pUC18 和 pUC19質粒圖譜pUC18 和 pUC19 大小只有 2686bp ，是最常用的質粒載體，其結構組成緊湊，幾乎不含多余的 DNA 片段，GenBank注冊號為 L08752（pUC18）和 X02514（pUC19）。由 pBR322 改造而來，其中 lacZ （MSC）來自 M13mp18/19 圖 3-4 是其質粒圖譜。這兩個質粒的結構幾乎是完全一樣的，只是多克隆位點的排列方向相反。這些質粒缺乏控制拷貝數的 rop 基因，因此其拷貝數達 500-700 。 pUC 系列載體含有一段 lacZ 蛋白氨基末端的部分編碼序列，在特定的受體細胞中可表現 -互補作用。因此在多克隆位點中插入了外源片段后，可通過 -互補作用形成的藍色和白色菌落篩選重組質粒。特征序列區位： pBR322_origin1471 - 852Ampicillin2486 - 1626lac_promoter543 - 514AmpR_promoter2556 - 2528M13_pUC_rev_primer500 - 478M13_reverse_primer479 - 461M13_forward20_primer379 - 395M13_pUC_fwd_primer364 - 386lacZ_a398 - 250pGEX_3_primer51 - 29Orf22486 - 1626NOS terminator sequence:ggatccatcgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttgtttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacacgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttactagtaatcgat設計引物：Forward primer: 5 ggaGGATCCggatccatcgttcaaac 3 (含BamH I 位點GGATCC及三個保護堿基)Reverse primer: 5 atcGAATTCATCGATTACTAGTAACATAG 3 (含EcoR I 位點GAATTC及三個保護堿基)請查一下NOS終止子序列內有沒有這兩個酶切點。如果沒有，引物合成后，以任何一種pCAMBIA為模板都能擴增到該終止子序列。一、質粒的基本特性1質粒的復制通常一個質粒含有一個與相應的順式作用控制要素結合在一起的復制起始區（整個遺傳單位定義為復制子）。在不同的質粒中，復制起始區的組成方式是不同的，有的可決定復制的方式，如滾環復制和 復制。在大腸桿菌中使用的大多數載體都帶有一個來源于 pMB1 質粒或 ColE1 質粒的復制起始位點。圖 3-1 是其復制其始示意圖。 在復制時，首先合成前 RNA ，即前引物，并與 DNA 形成雜交體；而后 RNase H 切割前 RNA ，使之成為成熟的 RNA ，并形成三葉草二級結構，該引物引導質粒的復制。形成的 RNA 可控制 RNA 形成二級結構，同時 Rop 增強 RNA 的作用，從而控制質粒的拷貝數。削弱 RNA 和 RNA 之間相互作用的突變，將增加帶有 pMB1 或（ColE1）復制子的拷貝數。 圖 3-1 帶 pMB1（或 ColE1） 復制起點的質粒在復制起始階段所產生的轉錄的方向及其粗略大小。2質粒的拷貝數質粒拷貝數分為嚴謹型與松馳型。嚴謹型質粒每個細胞中拷貝數有限，大約 1 幾個；松馳型質粒拷貝數較多，可達幾百。表 5-1 就是不同類的質粒與復制子及拷貝數的大致關系。表 3-1 ：質粒載體及其拷貝數質粒 復制子 拷貝數 pBR322 及其衍生質粒 pMB1 1520 pUC 系列質粒及其衍生質粒 突變的 pMB1 500700 pACYC 及其衍生質粒 p15A10212pSC101 及其衍生質粒pSC101 5 ColE1ColE11520pUC 系列質粒的復制單位來自質粒 pMB1 ，但其拷貝數較高。 pMB1 質粒的復制并不需要質粒編碼的功能蛋白，而是完全依靠宿主提供的半衰期較長的酶（DNA 聚合酶 ，DNA 聚合酶 ），依賴于 DNA 的 RNA 聚合酶，以及宿主基因 dnaB 、 dnaC 、 dnaD 和 danZ 的產物。因此，存在抑制蛋白質合成并阻斷細菌染色體復制的氯霉素或壯觀霉素等抗生素時，帶有 pMB1（或 ColE1） 復制子的質粒將繼續復制，最后每個細胞中可積聚 23 千個質粒。