藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術指導原則一、概述刺激性、過敏性、溶血性是指藥物制劑經皮膚、粘膜、腔道、血管等非口服途徑給藥，對用藥局部產生的毒性（如刺激性和局部過敏性等）和/或對全身產生的毒性（如全身過敏性和溶血性等），為臨床前安全性評價的組成部分。藥物的原形及其代謝物、輔料、有關物質及理化性質（如pH值、滲透壓等）均有可能引起刺激性和/或過敏性和/或溶血性的發生，因此藥物在臨床應用前應研究其制劑在給藥部位使用后引起的局部和/或全身毒性，以提示臨床應用時可能出現的毒性反應、毒性靶器官、安全范圍。本指導原則適用于中藥、天然藥物、化學藥物。二、基本原則（一）試驗管理根據藥品注冊管理辦法，藥物刺激性、過敏性和溶血性研究必須執行藥物非臨床研究質量管理規范（GLP）。（二）隨機、對照、重復試驗設計應遵循隨機、對照、重復的原則。（三）整體性、綜合性原則應根據受試物特點，充分考慮和結合藥學、藥效學、其他毒理學及擬臨床應用情況等綜合評價，體現整體性、綜合性的原則。（四）具體問題具體分析應在遵循安全性評價普遍規律的基礎上，具體問題具體分析，結合受試物的特點，在闡明其研究方法或技術科學、合理的前提下進行規范性試驗，對試驗結果進行全面分析評價。三、基本內容（一）受試物和實驗動物1受試物中藥、天然藥物：受試物應能充分代表臨床試驗樣品或上市藥品。應采用工藝路線及關鍵工藝參數確定后的工藝制備，一般應為中試或中試以上規模的樣品，否則應有充分的理由。應注明受試物的名稱、來源、批號、含量（或規格）、保存條件及配制方法等，由于中藥的特殊性，建議現用現配，否則應提供數據支持配制后受試物的質量穩定性及均勻性。試驗中所用溶媒和/或輔料應標明名稱、標準、批號、規格及生產單位。化學藥物：受試物應采用工藝相對穩定、純度和雜質含量能反映臨床試驗擬用樣品和/或上市樣品質量和安全性的樣品。受試物應注明名稱、來源、批號、含量（或規格）、保存條件及配制方法等，并附有研制單位的自檢報告。試驗中所用輔料、溶媒等應標明批號、規格和生產單位，并符合試驗要求。在藥品研發的過程中，若受試物的工藝發生可能影響其安全性的變化，應進行相應的安全性研究。化學藥物試驗過程中應進行受試物樣品分析，并提供樣品分析報告。成分基本清楚的中藥、天然藥物也應進行受試物樣品分析。2實驗動物動物應符合國家有關規定的等級要求，并具有實驗動物質量合格證。動物種屬的選擇根據觀察指標和模型合理性確定，如刺激性試驗應選擇與人類皮膚、粘膜等反應比較相近的動物，如兔、小型豬等。（二）刺激性試驗刺激性是指非口服給藥制劑給藥后對給藥部位產生的可逆性炎癥反應，若給藥部位產生了不可逆性的組織損傷則稱為腐蝕性。刺激性試驗是觀察動物的血管、肌肉、皮膚、粘膜等部位接觸受試物后是否引起紅腫、充血、滲出、變性或壞死等局部反應。1給藥部位一般應選擇與臨床給藥相似的部位，并觀察對可能接觸到受試物的周圍組織的影響。2給藥途徑一般應與臨床用藥途徑一致，否則應加以說明。3對照組 以溶媒和/或賦形劑作為陰性對照，必要時采用已上市制劑作對照。4給藥濃度、劑量與體積可選擇幾種不同濃度，至少應包括臨床擬用最高濃度。如果技術上難以達到臨床擬用最高濃度，如皮膚刺激性試驗，在給藥面積不變的情況下，可通過改變給藥頻次進行劑量調整，而不應通過增加厚度來達到增加給藥量的目的。