ICS67.120.30

B50

DB21

遼寧省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB21/XXXXX—XXXX

遼寧省蜱種鑒定技術(shù)規(guī)范

TechnicalspecificationfortickspeciesidentificationinLiaoningProvince

（報(bào)批稿）

本稿完成日期：2022年11月

XXXX-XX-XX發(fā)布XXXX-XX-XX實(shí)施

遼寧省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布

DB21/XXXXX—XXXX

遼寧省常見蜱種鑒定技術(shù)規(guī)范

1范圍

本文件規(guī)定了遼寧省常見的5種蜱，即長(zhǎng)角血蜱（Haemaphysalislongicornis）、嗜群血蜱（(Haemaphysalis

concinna）、日本血蜱（Haemaphysalisjaponica）、森林革蜱（Dermacentorsilvarum）、全溝硬蜱（Ixodes

persulcatus）的采集、保存、形態(tài)學(xué)鑒定以及DNA條形碼鑒定技術(shù)。本文件適用于遼寧省蜱的種類鑒

定，可輔助應(yīng)用于相關(guān)蜱傳病的監(jiān)測(cè)與防控。其中形態(tài)學(xué)鑒定最適用于形態(tài)完整且未飽血的成蜱；DNA

條形碼技術(shù)適用于任何形態(tài)及不同發(fā)育階段的蜱，包括殘損蜱、飽血蜱、幼蜱、若蜱、成蜱、蜱卵。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T36788-2018，病媒生物密度監(jiān)測(cè)方法—蜱類，2019

SN/T5337—2021，動(dòng)物疫病傳播媒介蜱種類鑒定技術(shù)規(guī)范，2022

3術(shù)語(yǔ)和定義

環(huán)境游離蜱：在經(jīng)常放牧的草地、野生動(dòng)物巢穴及家養(yǎng)畜舍地面采集到的蜱。

滅菌雙蒸水：經(jīng)過(guò)一次蒸餾后的水，再次蒸餾，并在103.4kPa，121℃的條件下高壓蒸汽滅菌20min，

得到滅菌雙蒸水。

4縮略語(yǔ)