3質粒的不相容性兩個質粒在同一宿主中不能共存的現象稱質粒的不相容性，它是指在第二個質粒導入后，在不涉及 DNA 限制系統時出現的現象。不相容的質粒一般都利用同一復制系統，從而導致不能共存于同一宿主中。兩個不相容性質粒在同一個細胞中復制時，在分配到子細胞的過程中會競爭，隨機挑選，微小的差異最終被放大，從而導致在子細胞中只含有其中一種質粒。而不相容群指那些具有不相容性的質粒組成的一個群體，一般具有相同的復制子。在大腸桿菌中現已發現 30 多個不相容群，如 ColE1 和 pMB1 ， pSC101 和 p15A。4轉移性質粒具轉移性。它是指在自然條件下，很多質粒可以通過稱為細菌接合的作用轉移到新宿主內。它需要移動基因 mob ，轉移基因 tra ，順式因子 bom 及其內部的轉移缺口位點 nic。二、標記基因按其用途可將標記基因分為選擇標記基因和篩選標記基因。選擇標記用于鑒別目標 DNA （載體）的存在，將成功轉化了載體的宿主挑選出來，篩選標記可用于將特殊表型的重組子挑選出來。（一） 選擇標記抗生素抗性基因是目前使用最廣泛的選擇標記。1氨芐青霉素抗性基因（Ampicillin resistance gene, ampr）氨芐青霉素抗性基因是基因操作中使用最廣泛的選擇標記，絕大多數在大腸桿菌中克隆的質粒載體帶有該基因。青霉素可抑制細胞壁肽聚糖的合成，與有關的酶結合并抑制其活性，抑制轉肽反應。氨芐青霉素抗性基因編碼一個酶，該酶可分泌進入細菌的周質區，抑制轉肽反應并催化 -內酰胺環水解，從而解除了氨芐青霉素的毒性。青霉素是一類化合物的總稱，其分子結構由側鏈 R-CO- 和主核 6-氨基青霉烷酸（6-APA）兩部分組成。在 6-APA 中有一個飽和的噻唑環（A）和一個 -內酰胺環， 6-APA 為由 L- 半脫氨酸和纈氨酸縮合成的二肽。 2四環素抗性基因（Tetracycline resistance gene,tetr）四環素可與核糖體 30S 亞基的一種蛋白質結合，從而抑制核糖體的轉位。四環素抗性基因編碼一個由 399 個氨基酸組成的膜結合蛋白，可阻止四環素進入細胞。 pBR322 質粒除了帶有氨芐青霉素抗性基因外，還帶有四環素抗性基因。3氯霉素抗性基因（chloramphenicol resistance gene, Cmr, cat）氯霉素可與核糖體 50S 亞基結合并抑制蛋白質合成。目前使用的氯霉素抗性基因來源于轉導性 P1 噬菌體（也攜帶 Tn9）。cat 基因編碼氯霉素乙酰轉移酶，一個四聚體細胞質蛋白（每個亞基 23kDa）。在乙酰輔酶 A 存在的條件下，該蛋白催化氯霉素形成氯霉素羥乙酰氧基衍生物，使之不能與核糖體結合。4卡那霉素和新霉素抗性基因（kanamycin/neomycin resistance gene, kanr, neor）卡那霉素和新霉素是一種脫氧鏈霉胺氮基糖苷，都可與核糖體結合并抑制蛋白質合成。 卡那霉素和新霉素抗性基因實際就是一種編碼氨基糖苷磷酸轉移酶（APH（3）-, 25kDa）的基因，氨基糖苷磷酸轉移酶可使這兩種抗生素磷酸化，從而干擾了它們向細胞內的主動轉移。在細胞中合成的這種酶可以分泌至外周質腔，保護宿主不受這些抗生素的影響。5琥珀突變抑制基因 supF在基因的編碼區中，若某個密碼子發生突變后變成終止密碼子，則稱這樣的突變為赭石突變（突變為 UAA），或琥珀突變（突變為 UAG），或乳白突變（突變為 UGA）。 supF 基因編碼細菌的抑制性 tRNA ，可在 UAG 密碼子上編譯酪氨酸。如果在某一宿主中含具琥珀突變的 tetr 基因和 ampr 基因，只有當宿主含有 supF 基因時才會對 Amp 和 Tet 具有抗性。相應的， supE 基因在 UAG 密碼子上編譯谷氨酰氨。由于目前所用的標記基因使用方便，因此用這類標記的載體較少。6其它還有一些正向選擇標記，表達一種使某些宿主菌致死的基因產物，而含有外源基因片段插入后，該基因便失活。如蔗糖致死基因 SacB ，來自淀粉水解芽胞桿菌 （Bacillus amyloliquefaciens） ，編碼果聚糖蔗糖酶。在含蔗糖的培養基上 sacB 基因的表達對大腸桿菌來說是致死的，因此該基因可用于插入失活篩選重組子。（二）篩選標記篩選標記主要用來區別重組質粒與非重組質粒，當一個外源 DNA 片段插入到一個質粒載體上時，可通過該標記來篩選插入了外源片段的質粒，即重組質粒。