設計給藥濃度、劑量與體積時，應根據臨床用藥情況，并考慮受試動物給藥部位的解剖和生理特點，保證受試物在給藥部位的有效暴露。5給藥頻率與周期應根據臨床用藥情況，一般給藥周期最長不超過4周。建議進行恢復期觀察，同時評價給藥局部及周圍組織毒性反應的可逆性。6觀察指標6.1 肉眼觀察 應詳細描述局部反應，包括紅斑、水腫、充血程度及范圍，計分表示。同時觀察動物的一般狀態、行為、體征等。6.2 組織病理學檢查 應詳細描述給藥部位的病理變化，并半定量分析、判斷。提供相應的組織病理學照片。7試驗方法具體可參考附錄中常用方法和相關文獻。8統計方法根據實驗模型和試驗方法選擇合適的統計方法。（三）過敏性試驗過敏性又稱超敏反應，指機體受同一抗原再刺激后產生的一種表現為組織損傷或生理功能紊亂的特異性免疫反應。過敏性試驗是觀察動物接觸受試物后的全身或局部過敏反應。1試驗方法進行何種過敏性試驗應根據藥物特點、臨床適應癥、給藥方式、過敏反應發生機制、影響因素等確定。通常局部給藥發揮全身作用的藥物（如注射劑和透皮吸收劑等）需考察型過敏反應，如注射劑需進行主動全身過敏試驗（Active Systemic Anaphylaxis, ASA）和被動皮膚過敏試驗（Passive Cutaneous Anaphylaxis, PCA），透皮吸收劑需進行主動皮膚過敏試驗（Active Cutaneous Anaphylaxis, ACA）。吸入途徑藥物應采用豚鼠吸入誘導和刺激試驗。粘膜給藥應結合受試物的特點參照經皮給藥過敏性試驗方法進行。如受試物的化學結構與文獻報道產生其他過敏反應的化合物相同或相似者建議考慮采取適當的試驗方法以考察其是否能引起其他過敏反應（如光過敏性反應等）。和型過敏反應可結合在重復給藥毒性試驗中觀察，如癥狀、體征、血液系統、免疫系統及相關的病理組織學改變等。經皮給藥制劑（包括透皮劑）應進行IV型過敏反應試驗，包括豚鼠最大化試驗（Guinea-Pig Maximization Test, GPMT）或豚鼠封閉斑貼試驗（BuehlerTest）或其他合理的試驗方法如小鼠局部淋巴結試驗（Murine Local Lymph Node Assay, LLNA）等。2劑量設計建議選擇多個劑量，至少應包括臨床最高給藥濃度。3對照組應設立陽性對照組和陰性對照組，必要時采用已上市制劑作對照。4統計方法根據實驗模型和試驗方法選擇合適的統計方法。（四）溶血性試驗溶血性是指藥物制劑引起的溶血和紅細胞凝聚等反應。溶血性反應包括免疫性溶血與非免疫性溶血。溶血性試驗是觀察受試物是否能夠引起溶血和紅細胞凝聚等。1. 適用范圍凡是注射劑和可能引起免疫性溶血或非免疫性溶血反應的其他局部用藥制劑均應進行溶血性試驗。2. 試驗方法溶血試驗包括體外試驗和體內試驗，常規采用體外試管法評價藥物的溶血性，若結果為陽性，應與相同給藥途徑的上市制劑進行比較研究，必要時進行動物體內試驗或結合重復給藥毒性試驗，應注意觀察溶血反應的有關指標（如網織紅細胞、紅細胞數、膽紅素、尿蛋白，腎臟、脾臟、肝臟繼發性改變等），如出現溶血時，應進行進一步研究。（五）光毒性（光刺激性）試驗光敏反應是用藥后皮膚對光線產生的不良反應，包括光毒性反應和光過敏反應，均由受試物所含的感光物質引起，產生光敏反應需同時滿足以下條件：吸收自然光線（波長范圍為290700nm），吸收UV/可見光后產生活性物質，在光暴露組織（如皮膚，眼睛等）有充分的暴露。光毒性是由光誘導的非免疫性的皮膚對光的反應，是指藥物吸收的光能量在皮膚中釋放導致皮膚損傷的作用。