腎臟的外緣彎彎地向外凸出。內緣又彎彎地向內凹陷這個地方稱做腎門。血管、神經、淋巴管、輸尿管都由這里(腎門)進出腎臟。其排列順序為：腎靜脈在前、腎動脈居中、輸尿管在后，該處合稱為腎蒂。腎門向腎內延續為由腎實質圍成的腎竇，竇內含有腎動脈、腎靜脈的主要分支和屬支、腎小盞、腎大盞、腎盂和脂肪組織等。腎的構造可以分為被膜和腎實質兩部分以及雙腎頂部的腎上腺。腎的被膜自內向外可分為三層： （1）纖維膜：為貼于腎實質表面的一層結締組織膜，薄而堅韌，由致密結締組織和少數彈力纖維構成。在正常狀態下，容易與腎實質剝離。但在某些病理情況下，由于與腎實質粘連，而不易剝離。 （2）腎臟外面披著一層厚厚的黃色外衣，是由脂肪構成的稱做腎脂肪囊，起著固定、保護腎臟的作用。 （3）腎筋膜：位于脂肪囊的外面，由腹膜外組織發育而來。腎筋膜分前后兩層，包繞腎和腎上腺。向上向外側兩層互相融合。向下兩層互相分離，其間有輸尿管通過。腎筋膜向內側，前層延至腹主動脈和下腔靜脈的前面，與大血管周圍的結締組織及對側腎筋膜前層相續連；后層與腰大肌筋膜相融全。自腎筋膜深面還發出許多結締組織小束，穿過脂肪囊連至纖維膜，對腎起固定作用。腎的內部結構又分兩部分，周圍稱皮質，深部為髓質。 腎的解剖生理單位稱為腎單位，由腎小球和腎小管組成。每個腎約有130萬個腎單位。在正常情況下，腎單位交替地進行活動，因此腎具有很大的儲備代償能力。 腎小球由毛細血管叢和腎球囊構成，是血漿濾過的器官。腎小球毛細血管壁分3層，中間為基底膜，內側有內皮細胞覆蓋，外側為臟層上皮細胞。毛細血管基底膜厚約320nm，可分為三層，中間為致密層，內側和外側各為內疏松層和外疏松層。毛細血管基底膜內面由一層扁平的內皮細胞覆蓋。內皮細胞胞漿很薄，布滿許多直徑約70100nm的小孔。臟層上皮細胞（又稱足細胞）在基底膜外側，胞漿豐富形成許多細長的分枝狀突起稱為足突。上皮細胞由這些足突附著于基底膜外疏松層。足突之間形成許多間隙，寬約2030nm，稱為濾過隙。距基底膜表面約60nm，在相鄰的足突之間有一層薄膜稱為濾過隙膜。毛細血管壁包括內皮細胞、基底膜、上皮細胞，共同組成腎小球的濾過膜。腎小球的濾過除與毛細血管的結構和濾過物質的分子大小有關外，并與基底膜的生物化學組成及其電荷有關。基底膜主要由型膠原和一些糖蛋白如層連蛋白、纖維連接蛋白和多聚陰離子多糖蛋白等組成。其中尤其是硫酸類肝素多糖蛋白帶大量負電荷分布于內、外疏松層。此外，在毛細血管內皮細胞和臟層上皮細胞表面也有帶負電荷的唾液酸糖蛋白。腎小球的負電荷可阻止血液中帶負電荷的分子如白蛋白濾過。當腎小球多聚陰離子減少時濾過的蛋白質可增加。 在腎小球毛細血管之間有少量組織支持毛細血管網，并將毛細血管聯系在一起，稱為腎小球系膜，由系膜細胞和系膜基質組成。系膜基質充填在各葉毛細血管之間。系膜細胞散在于系膜基質內。系膜細胞有收縮功能，可參與調節腎小球毛細血管的血流。系膜細胞還具有吞噬功能，可吞噬進入腎小球的大分子物質。系膜細胞可產生血管活性物質、細胞因子和生長因子，并可產生系膜基質和膠原纖維，對清除腎小球濾過的物質以及與腎小球炎癥和損傷時的增生和修復都有重要關系。各位戰友好：本人把大鼠原代腎小管上皮細胞的取材、培養方法進行了總結，請分享！取材：1.腎小管節段的分離(機械網篩濾過法)：取 Wistar 大鼠斷頸法處死，立即置入碘伏液中浸泡 5 分鐘。將大鼠轉移入超凈工作臺，取腰部切口迅速取出腎臟，置于盛有生理鹽水的培養皿中清洗并除去包膜和腎蒂組織。取皮質置于80目篩網上，剪碎成1-2mm3大小組織塊，網下放盛有少量生理鹽水的培養皿。用玻璃注射器內芯于80目網上充分研磨組織。收集 80 目網下液體轉移至 100 網篩上，用生理鹽水沖洗。將100目網上組織用生理鹽水沖洗入另一培養皿中，收集置入離心管中。1500 轉/分鐘離心5分鐘，棄去上清。2 腎小管節段的消化及培養用1.5ml 0.25%胰蛋白酶重懸沉淀，37溫箱中消化約10分鐘。加入3ml(雙倍量)含有10%胎牛血清RPMI1640中止消化，1500 轉/分離心8分鐘，棄上清。加入約3ml RPMI1640 懸浮沉淀，并用吸管充分吹打混勻，接種于培養瓶中。分離腎小管節段接種于培養瓶后，第一天加入少量培養基，置入37,5%CO2孵育箱中靜置培養。培養過夜后，第二天加入足量的培養基，靜置培養。