下列縮略語(yǔ)適用于本文件。

COI:細(xì)胞色素C氧化酶亞基I（CytochromeCoxidasesubunitI）

DNA:脫氧核糖核酸（Deoxyribonucleicacid）

dNTP:脫氧核糖核苷三磷酸（Deoxy-ribonucleosidetriphosphate）

PCR:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction）

SDS:十二烷基硫酸鈉（Sodiumdodecylsulfate）

5樣品采集

5.1試劑與材料

5.1.1鑷子。

5.1.2白絨布

5.1.375%和95%乙醇。

5.1.4乳膠手套。

5.1.515mL和50mL離心管。

1

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5.2采集方法

5.2.1采集人員防護(hù)要求

5.2.1.1穿淺色、表面光滑的長(zhǎng)袖防護(hù)服，扎緊袖口和褲腿，穿雨靴，戴乳膠手套。

5.2.1.2裸露皮膚涂抹趨避劑如避蚊胺等。

5.2.1.3用殺蟲劑浸泡帳篷等露營(yíng)裝備。

5.2.1.4避免在蜱棲息地如草地、樹林等環(huán)境中長(zhǎng)時(shí)間坐臥。

5.2.1.5野外活動(dòng)結(jié)束后檢查衣物上是否有蜱。采集人員需及時(shí)進(jìn)行沖淋洗浴，并檢查體表，重點(diǎn)排

查頭發(fā)、腋窩、腹股溝及陰部等位置是否有蜱叮咬或爬動(dòng)。一旦發(fā)現(xiàn)蜱叮咬，用鑷子從叮咬處夾住蜱，

順著叮咬方向小心取出，用碘伏或酒精反復(fù)擦洗傷口；如蜱的假頭基留在皮膚內(nèi)，用潔凈的針頭挑破傷

口皮膚，挑出假頭基，再用碘伏或酒精反復(fù)擦洗。保留蜱，置于離心管或其他密閉容器內(nèi)4℃暫放，特

別是在蜱傳病流行的地區(qū)，需盡快就醫(yī)。

5.2.2畜禽體上蜱的采集

在牛、羊、犬、禽等動(dòng)物身上采集蜱時(shí)，用干凈、尖細(xì)的鑷子靠近皮膚表面緩慢夾取蜱，避免蜱的

假頭基部分殘留在皮膚內(nèi)。將采集到的蜱放置到15mL或50mL離心管中。去除蜱后，用75%乙醇溶

液對(duì)被蜱叮咬處進(jìn)行消毒。

5.2.3環(huán)境游離蜱的采集

5.2.3.1布旗采集法：白絨布一邊穿入木棍，在木棍兩端系以長(zhǎng)繩，選擇在人和動(dòng)物經(jīng)常活動(dòng)的小路

周邊草地上或灌木叢中緩慢拖動(dòng)，草地以及灌木上的蜱即可附著在旗面上。每行走約5米左右，即停下

檢查旗背面是否有蜱附著，并用鑷子收集于離心管中

5.2.3.2直接采集法：在稍矮的草地，將身體稍下蹲貼近地面，輕輕扶起草葉，觀察草葉背面是否有

蜱；在稍高的草地，直接觀察草尖處。發(fā)現(xiàn)蜱后用鑷子收集于離心管中或?qū)⑷~子截?cái)噙B同蜱共同置入離

心管內(nèi)，盡快赴實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行處置。

5.2.4衣物及布旗的處理

無(wú)需重復(fù)使用的物品，采用焚燒、煮沸或高溫蒸汽的方法處理；需要重復(fù)使用的物品，如個(gè)人衣物、

布旗等，采用煮沸法、高溫蒸汽法或洗衣機(jī)的高溫烘干功能進(jìn)行處理。

5.3蜱樣本的運(yùn)輸及保存

5.3.1運(yùn)輸

在車輛運(yùn)輸過(guò)程中需置于4-8℃車載冰箱。

5.3.2保存

用于蜱種鑒定的蜱樣本置于離心管內(nèi)，并加入足量的95%的乙醇溶液或無(wú)水乙醇浸泡，定期補(bǔ)充

乙醇。容器上需附有采集標(biāo)簽，注明采集地點(diǎn)、日期、宿主、生境、海拔、經(jīng)緯度、采集人等信息，避

光陰涼處暫放，避免高溫與陽(yáng)光直射。

暫時(shí)保存需將完整的蜱置于4℃、適當(dāng)濕度、避光環(huán)境下，可暫存2周以上。

長(zhǎng)期保存則需液氮冷凍1小時(shí)以上之后轉(zhuǎn)入-80℃超低溫冰箱保存。

6形態(tài)學(xué)鑒定

2

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6.1試劑與材料

參照SN/T5337—2021動(dòng)物疫病傳播媒介蜱種類鑒定技術(shù)規(guī)范，2022

6.2設(shè)備與儀器

體視顯微鏡。

6.3形態(tài)學(xué)觀察

參照SN/T5337—2021動(dòng)物疫病傳播媒介蜱種類鑒定技術(shù)規(guī)范，2022

蜱具體形態(tài)特征部位參見附錄B。

6.4蜱的形態(tài)學(xué)種類判定

蜱可根據(jù)典型形態(tài)特征鑒定到屬和種，具體形態(tài)特征按照附錄C進(jìn)行鑒定，其他不易觀察到典型

