BD SMART RACE cDNA Amplification Kit User ManualTable of Contents內容頁碼I. 概要簡介II. 成分III. 另備物品IV. BD SMART RACE Amplification 基本原理V. 引物設計VI. Poly A+ RNA 和總RNA 的制備VII. cDNA 的第一鏈的合成VIII. PCR 陽性對照IX. cDNA末端的快速擴增(RACE)1X. RACE 產物鑒定XI. 疑難解答XII. 參考文獻XIII. 相關產品附錄A: 5-RACE 流程圖示附錄B: 3-RACE 流程圖示附錄C: Suppression PCR and Step-Out PCR 39I. 簡要概述II. 成分列表Control Human PlacentalTotal RNA 和 BD SMART II A Oligonucleotide在70C下保存。NucleoTrap Gel Extraction Kit 室溫下保存。其余試劑20C下保存。隨BD SMART RACE cDNA Amplification Kit 同時免費提供BD PowerScript Reverse Transcriptase和BD Advantage 2 PCR Kit。所有試劑可以滿足7 次cDNA 合成反應和30次PCR反應。First-strand cDNA 合成7l BD SMART II A Oligonucleotide (12 M)5AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG3 7l 3-RACE CDS Primer A (3-CDS; 12 M)5AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)30V N3(N = A, C, G, or T; V = A, G, or C) 7l 5-RACE CDS Primer (5-CDS; 12 M)5(T)25V N3 (N = A, C, G, or T; V = A, G, or C) 7l BD PowerScript Reverse Transcriptase 200 l 5X First-Strand Buffer250 mM Tris-HCl (pH 8.3)375 mM KCl30 mM MgCl2 200 l Dithiothreitol (DTT; 20 mM) 1ml Deionized H2O5- & 3-RACE PCR 400 l 10X Universal Primer A Mix (UPM)Long (0.4 M):5CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT3Short (2 M):5CTAATACGACTCACTATAGGGC3 50 l Nested Universal Primer A (NUP; 10 M)5AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT3Control Reagents 5l Control Human Placental Total RNA (1 g/l) 25 l Control 5-RACE TFR Primer (10 M) 25 l Control 3-RACE TFR Primer (10 M)General Reagents 70 l dNTP Mix (dATP, dCTP, dGTP, and dTTP, each at 10 mM) 2 X 1 ml Tricine-EDTA Buffer10 mM Tricine-KOH (pH 8.5)1.0 mM EDTANucleoTrap Gel Extraction Kit (Cat. No. 636053 or K3070-y) 100 l NucleoTrap Suspension 3 ml NT1 Buffer 10 ml NT2 Buffer 2ml NT3 Buffer User Manual (PT3169-1)Free trial-size BD Advantage 2 PCR Kit (Cat. No. 639207 or K1910-y)The BD Advantage 2 kit provides sufficient reagents for 30 PCR reactions.The following components are included: 30 l 50X BD Advantage 2 Polymerase Mix 200 l 10X BD Advantage 2 PCR Buffer 50 l 50X dNTP Mix (10 mM each) 30 l Control DNA Template (100 ng/l) 30 l Control Primer Mix (10 M each) 1 ml PCR-Grade Water User Manual (PT3281-1)III. 