培養 72 小時后首次換液，以后每兩天換液一次。約第六到七天細胞生長基本融合成單層。 （縮略圖，點擊圖片鏈接看原圖） 能否介紹下 這張圖片 screen.width-333)this.width=screen.width-333 width=639 height=551 title=Click to view full 7777777.jpg (639 X 551) border=0 align=absmiddle 通過嚴格的腎皮質取材、研磨、篩網分離，可以將腎小球結構濾過而使腎小球上皮細胞與腎小管上皮細胞分開，同時也使成纖維細胞和腎間質細胞與腎小管充分分離，僅保留腎小管節段(收集物中腎小管節段純度可達90%以上)，達到純化的目的。然后使用胰蛋白酶對腎小管節段進行消化，由于胰蛋白酶對腎小管節段的損傷是可逆的，經過一定時間的修復傳代后，細胞能繼續保持其正常形態和功能。本圖片就是篩網法結合酶消化法，取的腎小管節段在200倍倒置顯微鏡下的照片，請分享！ （縮略圖，點擊圖片鏈接看原圖） 這種培養屬于腎小管節段釋放細胞法，我們可以從圖片中可以看出，模糊的結構就是腎小管節段，周圍為釋放的腎小管上皮細胞，形狀為多邊鵝卵石狀。 （縮略圖，點擊圖片鏈接看原圖） 是否 發帖 滯后？出現了重復帖！把所有帖全集中到此帖。對腎小管上皮細胞的鑒定主要采用免疫組化法，主要根據腎小管上皮細胞胞漿中特異表達角化蛋白ck-18而利用抗角化蛋白抗體進行鑒定 screen.width-333)this.width=screen.width-333 width=483 height=385 title=Click to view full 10145046.jpg (483 X 385) border=0 align=absmiddle 原代大鼠腎小管上皮細胞的形態呈鵝卵石鋪路狀！ screen.width-333)this.width=screen.width-333 width=442 height=336 title=Click to view full 腎小管上皮細胞的形態.jpg (442 X 336) border=0 align=absmiddle 照片好呀好詳細 he很好請問，腎臟方面的研究你做有 哪些實驗。阿霉素腎病大鼠模型，以及細胞的選擇培養？ 我也在做腎小管上皮細胞的原代，請教：我是用80gSD大鼠做的，貼壁效果不好，請問您的Wistar 大鼠是多大的？另外分離腎皮質的具體方法是怎樣？謝謝！ 家兔腎臟內髓集合管細胞的分離與原代培養 文章來源： 2006-7-19 18:23:04 家兔腎臟內髓集合管細胞的分離與原代培養中國應用生理學雜志 2000年第1期第16卷 技術方法作者：夏前明黃堅肖貞良錢桂生單位：夏前明肖貞良(成都軍區總醫院呼吸科，成都610083)；黃堅錢桂生(第三軍醫大學新橋醫院呼吸研究所，重慶400037)關鍵詞：家兔；腎臟；內髓集合管細胞；細胞培養摘要 目的：為了分離、培養腎臟內髓集合管（IMCD）細胞。方法：本 文采用膠原酶消化和低滲溶解等步驟分離家兔腎臟加IMCD細胞；分離的細胞置DMEMF 12培養基、37、5CO2的空氣環境中培養；經透射電鏡和角蛋白抗體免疫細胞化學等 鑒定。結果：幾乎所有的培養細胞均被染為棕黃色；電鏡觀察培養的細胞核 大，呈圓形或橢圓形。胞漿少，細胞器少見。細胞膜表面存在許多短而粗的微絨毛。與天然 的IMCD細胞的形態和免疫細胞化學特征相符。結論：本文培養的細胞為家 兔腎臟IMCD細胞。中圖分類號：R3334文獻標識碼：B文 章編號：1000-6834(2000)01-0092-04ISOLATION AND PRIMARY CULTURE OF INNER MEDULLARY COLLECTING DUCT CELLS FROM RABBIT KIDNEYXIA Qian-ming1, HUANG Jian2, XIAO Zhen-liang1， QIAN Gui -sheng2(2.Institute of Respiratory Medicine, Xinqiao Hospital, Th ird Military Medical University, Chongqing 