形態(tài)特征或殘缺的蜱則需采用分子生物學(xué)方法進(jìn)行種類的鑒定。

7DNA條形碼鑒定

7.1試劑與材料

除特別說(shuō)明以外，本文件所用試劑均為分析純，試驗(yàn)用水應(yīng)符合規(guī)范性引用文件的規(guī)定。

7.1.1無(wú)水乙醇。

7.1.2滅菌雙蒸水，按照附錄A.2配制。

7.1.31.5mL離心管。

7.1.4研磨管。

7.1.5蛋白酶K

7.1.6三羥甲基基甲烷（Tris）

7.1.7TaqDNA聚合酶及dNTP

7.1.8瓊脂糖及溴化乙錠（EB）

7.1.9乙二胺四乙酸鈉（Na2EDTA）

7.1.10苯酚、氯仿、異戊醇、無(wú)水乙醇等

7.1.11電泳緩沖液TBE，按照附錄A.3配制。

7.1.1250×TAE

7.1.13GoldVIEWⅠ核酸熒光染色劑。

7.1.1416SrDNA或COI引物任選其一。

7.1.151.5%瓊脂糖凝膠，按照附錄A.4配制。

擴(kuò)增片段引物序列（5’-3’）片段大小（bp）

F-CTGCTCAATGATTTTTTAAATTGCTGTGG

16SrDNA460

R-CCGGTCTGAACTCAGATCAAGT

F-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG

COI710

R-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA

3

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用雙蒸水將引物稀釋為20μmol/L工作濃度，-20℃保存?zhèn)溆谩Ｒ锖铣珊蟛捎脺缇p蒸水稀釋為

10μmol/L。

7.2設(shè)備與儀器

7.2.1常規(guī)PCR儀。

7.2.2組織研磨器。

7.2.3超凈工作臺(tái)。

7.2.4制冰機(jī)。

7.2.5恒溫水浴鍋。

7.2.6高速冷凍離心機(jī)。

7.2.7常規(guī)冰箱。

7.2.8旋渦振蕩器。

7.2.9電泳儀。

7.2.10凝膠成像系統(tǒng)。

7.2.1110μL、100μL、1000μL的微量可調(diào)移液器及配套吸頭。

7.2.12水平電泳槽。

7.2.13紫外分光光度計(jì)。

7.2.14高壓滅菌鍋。

7.3檢測(cè)方法

7.3.1樣本的處理及核酸提取

使用完整或不完整的成年蜱、幼蜱、若蜱、蜱卵樣品。將蜱樣品放置于1.5mL除酶離心管中，先用300

μL無(wú)水乙醇沖洗2次，再用300μL滅菌雙蒸水沖洗2次，放入一個(gè)新的研磨管中，管內(nèi)加入6-8顆研

磨珠，再加入200μL滅菌雙蒸水，將研磨管放入組織研磨器中，12000r研磨5min，用移液器吸取200

μL研磨液的上清液，按照附錄E提取組織DNA的方法,也可采用商品化的組織基因組DNA提取

試劑盒進(jìn)行。

7.3.2PCR反應(yīng)體系

反應(yīng)組分體積（μL）

MasterMix(DyePlus)5

上游引物（10μM）0.3

下游引物（10μM）0.3

雙蒸水3.4

蜱組織DNA1

總體積10

7.3.3PCR擴(kuò)增程序

95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s；54℃退火30s；72℃延伸50s，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延

伸8min。

PCR陽(yáng)性對(duì)照：蜱基因組DNA，參照附錄A.1。

PCR空白對(duì)照：滅菌雙蒸水。

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7.3.4瓊脂糖凝膠電泳

取5-10μL樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳（附錄A.3）。電泳結(jié)束后，用凝膠

成像儀或者紫外透射儀觀察結(jié)果。

7.3.5結(jié)果判定

7.3.5.1核酸電泳判定

16SrDNA陽(yáng)性對(duì)照，有460bp的擴(kuò)增條帶，同時(shí)陰性對(duì)照沒有相應(yīng)條帶，判定試驗(yàn)成立；否則試

驗(yàn)無(wú)效，需分析并排除引起試驗(yàn)無(wú)效的因素，并重新試驗(yàn)。

COⅠ基因陽(yáng)性對(duì)照，有710bp的擴(kuò)增條帶，同時(shí)陰性對(duì)照沒有相應(yīng)條帶，判定試驗(yàn)成立；否則試

驗(yàn)無(wú)效，需分析并排除引起試驗(yàn)無(wú)效的因素，并重新試驗(yàn)。

在陽(yáng)性、陰性對(duì)照都成立的前提下，若檢測(cè)樣品有460/670bp的條帶，則試驗(yàn)陽(yáng)性；若檢測(cè)樣品無(wú)