另備物品下列試劑需另外準備： 0.5-ml PCR 反應管，推薦使用 PerkinElmer GeneAmp 0.5-ml reaction tubes (Cat. No. N801-0737 or N801-0180). Mineral oil (e.g., Sigma Cat. No. M-3516)IV. BD SMART RACE的要點使用前請全面閱讀所有參數均經過優化，但可能因所使用的酶、模版、引物和熱循環儀而不同。因此應使用Control Human Placental Total RNA和Control 5- and 3- RACE TFR Primers進行預實驗。RACE PCR的效率取決于試驗樣品RNA中mRNA的豐度。另外退火溫度和延伸溫度也依引物不同而變化。請參照第X節的建議優化PCR的條件。在進行5-RACE and 3-RACE PCR時必須使用熱啟動。本手冊已經過優化，所使用的BD Advantage 2 Polymerase Mix中包含BD TaqStart 抗體用于自動進行PCR的熱啟動 (Kellogg et al., 1994)。也可以手動(DAquila et al., 1991).或使用蠟珠(Chou et al., 1992)來進行熱啟動。 推薦使用試劑盒中提供的Tricine-EDTA緩沖液稀釋和重懸DNA樣品。Tricine緩沖液在高溫下較Tris-based緩沖液有更好的緩沖能力。Trisbased 緩沖液會導致pH降低，引起DNA的降解。整個過程要戴手套以防核酸酶污染。 重懸過程（包括吸入和吹出溶液）要輕緩，短暫離心使所有成分聚集管底。 無特別標示，所有操作均應在冰上進行。 聚合酶在最后加入。 使用推薦的酶加入量，該量已經過特別的優化。 EB是致癌物質，小心處理和使用。V. 引物設計A. 引物序列特異引物(GSPs) 應當： 2328 個核苷酸 GC含量為 5070% Tm 大于或等于65C，如果Tm 70C可獲得最好的結果 (可使用降落PCR)。模版、引物及RACE產物如圖3所示。至少需要兩個特異引物才能進行完整的BD SMART RACE：即用于5-RACE PCR的反義引物和用于3-RACE PCR的正義引物。如果只進行5- 或3-RACE則只需一個特異引物。引物長度在2328個核苷酸，長于30個核苷酸沒有優勢。如圖3所示，兩種引物的5- and 3-RACE擴增產物存在部分重疊，如果在重疊區有一個合適的限制性酶切位點，可以通過酶切和連接反應可以得到cDNA的全長。將兩個引物設計成其RACE產物有100200-bp的重疊的形式，就能夠配合使用作為PCR反應的陽性對照。引物并非一定要設計成獲得重疊片斷的形式。對于大或稀有cDNAs，引物最好要設計的盡量靠近cDNA的末端，不產生重疊。此外，引物自身可以重疊（如互補）。特異引物GC含量為5070% ，其至少 65C。使用nearest neighbor 分析 (Freier et al., 1986; 我們使用Primer Premier軟件來計算Tms) Tm.應盡可能大于70C。根據我們的經驗，長引物的退火溫度高于70C特別從困難的樣品中可以得到強的RACE擴增。 Tms 超過70C 可以使用降落PCR。此外GSP1和GSP2設計成具有相似的Tm將更有利于使用。通過計算或試驗能夠得到GSP1和GSP2的Tms。要避免使用內部互補的引物或引物之間互補的引物，尤其在引物的3末端互補。注意：不要將酶切位點都合并到5和3特異引物的5末端，根據我們的經驗，這些額外的序列將會增加反應的背景。Figure 3. The relationship of gene-specific primers to the cDNA template. B. 引物在基因上的位置盡管我們使用BD SMART RACE Kit成功地得到了大于6.5 kb擴增產物，但為了使你的5-和3-RACE 產物達到2 kb，建議對引物加以篩選。C. 降落PCR我們發現降落PCR (Don et al., 1991; Roux, 1995)明顯增加BD SMART RACE擴增的特異性。降落PCR的退火溫度符合首次PCR循環的Tm 高于通用引物的Tm 。如果你的特異引物Tm，在這些循環中將只有與基因特異性結合的引物發生聚合，從而積累一定量的特定產物。退火溫度在隨后降低到與通用引物相配合的程度，引起特異性基因模版的指數和高效率的擴增。當你的引物的T m70C時我們推薦使用降落循環程序。 D. 巢式引物在首次試驗時，不要使用巢式PCR。混合的通用引物（UPM）和基因特異引物（GSP）通常能得到較好的低的非特異性背景的RACE產物。但是，巢式特異引物可以作為探針在鑒定RACE產物的Southern blotting中使用。 