400037;1.Department of Resp iratoty Medicine, Chengdu Army General Hospital, Chengdu 610083)ABSTRACTAim: To isolate and culture inner medullary collectig duct(IMCD) cells f rom kidney.Methods: The measures of collagenase incubation and h ypotonic lysis were adopted to isolate IMCD cells from rabbit kidney. The isolat ed cells were cultured with DMEM/F12 medium under 37, 5%CO2/95% air atmosph ere. The primary cultured cells were identified with the immmunocytochemistry of monoclone antibody against keratin and transmission electron. Results:Light brown positive staining of monoclone antibody against keratin presents almost all cultured cells. Transmission electron micrograph shows that the cell has a large round or oval nucleus and very light cytoplasm that is almost devoi d of organelles, and many small stubby microvilli are present on the cell membra ne. which are compatible with the native IMCD cell. Conclosion:The p rimary cultured cell in this study, is IMCD cell of rabbit kidney.KEY WORDS: rabbit kidney;inner medullary collecti ng duct cell; cell culture內髓集合管(IMCD)是哺乳動物腎小管的最后一段。IMCD的結構中主要包含間質細 胞、血管內皮細胞、血細胞、髓袢薄部細胞、直管細胞和IMCD細胞等幾種細胞，而直接參 與滲透平衡和酸堿平衡調節的是IMCD細胞1。1978年，Grenier和Smith首先成功 地分離、培養出IMCD細胞，為體外利用IMCD細胞進行細胞生物學及細胞病理學研究開辟了 道路。近20年來，許多學者致力于IMCD細胞培養的研究，分離、培養方法逐漸完善，但國內 迄今尚未見有IMCD細胞培養的研究報告。為此，我們嘗試進行家兔腎臟IMCD細胞分離、培養 ，為利用培養的IMCD細胞進行有關的研究奠定基礎。1材料與方法1.1材料一月齡新西蘭大白兔，購自第三軍醫大學實驗動物中心，體重350400 g，雌雄不拘。DNa se I、膠原酶、HEPES為美國Sigma公司產品，DMEM/F12為美國Gibco公司產品，小牛血清 購自華西醫科大學。鏈霉菌抗生物素蛋白一過氧化酶免疫組化染色試劑盒為福州邁新公司產 品。其余試劑為國產分析純商品。青霉素、鏈霉素和乙醚為國產醫用藥品。1.2IMCD細胞的分離主要參照Husted等的方法2，加以改進而成，主要步驟如 下：家兔用乙醚麻醉，無菌開腹取腎，剪取腎乳頭內側約1 mm寬的組織塊，在生理溶液中反 復剪碎后，吸入無菌試管內，室溫下28 g離心5 min，棄上清。沉淀加入01膠原酶溶 液2ml混勻，5CO2、37孵育。每隔15 min用吸頭抽吸混勻一次，共孵育90120 mim 。取出試管加2倍體積的001DNase 溶液低滲溶解非IMCD細胞，輕輕搖勻。5CO2、 37孵育。每15 min用吸頭抽吸混勻一次，共孵育4560min。消化好的細胞懸液經100目 不銹鋼篩網過濾。