460/670bp條帶，則試驗(yàn)陰性。

7.3.5.2核酸測(cè)序

取16SrDNA基因或COⅠ基因的擴(kuò)增產(chǎn)物，使用Sanger測(cè)序法進(jìn)行測(cè)序。

7.3.5.3序列比對(duì)分析

將PCR擴(kuò)增后測(cè)序的COI序列或16S序列，登錄數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列分析，以分值最高且序列相似度

≥97%的蜱種為鑒定結(jié)果。

8結(jié)果綜合判定

8.1典型形態(tài)特征的樣品，直接判定蜱種。

8.2缺乏典型形態(tài)特征或部分典型特征的樣品，結(jié)合分子生物學(xué)DNA條形碼方法結(jié)果進(jìn)行蜱種鑒

定。

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附錄A

（規(guī)范性）

試劑的配制

A.1陽(yáng)性對(duì)照

取蜱（成蜱、若蜱、幼蜱、卵）等，提取基因組DNA，使用50μL滅菌雙蒸水溶解或洗脫基因組

DNA，-80℃保存。

A.2滅菌雙蒸水

經(jīng)過(guò)一次蒸餾后的水，再次蒸餾，并在103.4kPa，121℃條件下高壓蒸汽滅菌20min，得到滅菌雙

蒸水。

A.3電泳緩沖液TBE

即濃貯存液5×TBE

Tris堿54.0g

硼酸57.1g

0.5MEDTA20mL

在pH＝8.0條件下，加蒸餾水定容至1L，工作液為稀釋的0.5×TBE

A.41×TAE緩沖液及1.5%瓊脂糖凝膠

50×TAE緩沖液10mL

蒸餾水490mL

1×TAE緩沖液100mL

瓊脂糖1.5g

核酸染料5μL

將三角瓶放在沸水浴中加熱至瓊脂糖充分溶解，置室溫冷卻到50℃左右，加入核酸染料5μL，搖

勻，倒入電泳板上，凝固后，4℃?zhèn)溆谩?/p>

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附錄B

（資料性）

遼寧省主要蜱種的基本信息、典型形態(tài)圖及基本生物學(xué)特征

B.1遼寧省主要蜱種的形態(tài)模式圖

蜱隸屬于節(jié)肢動(dòng)物門（Arthropoda），蛛形綱（Arachnida），蜱螨亞綱（Acarina）、寄螨目

（Parasitiformes）、蜱總科（Ixodoidea），包括硬蜱科、軟蜱科及納蜱科，遼寧省常見蜱種為硬蜱（暫

未發(fā)現(xiàn)軟蜱和納蜱）。（形態(tài)結(jié)構(gòu)見圖B1）

B.2遼寧省主要蜱種的基本形態(tài)結(jié)構(gòu)

蜱背腹扁平，圓形或者橢圓形，身體分為假頭和軀體兩部分，假頭突出于軀體前或者位于軀體腹面

前端，為口器部分。軀體腹部有4對(duì)足。蜱的軀體背腹面是否有幾丁質(zhì)的盾板及盾板形狀等是鑒別蜱種

的重要特征。蜱的發(fā)育為不全變態(tài)，包括卵、幼蜱、若蜱和成蜱四個(gè)階段，幼蜱只有3對(duì)足。

B.3遼寧省主要蜱種的寄生部位

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蜱通常寄生在動(dòng)物耳部、腳趾間、腋窩處、頸項(xiàng)部、陰部及肛門等皮膚較薄、不易被搔動(dòng)的部位，寄生