光毒性反應是光敏反應中最常見的一種反應，其臨床表現與曬傷相似，表現為紅斑、水腫、皮膚瘙癢和色素沉著，嚴重者可產生局部壞死、潰爛或表皮脫落。皮膚給藥光毒性試驗的目的是觀察受試物接觸皮膚或應用后遇光照射是否有光毒性反應。若受試物的化學結構或某些組成（包括藥物和賦形劑）文獻報道有光毒性作用，或其化學結構與已知光敏劑相似，或曾有報道其具有或可疑具有光毒性作用，建議進行皮膚給藥光毒性試驗。四、結果分析與評價（一）詳細說明實驗方法，受試物、試驗分組、給藥劑量、動物數、用藥次數、毒性反應、持續時間、恢復情況及時間、死亡動物數等，對不同劑量（或濃度）下某種反應發生情況及嚴重程度進行表述，分析毒性反應的量效關系和可能的時效關系及可逆性，判斷藥物相關性，提供安全范圍等。（二）刺激性試驗應重視給藥濃度、體積、速度、次數與有效暴露時間對結果的影響。注射劑的給藥濃度、速度及次數與藥物的血管刺激性密切相關，建議根據受試物的性質、臨床用藥情況，采用適當的方法，盡最大可能地暴露毒性，如可適當增加濃度，或通過增加給藥次數等。過敏試驗應注意給藥劑量和給藥速度對過敏反應的影響，靜脈注射激發應保證足量、一次性快速地將受試物注射入動物體內。經皮給藥的受試物應保證在局部的有效暴露濃度和時間。（三）重視組織病理學檢查，并提供相應的照片。（四）由于實驗動物模型的局限性，如目前仍無理想的和型過敏反應的動物模型；光過敏性動物模型的臨床意義尚不明確等，因此一些藥物的過敏性臨床前評價可采取靈活的方式，建議采用多種方法如BT、小鼠局部淋巴結試驗等。（五）在溶血性試驗中，若出現紅細胞凝聚現象，應判定是真凝聚還是假凝聚。若體外出現可疑溶血現象，應采用其他方法進一步試驗，以確定或排除受試物的溶血作用。利用分光光度法進行溶血性試驗時，應注意離心速度及溫度對結果的影響。此外，因不同的注射劑顏色及深淺不同，若其色澤對血紅素的最大吸收有干擾，則應注意排除非藥物因素。（六）結合藥物的制劑特點、藥理作用其他毒理學試驗結果、以及臨床信息等綜合分析和評價。五、參考文獻1FDA Guidance for Industry Skin irritation and sensitization testing of generic transdermal drug products2FDA Guidance for Industry Photosafety testing3FDA Guidance for Industry Immunotoxicology evaluation of investigation new drug4. EPA Health effects test guidelines OPPTS 870.7800 Immunotoxicity5EPA Health effects test guidelines OPPTS 870.2500 Acute dermal irritation6EPA Health effects test guidelines OPPTS 870.2600 Skin sensitization7OECD Guidelines for Testing of Chemicals (No 406, July 1992)8EPA Health effects test guidelines OPPTS 870.2400 Acute eye irritation9EMA