濾液室溫下112 g離心5 min，棄上清。分別用10 ml生理溶液和10 ml小牛 血清溶液洗滌兩次。細胞沉淀用20 ml培養液懸浮，IMCD細胞的分離過程完成。1.3細胞活性檢測取9滴細胞懸液滴入另一清潔試管，加04臺盼藍1滴染色23 min，以細胞核拒染作為 活性良好細胞。取1滴已染色的細胞懸液滴入血細胞計數板，倒置顯微鏡下觀察，可見有2 3個細胞相連形成弧形，也有10多個細胞相連的腎小管節段。鏡下觀察拒染率95，細胞 純度95。1.4IMCD細胞的種植與培養用培養液將分離一只家兔腎臟所得的IMCD細胞稀釋成20105/ml的細胞懸液，按5102 ml接 種于75 cm2玻璃培養瓶，放入CO2恒溫孵箱(37、5CO2)靜置培養。一般于第35 d約有的6080的IMCD細胞貼壁，故常于第4 d首次更換培養液，以后每23 d換液一 次，710 d IMCD細胞融合成細胞單層。1.5上皮細胞角蛋白免疫組化用福州邁新公司的鏈霉菌抗生物素蛋白一過氧化酶免疫組化染色試劑盒進行，細胞被染成棕 黃色者為陽性。1.6透射電鏡觀察將培養的IMCD細胞收集在一個離心管內，離心成團，棄上清，按15的比例直接向離心管 內加入3戊二醛固定液，以后按常規方法制樣觀察。2結果2.1上皮細胞角蛋白免疫組化 Fig.1 Immunocytochemical microg raph of the primary cultured IMCD cell of the rabbitLight brown positive staining of anti-keratin monoclone antibody in c ell membrane, cytoplasm,and nuclear membrane(200)2.2透射電鏡觀察 Fig.2 Transmission electron micro graph of primary cultured IMCD cell of the rabbitThe cell has a large round or oval nucleus() and very light cytoplas m that is almost devoid of organelles（8000）2.3膠原酶孵育最佳時間(見右表1)2.4離心力對IMCD細胞分離效果的影響(見右表2)3討論由于IMCD細胞所處的環境特別， IMCD細胞具有幾個顯著的特點： (1)細胞體積大， 多 大于10 m;(2)對滲透壓變化適應范圍寬，低于200 mosmol/L或高于2 000 mosmol/L都能耐 受；(3)對氧的需求不高，PO2可低至133 kPa。因而，IMCD細胞的分離方法主要圍繞這些 特點設計的，大致可分為低滲溶解非IMCD細胞和等滲離心沉淀IMCD細胞兩類。Grenier和Smi th首創IMCD細胞原代培養即采用低滲溶解法，但該法使用胰蛋白酶消化細胞，對IMCD細胞的 損 傷較大。Stokes等則采用等滲離心法以避免低滲對IMCD細胞的可能損傷，但此法低速離心時 ，離心力僅為28 g，一些IMCD細胞不能沉淀下來，使細胞收獲量明顯減少。Nonaka用等滲組 織塊培養進一步簡化操作，我們亦用此法分離培養IMCD細胞，發現細胞純度稍差。Husted等 用顯微取材法分離末段IMCD細胞2，是目前較為理想的IMCD細胞分離方法。我們 參照 Husted等的方法分離培養家免腎臟IMCD細胞。倒置顯微鏡觀察培養的細胞融合時，呈 多角形，可見半囊。細胞核大居中，圓形或橢圓形。透射電鏡顯示培養的細胞核大居中，圓 形或橢圓形。胞漿內細胞器相對較少，可見散在的線粒體。細胞膜上可見微絨毛。抗角蛋白 抗體免疫組化染色使幾乎所有的培養細胞都呈陽性反應。這些結果與文獻報道的天然IMCD 細胞特征相符24，說明我們培養的細胞為IMCD細胞。 