此外巢式PCR在使用特異引物進行5- or 3-RACE存在高背景或高非特異性擴增時有必要使用。在巢式PCR中，使用外側引物進行一個初步的擴增，如果擴增產物模糊不清，可以使用內部引物重新擴增初步產物的一部分。BD SMART RACE 指南包括了可選的步驟，指明了巢式引物能夠被使用的地方。本試劑盒提供的通用巢式引物A 可用于5- and 3-RACE。按照上述指南可以設計巢式特異引物。巢式引物與外側特異引物盡可能不重疊，如果因序列有限而必須重疊，其內部引物的3末端的序列也要盡可能唯一。VI.總RNA 和Poly A+ RNA的制備A. 總的預防影響cDNA合成質量的首要因素就是總RNA和poly A+ RNA的完整度和純度。下述預防措施可使你避免RNA的降解和污染。 戴手套 直接使用新鮮去離子水，沒有用DEPC 處理。. 用0.5 N NaOH漂洗所有的玻璃器皿，160180C烘烤49 hr. 使用一次性吸管吸頭.B. RNA 分離BD Biosciences Clontech 提供幾種試劑盒用于RNA分離和純化，如NucleoBond RNA/DNA Mini Kit (Cat. No. 635945)。C. RNA 分析推薦使用變性甲醛瓊脂糖電泳檢測RNA 樣品。哺乳動物的總RNA 展示為兩條4.5 和1.9 kb的帶，分別對應28S 和18S 核糖體RNA，它們之間的亮度比率約為12:1。哺乳動物的Poly A+ RNA 會產生0.512 kb 的彌散帶，亮度較核糖體RNA帶弱。Size distribution may be smaller with nonmammalian tissue sources.VII. cDNA 的第一鏈合成如下所述，兩個10-l的反應可以將50 ng1 g 總RNA 或poly A+RNA轉換成用于RACE的cDNA的第一鏈。我們推薦盡量使用poly A+ RNA。但是如果總RNA的量少于50 g，則不宜進行poly A+RNA 的純化，否則最終產量很小將會影響分析RNA數量和質量。為獲得最好的試驗結果，可以使用1 g 的poly A+ RNA或1 g 的總RNA 。我們強烈推薦使用包括Human Placental Total RNA 在內的試驗樣品進行陽性對照cDNA 的合成。該cDNA將會被用于陽性對照的RACE反應。1. 在0.5-ml 微型離心管中加入下列試劑：*取 1 l 的 Control Human Placental Total RNA (1 g/l)作為對照合成。2.加入消毒水至終體積為5 l 。3. 混合并在小型離心機上短暫離心。4. 70C 下溫育2 min。5. 迅速在冰上冷卻2 min。6. 短暫離心使成份聚集管底。7. 在每個反應管中再加入下列試劑（已有5 l體積）：2 l 5X First-Strand Buffer1 l DTT (20 mM)1 l dNTP Mix (10 mM)1 l BD PowerScript Reverse Transcriptase總體積為10 l8. 小心混合管內組分。.9. 短暫離心使成份聚集管底。10. 42C 下溫育1.5 hr。注意: 使用水浴或熱循環儀會由于蒸發作用而降低反應液的體積，由此降低第一鏈的合成效率。11. 使用Tricine-EDTA 緩沖液來稀釋反應產物： 如果以200 ng的總RNA開始反應，可加入100 l來稀釋。 如果以poly A+ RNA開始反應，可加入250 l 來稀釋。12. 72C下加熱管7 min。13.所得產品可以在20下保存3個月。 到此你已經得到了用于3- 和 5-RACE的cDNA 樣品。 這些產物的量足以用于后期的RACE反應，如果使用LD PCR 構建全長cDNA ，請在此留出足夠的產物用作膜板。VIII. PCR 的陽性對照試驗在用樣品cDNA進行5- 和3-RACE之前，我們強烈推薦使用來自于Control Human Placental 總RNA 的cDNAs進行陽性對照RACE PCR 反應。這些反應將會擴增鐵轉運蛋白受體(TFR) cDNA。該程序會為你確認BD SMART RACE的正確工作節省可觀的時間。將來一旦有問題出現，本對照試驗將有助于你確認問題是發生在RACE PCR（如不同的循環儀）還是 cDNA 。我們推薦使用提供的BD Advantage 2 Polymerase Mix進行首次BD SMART RACE PCR反應。如果你的cDNA的GC含量比較高，可以使用BD Advantage GC 2 Polymerase Mix (Cat. No.639114) 或 PCR Kit (Cat. Nos. 639119 & 639120)。 