB 0 01 HACinACN流速FlowRate 0 8mL min進樣量InjectionVolume 5 L檢測器Detector UVat203nm MethodDevelopment方法開發 methodoptimizationsample cont 方法優化舉例 梯度GradientProfile Time時間 MobilePhaseA B08020156535256535405743505743654258752575808020858020 MethodValidationProtocol方法驗證方案 Objective目的Responsibilities職責Reagents Standards試劑 標準物質Samples樣品Procedures程序Acceptancecriteria可接受標準 MethodValidation方法驗證 Accuracy Spikerecovery 準確度 加標回收率 Precision RSD 精密度 RSD Repeatability injectionprecision重復性 進樣精密度IntermediatePrecision within Lab中間精密度 同一實驗室范圍內Reproducibility betweenLabs重現性 不同實驗室之間 MethodValidation continued 方法驗證 Linearity fivelevels 線性 五個濃度水平 Range 50 to150 范圍 50 to150 Robustness耐用性 MethodValidation continued 方法驗證 Specificity專屬性LimitofDetection LOD 檢測限LimitofQuantitation LOQ 定量限SolutionStability etc 溶液穩定性 等等 MethodValidation APIAssaymethod方法驗證 原料藥含量測定 Day1Experiment第一天的試驗 Accuracy Precision LinearityandRangeforAssayofDrugSubstance API 原料藥含量分析的準確度 精密度 線性和范圍5levelsintherangeof50 to150 ofthenominalconcentration forexample 0 1mg mL 規定濃度 例如 0 1mg mL 50 至150 之間的5個濃度水平ByweighingthesoliddrugsubstanceorusingtheAPIStocksolution 1 0mg mL 通過稱量固體原料藥或使用其儲備液 1 0mg mL Repeattheaboveprocedure byweighingthesoliddrugsubstanceorusingasecondseparatelypreparedAPIStocksolution 重復以上程序 通過稱量固體原料藥或使用第二次另外制備的儲備液 Analyzeaspermethod preparetheworkingstandardsolutions etc 按照方法進行分析 制備標準品溶液 等等 MethodValidation API方法驗證 原料藥 Day2Experiment第二天的試驗 RepeattheDay1experiment twomoreindependentpreparations 重復第一天的試驗 重新進行兩次獨立的配制 Calculatethe Recoveryforeachsample計算每一個樣品的回收率Calculatethe RSDforeachlevel計算每個水平的RSDAssesstwolinearitycurvesforeachday Addedvs Found 評價每天的共兩個線性曲線 加標VS 測得值 MethodValidation APIAssay方法驗證 原料藥含量分析 AcceptanceCriteria可接受標準 Accuracy The Recoverymustbewithin98 0 to102 0 準確度 回收率98 0 to102 0 Precision RSDis 1 0 精密度 RSD 1 0 Linearity r 0 995foreachcurve線性 相關系數r 0 995 對每一個曲線 MethodValidation ImpuritiesofAPI方法驗證 原料藥的雜質 Day1Experiment第一天試驗 Accuracy Precision LinearityandRangeforImpurityEstimation 準確度 精密度 線性和范圍5levelsintherangeof0 05 w wto150 oftheknownimpurityspecification forexample 0 3 已知雜質限度 例如0 3 UsingtheAPIStocksolutionandtheimpuritystocksolutionforeachknowprocessimpurityanddegradates對每一個已知工藝雜質和降解雜質 使用原料藥儲備液和雜質儲備液Repeattheaboveprocedure usingasecondseparatelypreparedimpuritystocksolution 重復以上程序 使用另外一個單獨配制的雜質儲備液 Analyzeaspermethod preparetheworkingstandardsolutions etc 按照方法進行分析 制備工作標準品溶液 等等 MethodValidation APIImpurity方法驗證 原料藥的雜質 Day2Experiment第二天的試驗 RepeattheDay1experiment twomoreindependentpreparations 重復第一天的試驗 重新進行兩次獨立的配制 Calculatethe Recoveryforeachsample對于每個樣品 計算回收率Calculatethe RSDforeachlevel計算每個濃度水平的RSDAssesstwolinearitycurvesforeachday Addedvs Found 評價每一天共兩個線性曲線 加標VS 測得值 MethodValidation APIImpurity方法驗證 原料藥的雜質 AcceptanceCriteria可接受標準 Accuracy The