1-互補（-complementation）-互補是指 lacZ 基因上缺失近操縱基因區段的突變體與帶有完整的近操縱基因區段的 -半乳糖苷酶（ -galactosidase ，由 1024 個氨基酸組成）陰性的突變體之間實現互補。-互補是基于在兩個不同的缺陷 -半乳糖苷酶之間可實現功能互補而建立的。大腸桿菌的乳糖 lac 操縱子中的 lacZ 基因編碼 -半乳糖苷酶，如果 lacZ 基因發生突變，則不能合成有活性的 -半乳糖苷酶。例如， lacZM15 基因是缺失了編碼 -半乳糖苷酶中第 11-41 個氨基酸的 lacZ 基因，無酶學活性。對于只編碼 N-端 140 個氨基酸的 lacZ 基因 （稱為 lacZ） ，其產物也沒有酶學活性。但這兩個無酶學活性的產物混合在一起時，可恢復 -半乳糖苷酶的活性，實現基因內互補。在 lacZ 編碼區上游插入一小段 DNA 片段（如 51 個堿基對的多克隆位點），不影響 -半乳糖苷酶的功能內互補。但是，若在該 DNA 小片段中再插入一個片段，將幾乎不可避免地導致產生無-互補能力的 -半乳糖苷酶片段。利用這一互補性質，可用于篩選在載體上插入了外源片段的重組質粒。在相應的載體系統中，lacZM15 放在 F 質粒上, 隨宿主傳代； lacZ 放在載體上, 作為篩選標記 （圖 3-2） 。相應的受體菌有 JM 系列、 TG1 和 XL1-Blue ，前二者均帶有 D （lac - proAB）F proAB + lacIq lacZD M15 基因型。其中 lacI 為 lac 阻抑物的編碼基因，lacIq 突變使阻抑物產量增加，防止 lacZ 基因滲漏表達。lacZ 基因是乳糖 lac 操縱子中編碼 -半乳糖苷酶的基因，乳糖及其衍生物可誘導其表達。 乳糖既是 lac 操縱子的誘導物，也是作用的底物。異丙基-D- 硫代半乳糖苷（IPTG）是乳糖的衍生物，可作為 lac 操縱子的誘導物，但不能作為反應的底物； 5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷（X-gal） 可作為 lac 操縱子的底物，但不能作為誘導物。底物 X-gal 還可充作生色劑，被 -半乳糖苷酶分解后可產生蘭色產物，可使菌落或噬菌斑呈蘭色。 2插入失活通過插入失活進行篩選的質粒主要有 pBR322 ，該質粒具有四環素抗性基因（tetr）和氨芐青霉素抗性基因（ampr）兩種抗性標記。當外源 DNA 片段插入 tetr 基因后，導致 tetr 基因失活，變成只對氨芐青霉素有抗性。這樣就可通過對抗生素是雙抗還是單抗來篩選是否有外源片段插入到載體中。三、質粒載體的種類（一）克隆載體克隆載體主要用于擴增或保存 DNA 片段，是最簡單的載體。1pBR322pBR322 質粒的大小為 4361bp ， GenBank 注冊號為 V0lll9 和 J01749 ，含有 30 多個單一位點，具有四環素抗性基因（tetr）和氨芐青霉素抗性基因（ampr），其質粒復制區來自 pMB1 （如圖 3-3）。目前使用廣泛的多質粒載體幾乎都是由此發展而來的。利用四環素抗性基因內部的 BamH 位點來插入外源 DNA 片段，可通過插入失活進行篩選。2pUC18 和 pUC19pUC18 和 pUC19 大小只有 2686bp ，是最常用的質粒載體，其結構組成緊湊，幾乎不含多余的 DNA 片段，GenBank注冊號為 L08752（pUC18）和 X02514（pUC19）。由 pBR322 改造而來，其中 lacZ （MSC） 來自 M13mp18/19 圖 3-4 是其質粒圖譜。這兩個質粒的結構幾乎是完全一樣 的，只是多克隆位點的排列方向相反。這些質粒缺乏控制拷貝數的 rop 基因，因此其拷貝數達 500-700 。 pUC 系列載體含有一段 lacZ 蛋白氨基末端的部分編碼序列，在特定的受體細胞中可表現 -互補作用。因此在多克隆位點中插入了外源片段后，可通過 -互補作用形成的藍色和白色菌落篩選重組質粒。圖 3-4 ： pUC18/19 質粒圖譜3pUC118 和 pUC 119由 pUC18/19 增加了一些功能片段改造而來，大小為 3162bp ， GenBank 注冊號為 U07649（pUC118）和 U07650（pUC119）。相當于在 pUC18/19 中增加了帶有 M13 噬菌體 DNA 合成的起始與終止以及包裝進入噬菌體顆粒所必需的順式序列。4pGEM-3Z/4ZpGEM-3Z/