細菌平板劃線分離技術訓練目標一、知識目標1.了解平板劃線需要的器材；2.了解常用的消毒方法、酒精燈的使用方法；3.掌握接種環的使用方法及正確的取樣方法；4.掌握“Z”字形、分區劃線等方法的技術要領。二、能力目標1.能獨立、規范地進行消毒操作；2.能熟練使用接種環進行取樣操作；3.能熟練利用平板劃線方法進行細菌分離。三、素質目標1.樹立規范、無菌操作的意識；2.具備較強的生物安全意識；3.培養學生精益求精、嚴謹務實的科學精神。考綱要求(1)技能考點①掌握消毒等操作準備方法；②掌握酒精燈使用方法；③掌握接種環使用的流程與方法；④掌握生物材料常規取材的流程與方法；⑤掌握“Z”字型劃線法、分區劃線法等方法的流程與操作技巧；(2)職業素養了解生物安全的概念與場景。知識點梳理（一）實驗原理

細菌平板劃線分離技術是指把雜菌樣品通過在平板表面劃線稀釋而獲得單菌落的方法。

一般是將混雜在一起的不同種微生物或同種微生物群體中的不同細胞（細菌），通過在分區的平板表面上作多次劃線稀釋，形成較多的獨立分布的單個細菌，經培養而繁殖成相互獨立的多個單菌落。菌落進行多次劃線分離，才可獲得可靠的純種。概述

實際上同種微生物數個細菌在一起通過繁殖也可形成一個單菌落，故在科學研究中，特別是在菌種鑒定等工作中，必須對實驗菌種的單菌落進行多次劃線分離，才可獲得可靠的純種。

平板劃線分離對細菌、酵母菌較為適宜，而霉菌和放線菌的分離多采用稀釋分離法進行菌種的分離純化。

病料、實驗用菌種、營養瓊脂培養基、接種環、酒精燈、火柴、試管架、培養箱、記號筆、烙刀、鑷子、剪子、乳膠手套、消毒棉球等。儀器材料知識點梳理（二）實驗器材瓊脂平板酒精棉球酒精燈接種環記號筆試管架、液體菌種鑷子操作前的準備

1.玻璃器皿的洗滌：為了保證微生物實驗順利進行，保證實驗結果的準確性，不影響實驗效果，必須把器皿徹底清洗干凈。洗刷儀器時，應首先將手洗凈，免得手上的油污附在儀器上，增加洗刷的困難。一般的玻璃儀器，使用各種形狀的儀器毛刷，如試管刷、瓶刷、滴定管刷等。首先用毛刷從外到里用水刷洗，這樣可刷洗掉可溶水物質、部分不溶性物質和灰塵；若有油污等有機物，可用一定濃度的洗潔精水溶液浸泡一定時間后，再用蘸有洗滌劑的毛刷擦洗，然后用自來水沖洗干凈，最后用純化水潤洗內壁2～3次。洗凈的玻璃儀器內壁應能被水均勻地潤濕而無水的條紋，且不掛水珠。操作前的準備

1.玻璃器皿的洗滌：采取上述方法不能洗凈的器皿，應采取特殊洗滌法。應先采取常規洗滌，然后將器皿晾干，根據污物的性質選用適宜的洗滌劑。將洗滌劑溶液倒入或吸入容器內，應使儀器周壁全浸洗后稍停一會（或浸泡2～24h后）再倒回洗液瓶內。第一次用少量水沖洗剛浸洗過的儀器后，廢水不要倒在水池里和下水道里，長久會腐蝕水池和下水道，應倒在廢液缸中，缸滿后倒在垃圾里。如果無廢液缸，倒入水池時，要邊倒邊用大量的水沖洗。經常使用的儀器應在每次實驗完畢后洗凈干燥備用，不急用的可在蒸餾水沖洗后放在無塵處倒置，自然晾干；急用的可在烘箱（105～110℃，1h）或紅外燈干燥箱中烘干，也可用吹風機采取冷→熱→冷風的方式吹干。操作前的準備