Recoverymustbewithin70 to130 foreachimpurity準確度 對每個雜質 回收率應為70 to130 Precision RSDis 20 精密度 RSD 20 Linearity r 0 99foreachcurve線性 r 0 99 對每個曲線 MethodValidation DrugProduct方法驗證 制劑 Day1Experiment第一天的試驗 Accuracy Precision LinearityandRangeforAssayofDrugProduct 制劑含量分析的準確度 精密度和線性及范圍5levelsintherangeof50 to150 ofthenominalconcentration forexample 0 1mg mL 規定濃度 例如0 1mg mL 50 to150 范圍內5個水平ByweighingthesoliddrugsubstanceorusingtheAPIStocksolution 1 0mg mL 通過稱量固體原料藥或使用原料藥儲備液 1 0mg mL Addtheplaceboproductortheplacebostocksolutionaspertheformulation根據配方加安慰劑或安慰劑儲備液Repeattheaboveprocedure byweighingthesoliddrugsubstanceorusingasecondseparatelypreparedAPIStocksolution 重復以上程序 通過稱量固體原料藥或使用另外單獨配制的原料藥儲備液 Analyzeaspermethod preparetheworkingstandardsolutions etc 安裝方法分析 配制工作標準品溶液 等等 MethodValidation DrugProduct方法驗證 制劑 Day2Experiment第二天的試驗 RepeattheDay1experiment twomoreindependentpreparations 重復第一天的試驗 重新進行兩次獨立的配制 Calculatethe Recoveryforeachsample對每個樣品計算回收率Calculatethe RSDforeachlevel計算每個濃度水平的RSDAssesstwolinearitycurvesforeachday Addedvs Found 評價每天共兩個線性曲線 加標VS 測得值 MethodValidation DrugProduct方法驗證 制劑 AcceptanceCriteria可接受標準 Accuracy The Recoverymustbewithin97 0 to103 0 準確度 回收率應在97 0 to103 0 Precision RSDis 2 0 精密度 RSD 2 0 Linearity r 0 990foreachcurve線性 r 0 990 對每個曲線 MethodValidation 方法驗證 PurposefulStressing強降解 Light UV stressing controldarksample 紫外光降解 controldarksample Heatstressing 80 Cinanovenandanalyzedonaweeklybasisforuptoonemonth 加熱降解 置于80 C烘箱中 每周分析一次 共一個月的時間 Acid 1NHCl andbasehydrolysis 1NNaOH 酸 堿降解 1NHCl 和 1NNaOH Oxidationstressing氧化降解Desireddegradationby5 to15 level 降解5 to15 MethodValidation 方法驗證 RobustnessStudies耐用性研究 Mobilephasecomposition流動相組份FlowRate 10 流速 10 UVdetectorwavelength 5nm 紫外檢測波長 5nm Column sametype 3differentlots 柱 同型號 3個不同批號 ColumnTemperature 10 C 柱溫 10 C MethodValidation SamplePreparation樣品制備 Threelotsandduplicatepreparationforeachlot forbothAPIorproduct 三個批號的樣品 每批重復制備兩份 對原料藥和制劑 Sampleextraction mixingtime樣品提取 混合時間Filteradsorptionstudies過濾吸附研究Methodprecision sixduplicatepreparationsforthesamesample方法精密度 對同一個樣品 重復制備六份溶液 MethodValidation RelativeResponseFactor RRF 相對響應因子 RRF RRF AREAimpurity CONCimpurity AREAParent CONCParent RRF 雜質峰面積 雜質濃度 主峰面積 主成分濃度 SystemSuitability系統適應性 Resolution Rs 2 0 分離度 Rs 2 0 InjectionPrecision RSD 2 0 forHPLC 進樣精密度RSD 2 0 TailingFactor 2 5 拖尾因子 2 5 RRT RelativeRetentionTime 相對保留時間 SystemSuitability continued 系統適應性 LOQorReportingLimit 0 1 forProductor0 05 forAPI 定量限或報告限 制劑0 1 原料藥 0 05 ReferenceStandardCheck 98 0 to102 0 標準品檢查 98 0 to102 0 TheoreticalPlates etc 理論塔板數 等等 SystemSuitability Practicalguide系統適應性 實用指南 Samplesetmethod sequencetable樣品分析安排 進樣順序表 ForAssayandImpuritiesMethods針對含量和雜質檢查SampleID樣品號SampleName樣品名稱 Injections進樣次數12107001 01ABlank Diluent 212107001 03AReportLimitS