Non-clinical local tolerance testing of medicinal products10ISO 10993-10:2002(E) Biological evaluation of medical devices- Part 10- Tests for irritation and delayed-type hypersensitivity11日本厚生省日本新藥毒性試驗指導原則 1989版12中華人民共和國衛生部藥政局 新藥（西藥）臨床及臨床前研究指導原則匯編13徐叔云 卞如濂 陳修 藥理實驗方法學14陳奇 中藥藥理研究方法學15皮膚用藥的毒性試驗和粘膜用藥的毒性試驗. 中華人民共和國衛生部藥政管理局 中藥新藥研究指南1994年209，21316袁伯俊 王治喬 皮膚用藥毒性試驗. 新藥臨床前安全性評價與實踐 北京：軍事醫學科學出版社，1997年 15217劉建文 其他毒性試驗. 藥理實驗方法學第三版. 北京：人民衛生出版社，2002年 23418. Principles and methods of Toxicology. Fourth edition, edited by A. Wallace Hayes, Taylor & Francis, Philadelphia. 2001.19. EMA；Note for Guidance on Non-clinical Local Tolerance Testing of Medicinal Products.20FDA；Guidance for Industry Botanical Drug Products21FDA；Guidance for Industry Labeling Guidance for OTC Topical Drug Products for the Treatment of Vaginal Yeast Infections (Vulvovaginal Candidiasis) 22. FDA；Guidance for Industry Bacterial Vaginosis - Developing Antimicrobial Drugs for Treatment23Preclinical Development Hand Book-Toxicology. Edited by Shayne Cox Gad, Copyright 2008 by John Wiley & Sons, Inc六、附錄本附錄收載的試驗方法僅供參考。應根據受試物的特點采用國內外公認的科學合理的試驗方法，不僅限于此附錄。（一）刺激性試驗方法1血管刺激性試驗通常選兔，每組不少于3只。設生理鹽水和/或溶媒對照，可采用同體左右側自身對比法。給藥部位根據臨床擬用途徑確定，一般選用耳緣靜脈。可設多個給藥濃度，至少包括臨床最大擬用濃度，給藥容積、速率和期限一般根據臨床擬用法用量，并根據動物情況進行調整，給藥體積不可太低。多次給藥時間一般不超過7天。根據受試藥物的特點和刺激性反應情況選擇觀察時間和剖檢時間，至少觀察72小時。應對部分動物進行組織病理學檢查。恢復期動物根據受試物的特點和刺激性反應情況，繼續觀察1421天進行組織病理學檢查。根據肉眼觀察和組織病理學檢查結果綜合判斷受試物的血管刺激性及刺激性恢復情況。2. 肌肉刺激性試驗通常選兔，也可選用大鼠。每組不少于3只。應設生理鹽水對照或/和溶媒對照組，可采用同體左右側自身對比法。