1.玻璃器皿的洗滌：常用潔凈劑：肥皂、洗衣粉、洗潔精、自配洗液、有機溶劑等。有機溶劑：帶有脂肪性污物的器皿，可以用汽油、甲苯、二甲苯、丙酮、酒精、三氯甲烷、乙醚等有機溶劑擦洗或浸泡，但用有機溶劑作為洗液浪費較大，能用刷子洗刷的大件儀器盡量采用堿性洗液，只有無法使用刷子的小件或特殊形狀的儀器才使用有機溶劑洗滌，如活塞內孔、移液管尖頭、滴定管尖頭、滴定管活塞孔、滴管、小瓶等。也可借助某些有機溶劑能與水混合而又揮發快的特殊性，沖洗一下帶水的儀器，如酒精，乙醚等。操作前的準備常用潔凈劑重鉻酸鉀洗液：重鉻酸鉀(K2Cr207)在酸性溶液中，有很強的氧化能力，對玻璃儀器又極少侵蝕作用。所以這種洗液在實驗室內使用最廣泛。新配制的洗液為紅褐色，氧化能力很強，當洗液用久后變為黑綠色，應廢棄處理，重新配制。堿性洗液：用于洗滌有油污物的儀器，用此洗液是采用長時間（24小時以上）浸泡法或浸煮法。從堿洗液中撈出儀器時，要戴乳膠手套，以免燒傷皮膚。常用的堿性洗液有：碳酸鈉溶液，碳酸氫鈉溶液，磷酸三鈉溶液，磷酸氫二鈉溶液等。純酸純堿洗液：根據器皿污垢的性質，直接用濃鹽酸或濃硫酸、濃硝酸浸泡或浸煮器皿(溫度不宜太高，否則濃酸揮發刺激)。純堿洗液多采用10%以上的濃燒堿、氫氧化鉀或碳酸鈉液浸泡或浸煮器皿(可以煮沸)。操作前的準備

2.玻璃器皿的消毒滅菌：一般使用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌。用高溫加高壓滅菌，不僅可殺死一般的細菌、真菌等微生物，對芽胞、孢子也有殺滅效果，是可靠、應用最普遍的物理滅菌法。在103.4kPa蒸汽壓下，溫度達到121.3℃。時間維持20～30分鐘。適用于普通培養基、生理鹽水、手術器械、玻璃容器及注射器、敷料等物品的滅菌。可用牛皮紙或雙層報紙單個或數個包成一包，也可直接放入特制的培養皿滅菌金屬桶內，加蓋滅菌。操作步驟是：①首先將內層滅菌桶取出，向外層鍋內加入適量的水，使水面與三角擱架相平為宜。②放回滅菌桶，并裝入待滅菌物品。注意不要裝得太擠，以免防礙蒸汽流通而影響滅菌效果。（三角燒瓶與試管口端均不要與桶壁接觸，以免冷凝水淋濕包口的紙而透入棉塞。）操作前的準備

2.玻璃器皿的消毒滅菌：③加蓋，先將蓋上的排氣軟管插入內層滅菌桶的排氣槽內。再以兩兩對稱的方式同時旋緊相對的兩個螺栓，使螺栓松緊一致，勿使漏氣。④用電爐加熱，并同時打開排氣閥，使水沸騰以排除鍋內的冷空氣。待冷空氣完全排盡后，關上排氣閥，讓鍋內的溫度隨蒸汽壓力增加而逐漸上升。當鍋內壓力升到所需壓力時，控制熱源，維持壓力至所需時間。⑤滅菌所需時間到后，切斷電源，讓滅菌鍋內溫度自然下降，當壓力表的壓力降至“0”時，打開排氣閥，旋松螺栓，打開蓋子，取出滅菌物品。如果壓力未降到“0”