數(shù)量多時(shí)蜱在動(dòng)物全身可見。

B.4蜱種的主要宿主動(dòng)物

蜱是重要的吸血性外寄生蟲，在蛻皮等發(fā)育時(shí)需要附著于宿主體表吸血。主要寄生在哺乳動(dòng)物體表，

少數(shù)寄生在鳥類、爬行類及兩棲類體表。蜱在叮咬宿主、吸食血液的同時(shí)釋放毒素，可導(dǎo)致癱瘓、毒性

反應(yīng)以及宿主的過(guò)敏反應(yīng)等。

B.5遼寧省主要蜱種可導(dǎo)致的人獸共患病與動(dòng)物疫病

蜱作為媒介可傳播、攜帶多種人畜共患病以及動(dòng)物疫病。遼寧省蜱傳播的疾病主要有：Q熱、立克

次體病、萊姆病、森林腦炎、克里米亞-剛果出血熱、人粒細(xì)胞無(wú)形體病、兔熱病、牛環(huán)形泰勒蟲病等。

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附錄C

（規(guī)范性）

蜱科屬的形態(tài)學(xué)鑒定步驟

C.1蜱科的確定（科檢索表）

鑒定

鑒定特征鑒定結(jié)果

步驟

身體背面具幾丁質(zhì)盾板或假盾區(qū)；

假頭向前，從背面可見；

進(jìn)行步驟2

氣門板顯著，位于身體腹面，足基節(jié)Ⅳ的后外側(cè)；

須肢各節(jié)幾乎等長(zhǎng)，或第Ⅳ節(jié)收縮，內(nèi)陷于第Ⅲ節(jié)腔內(nèi)。

1

表皮革質(zhì)，身體背面無(wú)盾板（原偽盾蜱屬的種類具革質(zhì)假盾區(qū)，但硬化

程度不高）；

軟蜱科

假頭位于腹面前方，若蜱和成蜱從背面不可見；

（Argasidae）

氣門板不明顯，位于足基節(jié)Ⅲ和Ⅳ之間的基節(jié)上褶上；

須肢各節(jié)幾乎等長(zhǎng)，第Ⅳ節(jié)不收縮，不內(nèi)陷，不近端點(diǎn)。

雌蜱身體背面具皺褶；

納蜱科

前端具乳突狀革質(zhì)假盾區(qū)，覆蓋物褶疊程度深；

（Nuttalliellidae）

須肢3節(jié)，末節(jié)內(nèi)陷不明顯。

2

身體背面具明顯堅(jiān)硬的盾板，雌蜱和未成熟蜱覆蓋背面前半部，雄蜱則

覆蓋整個(gè)背部；硬蜱科

除幾丁質(zhì)板附近，表皮上具有細(xì)小的褶或條紋；（Ixodidae）

須肢第Ⅰ節(jié)收縮，內(nèi)陷在第Ⅲ節(jié)腔內(nèi)。

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C.2硬蜱科各屬的確定（屬檢索表）

鑒定

鑒別特征鑒定結(jié)果

步驟

肛溝圍繞在肛門之前；

無(wú)眼；

雄蜱腹面幾乎全部被幾丁質(zhì)板覆蓋（共7塊）；硬蜱屬

幼蜱口下板后毛2對(duì)，背部無(wú)矢狀感器；（Ixodes）

通常為巢居性寄生，宿主不具專一性；

雄蜱不吸血，分布廣泛。

1肛溝圍繞在肛門之后，通常很小；

無(wú)眼

眼有或無(wú)；進(jìn)行步驟2

（尤其成蜱和若蜱）

雄蜱腹面無(wú)幾丁質(zhì)板，或發(fā)育不完全，僅分布在身

體后端（肛側(cè)板和副肛側(cè)板）；

幼蜱僅1對(duì)口下板后毛，身體背部具矢狀感器；

通常不穴居或巢居；有眼進(jìn)行步驟3

雄蜱吸血，分布相對(duì)有地域性。

假頭基方形至矩形；

須肢短，呈圓錐形，第II節(jié)長(zhǎng)寬約等，其外側(cè)超出假頭基邊緣；血蜱屬

2

幼蜱須肢3節(jié)，其背面矢狀感器前端具2對(duì)緣毛；（Haemaphysalis）

宿主不具專一性。

氣門板正常，無(wú)脊或色斑；

革蜱屬

3緣垛有或無(wú)，但不是9個(gè)，須肢長(zhǎng)度近似等于假頭基，且第II節(jié)長(zhǎng)與寬

（Dermacentor）