根據受試物的特點和刺激性反應情況選擇觀察時間, 觀察期結束時應對部分動物進行組織病理學檢查。分別在左右兩側股四頭肌內注射給藥，觀察給藥后不同時間的局部反應，如充血、紅腫等。給藥后4872小時剖檢觀察注射局部的刺激反應，按表1計算相應的反應級，并進行局部組織病理學檢查，提供病理照片。根據表1計算肌肉刺激性總反應級，計算平均值，按表2判定刺激等級。若各股四頭肌反應級的最高與最低之差大于2，應另取動物重新試驗。表1 肌肉刺激反應分級標準刺激反應反應級無明顯變化0輕度充血，范圍在0.51.0cm以下1中度充血，范圍在0.51.0cm以上2重度充血，伴有肌肉變性3出現壞死，有褐色變性4出現廣泛性壞死5表2 平均分值和等級平均分值等級0.00.4無0.51.4輕微1.52.4輕度2.53.4中度3.54.4重度4.5及以上嚴重3皮膚刺激性試驗通常選兔、小型豬，否則應闡明合理性。兔每組不低于4只。一般應進行相同備皮面積的正常皮膚和破損皮膚局部刺激性試驗。采用同體左右側自身對比法，將受試物直接涂于備皮處，敷料覆蓋固定。貼敷時間至少4小時。多次給藥皮膚刺激性試驗應連續在同一部位給藥，每次給藥時間相同，給藥期限一般不超過4周。破損皮膚試驗中皮膚破損程度以損傷表皮層為限。在自然光線或全光譜燈光下肉眼觀察皮膚反應。根據受試物的特點和刺激性反應情況選擇觀察時間。通常單次給藥皮膚刺激性試驗觀察時間點為去除藥物后3060分鐘，24、48和72小時。多次給藥皮膚刺激性試驗，為每次去除藥物后1小時以及每次給藥前，以及末次貼敷去除藥物后3060分鐘，24、48和72小時。如存在持久性損傷，有必要延長觀察期限以評價恢復情況和時間，延長期一般不超過2周。對出現中度及中度以上皮膚刺激性的動物應在觀察期結束時進行組織病理學檢查，并提供病理照片。單次給藥皮膚刺激性試驗，計算各組每一時間點皮膚反應積分的平均值，按表3進行刺激強度評價。多次給藥皮膚刺激性試驗，首先計算每一觀察時間點各組積分均值，然后計算觀察期限內每天每只動物刺激積分均值，按表4進行刺激強度評價。表3 皮膚刺激反應評分標準刺激反應分值紅 斑無紅斑0輕度紅斑（勉強可見）1中度紅斑（明顯可見）2重度紅斑3紫紅色紅斑到輕度焦痂形成4水 腫無水腫0輕度水腫（勉強可見）1中度水腫（明顯隆起）2重度水腫（皮膚隆起1mm，輪廓清楚）3嚴重水腫（皮膚隆起1mm以上并有擴大）4最高總分值8表4 皮膚刺激強度評價標準分 值評 價00.49無刺激性0.52.99輕度刺激性3.05.99中度刺激性6.08.00重度刺激性4. 粘膜刺激性試驗4.1 眼刺激性試驗通常選兔，每組不少于3只。應設生理鹽水對照組，可采用同體左右側自身對比法。動物眼睛滴入受試物，保證藥物充分暴露。給藥期限應根據臨床擬用方法確定。多次給藥時每天給藥次數應不少于臨床用藥頻率。 應根據受試物的特點和刺激性反應選擇適當的觀察時間。通常單次給藥為給藥后1、2、4、24、48和72小時；多次給藥眼刺激試驗為每天給藥前以及最后一次給藥后1、2、4、24、48和72小時。如存在持久性損傷，有必要延長觀察期限，一般不超過21天。一般采用裂隙燈進行眼刺激反應檢查，也可根據刺激性反應情況采用其他的合適器械。在整個觀察過程中應進行熒光素鈉染色檢查。每次檢查都應記錄眼部異常反應，根據表5計算分值。根據表6判斷刺激程度。