for subsequent analysis. Forapplications in which the highest fidelity product is desired, the BD AdvantageHF 2 PCR Kit (Cat. Nos. 639123 & 639124) can amplify templates up to 3.5 kb.For more information, see Section XI (Troubleshooting Guide).1. 為所有的PCR反應和1 個額外的反應準備足夠的主混合液。對于每個 50-l PCR反應，混合下列試劑：34.5 l PCR純度的水5 l 10X BD Advantage 2 PCR Buffer1 l dNTP Mix (10 mM; in BD SMART RACE 或BD Advantage 2 PCR Kit)1 l 50X BD Advantage 2 Polymerase Mix總體積為 41.5 l 2. 旋渦混合(無泡沫產生), 短暫離心。3. 按表2進行PCR反應的準備，按順序在0.5-ml PCR 管中加入各種成份，輕柔混合。4. 每管加入2滴礦物油覆蓋，加蓋。注意: 如果使用熱蓋循環儀則可以不用礦物油。5. 按下列程序啟動觸減式PCR6. 每樣取5 l在1.2 % 瓊脂糖凝膠上進行電泳分析。其余45 l 保存在 20C。理想的試驗結果 (泳道2 和 5 所示)： 5-RACE對照應當產生一條2.6-kb 帶，3-RACE對照反應應當產生一條 2.9-kb 帶。如果沒有觀察到這些帶出現，將各PCR反應管重新放回到循環儀中，再進行5次循環。如果仍然沒有期望的帶出現，參照第XI節的疑難解答。一定要在陽性對照反應能夠在42個或更少的循環次數內(5 cycles annealing at 72C + 5 cycles at 70C + 32 cycles at 68C).產生了很明顯的單條正確的產物帶之后再使用試驗引物和cDNA進行正式的試驗。 Figure 4. 5- and 3-RACE sample results. 本試驗使用總RNA進行RACE的反應結果：Lanes 1 & 4：干擾素受體Lanes 2 & 5: 鐵轉運蛋白受體Lanes 3 & 6: HPRT. 2和5道的RACE產物的大小為2.6 kb和2.9 kb。鐵轉運蛋白受體的3-.RACE （5道）會偶爾產生一條0.6-kb 的產物IX. cDNA 末端的快速擴增(RACE)本部分描述了利用5-RACE 和 3-RACE PCR 反應得到5 和 3 cDNA 片段. 正式試驗前請按照第八節所述進行陽性對照試驗。雖然隨盒提供了Nested Universal Primer A(NUP)，但在BD SMART RACE反應中不是一定要進行巢式PCR。所有的RACE PCR 反應都用BD Advantage 2 Polymerase Mix進行了最優化處理。1. PCR 反應混合液的準備：確保混合液體積足夠所有的PCR反應和一次額外的反應。該混合液用于5- 和 3-RACE 反應。對于50-l PCR 反應，所混合的成份如下：2. 旋渦混合(不要產生氣泡), 短暫離心。3. 對于 5-RACE: 按表III準備PCR反應；對于 3-RACE: 按表IV準備在0.5-ml PCR 管中按順序加入所有成份，輕柔混合。* 如果RNA是非人類的，可以跳過此步 如果特異引物不產生重疊可以跳過此步。有關對照反應的細節參照第XI節.* 如果RNA是非人類的，可以跳過此步 如果特異引物不產生重疊可以跳過此步。有關對照反應的細節參照第XI節.4. 每管內覆蓋2滴礦物油，加蓋。Note:.如使用熱蓋循環儀則不必加礦物油。5. 使用下列程序之一啟動循環儀， (programs 1 和 2 用于5- 和 3-RACE TFR和 UPM Primers的陽性對照)。依據所使用的是poly A+ 還是總RNA來選擇正確的循環次數。* 如果擴增的片段長度3 kb ，則每增加1 kb延長1 min。6. 可選 如果本次PCR 反應沒有產生目的帶或產生的是彌漫帶，可以用Southernblot 來驗證：a. A cDNA probeb. A nested primer as a probe或者，可以使用NUP 引物和 NGSP進行“巢式”PCR：a. 取上述PCR產物 5 l用245 l Tricine- EDTA緩沖液稀釋。b. 重復上述步驟15 ：用 5 l 稀釋過的初級PCR 產物代替用于RACE的cDNAs。 加入NUP 引物 1 l 、巢式特異引物 1 l 。 Program 2的循環為1520 次。X. RACE 產物的鑒定RACE 產物的鑒定使用3種方法： (A) 對比用GSPs 和 NGSPs得到的RACE產物； (B) Southern blotting；(C) 克隆和測序。 A 和 B 需要巢式引物。A. 對比用GSPs 和 NGSPs得到的RACE產物對于5-RACE 反應，將UPM Mix 和 GSP1 得到的初級擴增產物