大致相等，有緣垛，雄蜱的第IV對(duì)足正常，假頭基矩形，通常有色斑。

注：目前遼寧省內(nèi)，主要硬蜱科成員為全溝硬蜱，革蜱屬成員為森林革蜱，血蜱屬成員為長(zhǎng)角血蜱、嗜

群血蜱、日本血蜱。

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附錄D

（規(guī)范性）

遼寧省主要蜱種形態(tài)鑒別特征

D.1遼寧省主要蜱種形態(tài)鑒別特征

蜱蜱

性別腹面特征背面特征

屬種

盾板僅占前部，無(wú)眼，

肛溝圍繞肛門之后，足基節(jié)I只有一距。假頭基矩形，

雌性

長(zhǎng)須肢第二節(jié)后外角輕度或中度突出，

角須肢第三節(jié)背面后緣有一發(fā)達(dá)三角形尖刺。

血盾板覆蓋整個(gè)背面，無(wú)眼，

蜱假頭基矩形，

雄性肛溝圍繞肛門之后，足基節(jié)I只有一距。

須肢第二節(jié)后外角輕度或中度突出，

須肢第三節(jié)背面后緣有一發(fā)達(dá)三角形尖刺。

盾板僅占前部，無(wú)眼，

肛溝圍繞肛門之后，足基節(jié)I只有一距，假頭基矩形，

嗜雌性

血足基節(jié)II—IV內(nèi)距較基節(jié)I內(nèi)距顯著短。須肢第二節(jié)后外角輕度或中度突出，

群

蜱須肢第二節(jié)與第三節(jié)外緣幾乎等長(zhǎng)。

血

屬盾板覆蓋整個(gè)背面，無(wú)眼，

蜱

雄性肛溝圍繞肛門之后，足基節(jié)I只有一距。假頭基矩形，須肢第二節(jié)后外角輕度或中度突出，

須肢第三節(jié)頂端向內(nèi)測(cè)彎曲，須肢合攏時(shí)交疊呈鉗狀。

盾板僅占前部，無(wú)眼，

肛溝圍繞肛門之后，足基節(jié)I只有一距，

假頭基矩形，

雌性足基節(jié)II—IV內(nèi)距較基節(jié)I內(nèi)距稍短或等

日須肢第二節(jié)后外角輕度或中度突出，

長(zhǎng)。

本須肢第二節(jié)外緣明顯短于第三節(jié)外緣。

血盾板覆蓋整個(gè)背面，無(wú)眼，

蜱肛溝圍繞肛門之后，足基節(jié)I只有一距，假頭基矩形，

雄性

口下板齒式5/5。須肢第二節(jié)后外角輕度或中度突出，

須肢第三節(jié)頂端不向內(nèi)側(cè)彎曲。

盾板僅占前部，有眼，

肛溝圍繞肛門之后，足基節(jié)I有2個(gè)發(fā)達(dá)

盾板有琺瑯斑；

雌性的距，內(nèi)距較尖窄，基節(jié)IV外距的末端

森須肢粗短，

革超出該節(jié)后緣，生殖孔有翼狀突。

林足轉(zhuǎn)節(jié)I背面后緣的距略長(zhǎng)，末端尖細(xì)。

蜱

革肛溝圍繞肛門之后，足基節(jié)有個(gè)發(fā)達(dá)盾板覆蓋整個(gè)背面，有眼，

屬I2

蜱的距，內(nèi)距較為尖窄，基節(jié)IV外距不超盾板琺瑯斑較多且較濃；

雄性

出該節(jié)后側(cè)緣，氣門板背突末端達(dá)到盾板須肢粗短，

邊緣。足轉(zhuǎn)節(jié)I背面后緣的距略長(zhǎng)，末端尖細(xì)。

盾板僅占前部，

肛溝圍繞肛門之前，足基節(jié)I內(nèi)距明顯或

足長(zhǎng)度適中；

全雌性后內(nèi)角窄小如距突；基節(jié)IV有短的外距

硬假頭基后側(cè)角不尖出，

溝或內(nèi)距，耳狀突粗短或呈脊?fàn)睢?/p>

蜱盾板卵圓形。

硬

屬肛溝圍繞肛門之前，足基節(jié)有或長(zhǎng)或短

蜱I

雄性的內(nèi)距；基節(jié)II—IV或僅基節(jié)IV有粗短盾板覆蓋整個(gè)背面。

的外距，氣門板大，卵圓形。

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DB21/XXXXX—XXXX