表5 眼刺激反應分值標準眼刺激反應分值角 膜無混濁0散在或彌漫性混濁，虹膜清晰可見1半透明區易分辨，虹膜模糊不清2出現灰白色半透明區，虹膜細節不清，瞳孔大小勉強可見3角膜不透明，虹膜無法辨認4虹 膜正常0皺褶明顯加深、充血、腫脹，角膜周圍輕度充血，瞳孔對光仍有反應1出血/肉眼可見壞死/對光無反應（或其中一種）2結 膜充血（指瞼結膜和球結膜）血管正常0血管充血呈鮮紅色1血管充血呈深紅色，血管不易分辨2彌漫性充血呈紫紅色3水 腫無水腫0輕微水腫（含眼瞼）1明顯水腫伴部分眼瞼外翻2水腫至眼瞼近半閉合3水腫至眼瞼超過半閉合4分泌物無分泌物0少量分泌物1分泌物使眼瞼和睫毛潮濕或粘著2分泌物使整個眼區潮濕或粘著3最大總積分16表6 眼刺激性評價標準分值評價03無刺激性48輕度刺激性912中度刺激性1316重度刺激性4.2 滴鼻劑和吸入劑刺激性試驗可選用兔、豚鼠或大鼠。給藥后觀察動物全身狀況（如呼吸、循環、中樞神經系統）及局部刺激癥狀（如哮喘、咳嗽、嘔吐、窒息等癥狀）等。單次給藥24小時后或多次給藥停藥后24小時處死動物，觀察呼吸道局部（鼻、喉、氣管、支氣管）粘膜組織有無充血、紅腫等現象，并進行病理組織學檢查。4.3 陰道刺激性試驗通常選用大鼠、兔或犬。給藥容積可參考臨床擬用情況或不同動物種屬的最大給藥量。給藥頻率根據臨床應用情況，通常每天12次，至少7天，每次給藥與粘膜接觸至少4小時。觀察內容：陰道部位、臨床表現（如疼痛癥狀）和陰道分泌物（如血、粘液）等，給藥后動物死亡和剖檢結果，局部組織有無充血、水腫等現象，并進行陰道和生殖系統病理組織學檢查等。4.4 直腸刺激性試驗通常選兔或犬。給藥容積可參考臨床擬用情況或不同動物種屬的最大可行量。給藥頻率根據臨床擬用情況，通常每天12次，至少7天，每次給藥與粘膜接觸至少24小時，必要時可封閉一定時間。觀察內容：包括肛門區域和肛門括約肌，給藥后臨床表現（如疼痛癥狀）和糞便（如血、粘液），給藥后死亡和剖檢結果，局部組織有無充血、水腫等現象，并進行肛周組織的病理組織學檢查。4.5 口腔用藥、滴耳劑等刺激性試驗可參照上述試驗，給藥途徑為口腔、外耳道給藥，觀察對口腔和喉粘膜，以及對外耳道和鼓膜等的影響。口腔用藥建議用金黃倉鼠，觀察受試物對頰粘膜的刺激性。5皮膚給藥光毒性試驗成年白色豚鼠，雌雄各半。每組動物數至少6只。應設陰性、陽性對照組和受試物不同劑量組，至少包括臨床用藥濃度。試驗前動物備皮涂敷藥物。給藥30分鐘后覆蓋固定，UV光源照射（UVA波長為320-400nm，如含UVB，其劑量不得超過0.1J/cm2）。試驗結束后分別于1、24、48和72h觀察皮膚反應，根據表7計算評分。單純涂受試物而未經照射區域未出現皮膚反應，而涂受試物后經照射的區域出現皮膚反應分值之和2的動物數1只時，判為受試物具有光毒性。表7 皮膚反應的評分標準紅斑和焦痂形成分值水腫形成分值無紅斑0無水腫0非常輕的紅斑，勉強可見1非常輕度水腫，勉強可見1明顯的紅斑2輕度水腫（邊緣清晰）2中度至重度的紅斑3中度水腫（皮膚隆起約1mm）3重度紅斑（鮮紅色）至輕度焦痂形成（深層損傷）4重度水腫（皮膚隆起大于1mm，并超過涂受試物的區域）4（二）過敏性試驗方法1主動全身過敏試驗（ASA）通常選用體重為300400克的豚鼠。每組動物數至少6只。設陰性、陽性對照組和受試物不同劑量組，至少包括臨床擬用最高劑量或濃度。陰性對照組給予同體積的溶媒，陽性對照組給予牛血清白蛋白或卵白蛋白或已知致敏陽性物質。