Fig.3 Transmission electron mic rograph of primary cultured IMCD cell of the rabbit.Many small stubby microvilli are present on the cell membrane (）（ 15000)Tab.1 Optimal incubation time of collag enaseTime(min)IMCD cell(105/ml)3041*6084*901121201381509718065* Tissue masses were observed with naked eyes Tab.2 Effect of centrafugal force on I MCD cellsCentrafugal force(g)IMCD cell (105/ml)non-IMCD cell(%)2834-56762112984252128114478316要達到膠原酶消化法的較好效果，關鍵的因素是控制離心力和膠原酶的消化時間。消 化酶的作用時間與酶的種類、單一酶或幾種酶復合消化、孵育溫度及pH等因素有關。我們用 01膠原酶、pH 7.4、37孵育的結果顯示，90120 min效果較好，既無肉眼可見的組 織塊，又無明顯的IMCD細胞破壞。我們的結果還顯示，當離心力為28 g，無雜細胞，但IMCD 細胞產量較少；當離心力為252 g，細胞產量有所增加，但有雜細胞摻入；離心力為447 g， 細胞產量反而減少，可能是離心力過大，使IMCD細胞破壞。因此，分離IMCD細胞，離心力 最好控制在112 g,細胞的產量和純度均較理想。分離細胞達到比較滿意的產量后，如何保證細胞的純度則是另一個突出的問題。除了上 述適當離心力的措施外，還根據IMCD細胞的特性采取低滲溶解非IMCD細胞。有實驗表明通過 加入2倍體積的蒸餾水，持續45 min，即可完全溶解非IMCD細胞，從而達到純化IMCD 細胞的目的2。我們采用低滲溶解非IMCD細胞，并加用DNase降解DNA。不同 的孵育時間顯示，孵育45 min后即無粘性帶出現。通過此處理，我們分離的IMCD細胞純度 多在95以上。臺盼藍染色結果顯示拒染率多在95以上。故加入低滲DNase溶液的孵育時 間以孵育4560 min為宜。其原因可能是隨著非IMCD細胞的破裂，釋放 出大量的基因組DN A,形成一些粘性帶，粘附部分IMCD細胞，使IMCD細胞的產量減少。加用DNase降解DNA ，就能減少基因組DNA粘性帶所造成的IMCD細胞損失。IMCD細胞必須貼壁后才能生長、增殖、細胞數量增加，因而，細胞貼壁是細胞培養成功 的標志。影響細胞貼壁的因素很多，參考有關文獻，我們采取的主要措施包括：(1)選擇1月 齡家兔作供體；(2)DMEMF12混合培養基加10小牛血清；(3)接種后絕對靜置培養4 d ，首次換液時才移動培養瓶。實驗結果較為滿意，說明這些措施對家兔IMCD細胞培養是合適 的。其原因可能是：(1)1月齡家兔供體細胞年齡較輕，相對容易培養；(2)小牛血清中含有 促細胞貼壁成分，同時，不必另外處理培養瓶而簡化操作；(3)接種后頻繁移動培養瓶，或 較早換液，均可影響細胞貼壁。而靜置培養4天，絕大多數分離細胞都能貼壁。作者簡介：夏前明，（1955-），男，四川瀘州人，副主任醫師，博 士，從事呼吸系統疾病的基礎與臨床研究我主要是參照 諶貽璞，高進，邢寶才，等. 腎小球系膜細胞培養. 北京醫科大學學報，1989，21：335的方法做的,培養成功了,不過,中間也遇到了好多問題.談幾點我個人的體會:1.我用的是體重100g左右的SD大鼠,用了兩只大鼠,接種了1瓶細胞(25cm2)。 不過接種的瓶數要根據收獲細胞的數量來決定。2.很多文獻報道用腎臟灌洗法獲得的細胞較純，容易養活。我也試驗過這個方法，不過系膜細胞原代培養的步驟本來就挺煩瑣，再加上灌洗，增加了工作量，增加了污染機會，操作也挺不方便。后來我就沒用。不過有條件的實驗室可以試驗一下。3.取腎的過程盡可能快，但要保證無菌。取出的腎臟要始終保持在D-Hanks液或培養液中，即使在剝離腎包膜，切取腎皮質的過程中也要注意不時滴些D-Hanks液或培養液。4.過篩時，我是把三層網篩上下重疊（按由上到下150，80，200目的順序），坐落于一個無菌玻璃皿或小燒杯上。將剪碎的腎組織移至最上層網上，用玻璃注射器的針芯在上面輕輕碾壓，不斷用PBS或D-Hanks液沖洗網篩，直到把幾乎所有的組織都碾過網篩。然后把最上層網去掉，沖洗第二層網篩，再去第二層網篩，徹底沖洗第三層網篩，因為我們需要的腎小球細胞就在這層網上，所