選擇容易產生抗體的給藥途徑，如腹腔、靜脈或皮下注射，隔日一次，共給藥3次，給藥體積0.5 ml，末次注射后第14天、第21天分別快速靜脈注射致敏劑量的2倍進行攻擊。即刻觀察動物反應至30分鐘，包括癥狀的出現及消失時間，一般應觀察3小時。致敏期間每日觀察動物的癥狀，首末次致敏和激發當日測定動物體重。按表9判斷過敏反應發生程度，計算發生率。表8 過敏反應癥狀0 正常7 呼吸急促14 步態不穩1 不安寧8 排尿15 跳躍2 豎毛9 排糞16 喘息3 發抖10 流淚17 痙攣4 搔鼻11 呼吸困難18 旋轉5 噴嚏12 哮鳴音19 潮式呼吸6 咳嗽13 紫癜20 死亡表9 全身致敏性評價標準0-過敏反應陰性14癥狀+過敏反應弱陽性510癥狀+過敏反應陽性1119癥狀+過敏反應強陽性20+過敏反應極強陽性2主動皮膚過敏試驗（ACA）通常選豚鼠。受試物應與臨床擬用制劑一致，應為含活性成分和賦形劑或含透皮促進劑的混合制劑。若受試物為膏劑或液體，則一般不稀釋；若受試物為固體粉末，則需與適量水或賦形劑混勻，以保證受試物與皮膚的良好接觸。當使用賦形劑時，應考慮其對受試物透皮吸收的影響。應設陽性對照和陰性或賦形劑對照。在致敏接觸階段，應充分保證受試物在皮膚的停留時間（6小時）和接觸皮膚的范圍。第0、第7和第14天，同樣方法給藥。末次給藥后14天，再次給藥激發，給藥6小時左右后，觀察72小時內皮膚過敏反應情況，并按表10評分，按表11計算發生率。同時應觀察動物是否有哮喘、站立不穩或休克等全身過敏反應。表10 皮膚過敏反應程度的評分標準皮膚過敏反應分值紅斑無紅斑0輕度紅斑，勉強可見1中度紅斑，明顯可見2重度紅斑3紫紅色紅斑到輕度焦痂形成4水腫無水腫0輕度水腫，勉強可見1中度水腫，明顯可見（邊緣高出周圍皮膚）2重度水腫，皮膚隆起1mm，輪廓清楚3嚴重水腫，皮膚隆起1mm以上或有水泡或破潰4最高總分值8表11 皮膚致敏性評價標準致敏發生率（%）皮膚致敏性評價010無致敏性1130輕度致敏性 3160中度致敏性6180高度致敏性81100極度致敏性3被動皮膚過敏試驗（PCA）通常選大鼠，可用小鼠，有時根據試驗需要用豚鼠，選擇動物時應考慮IgE的出現時間。每組動物數至少6只。應設立陰性、陽性對照組和受試物不同劑量組，至少包括臨床擬用最大劑量或濃度。陰性對照組應給予同體積的溶媒，陽性對照組給予牛血清白蛋白或卵白蛋白或已知致敏陽性物質。選擇容易產生抗體的給藥方法，如靜脈、腹腔或皮下注射等，隔日一次，共給藥35次；末次致敏后第1014天制備致敏血清。激發時動物備皮處皮內注射合適稀釋度的致敏血清0.1mL，24或48小時后，靜脈注射與致敏劑量相同的激發抗原加等量的0.5%1%伊文思蘭染料共1mL。由于不同種屬動物接受含IgE抗體血清后，至能夠應答抗原攻擊產生過敏反應的時間不同，需注意激發時間選擇的合理性。激發注射30分鐘后測量皮膚內層的斑點大小，直徑大于5mm者為陽性。不規則斑點的直徑為長徑與短徑之和的一半，并提供藍斑照片。4豚鼠Buehler試驗（BT）和最大化試驗（GPMT）通常選成年豚鼠。受試物組不少于20只、對照組不少于10只。應設立陰性對照組和陽性對照組。推薦的陽性對照物有巰基苯并噻唑，苯佐卡因，二硝基氯苯，331環氧樹脂等，也可以使用其他的陽性對照物，但輕中度的致敏劑在加佐劑的試驗中至少30%和不加佐劑試驗中至少15%應有反應。取決于所選擇的方法。在Buehler試驗中，致敏劑量應當足夠高，以產生輕微的刺激性，激發劑量為不產生刺激性的最