時打開排氣閥，因鍋內壓力突然下降，使容器內的培養基由于內外壓力不平衡而沖出燒瓶口或試管口，造成棉塞沾染培養基而發生污染。操作前的準備

2.玻璃器皿的消毒滅菌：電熱干燥箱內進行干熱滅菌：在干熱狀態下，由于熱穿透力較差，微生物的耐熱性較強，必須長時間受高溫的作用才能達到滅菌的目的。因此，干熱空氣滅菌法采用的溫度一般比濕熱滅菌法高。玻璃器皿干燥包裝后放入電熱干燥箱內，加熱160℃～180℃，維持2h。包裝放置在干燥箱內，不要和箱壁接觸，打開電源后，先把箱頂部的通氣孔打開一點，讓濕空氣逸出，當箱內溫度達到100℃后，關閉通氣孔。調節溫度控制旋鈕到設定的溫度，升溫至所設定的溫度時，維持1h～2h進行滅菌。滅菌完成后，關掉電源，冷卻到60℃時，再打開箱門。溫度控制旋鈕歸位，并打開頂部通氣孔。滅菌后的器皿，要1周內用完。操作前的準備

3.平板制備基本程序：計算→稱量→溶化→倒平板→無菌檢驗→備用。①計算：根據營養瓊脂培養基說明書了解營養瓊脂粉與水的比例，一般是1000mL蒸餾水中應加營養瓊脂粉31.3g，再根據培養基的需要量確定營養瓊脂粉的用量。營養瓊脂粉的量=31.3×15×n/1000(g)其中：15代表一個平板需要營養瓊脂培養基約15mL;n代表要做的平板的數量。②稱量：用普通天平準確稱量出營養瓊脂粉的量，用量筒量出相應的蒸餾水的量，要盡量準確。③溶化：將營養瓊脂粉和蒸餾水倒入搪瓷缸中，于電爐上加熱溶化，邊加熱邊攪拌，沸騰時立即從電爐上拿下，等泡沫消失后再放在電爐上加熱，注意不能讓營養瓊脂溢出，煮沸2～3次。或用三角瓶放入熱水浴中加熱至沸，直至充分融化。操作前的準備

3.平板制備④倒平板：待培養基冷卻至50℃左右后，按無菌操作法倒平板(每皿約倒15ml)，平置，待凝。操作方法：右手持盛培養基的三角瓶置火焰旁邊，用右手手掌和小指將瓶塞輕輕地撥出，瓶口保持對著火焰；然后左手拿培養皿并將皿蓋在火焰附近打開一條稍大于瓶口的縫隙，迅速倒入培養基約15ml，加蓋后輕輕搖動培養皿，使培養基均勻分布在培養皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即為平板。⑤滅菌：將平板培養基整齊地平放入高壓滅菌器的內筒中，在121.3℃滅菌20～30min。滅菌完畢，將平板培養基拿出平放于桌面，凝固前勿動。或將裝有培養基的三角瓶放入高壓滅菌器內滅菌后在超凈工作臺倒平板。操作前的準備

3.平板制備⑥無菌檢驗：隨機抽取幾個平皿于37℃溫箱中培養24h，若無菌生長則為合格。平板要求：瓊脂平板要求平皿表面干燥平整，無泡沫，皿蓋上無水珠。干燥不充分易發生菌落擴散，有冷凝水不利于細菌分離并且會導致細菌繁殖使結果失真；干燥過分，會導致培養基裂開，不能用；干燥合適，則樣液吸收完全、快。固體培養基半固體培養基

液體培養基操作前的準備

4.洗手與消毒凡是進入微生物實驗室的工作人員均應洗手、消毒，防止對藥品、設備產生污染。①洗手前需確認手腕及手指上無手表、戒指、手鏈等飾品，手指甲長度不超過1㎜。②先將雙手浸濕，一手按洗手液儲存器的按鈕，一手接放出來的洗手液，按鈕至少按兩次。③再將洗手液揉搓均勻并使其遍布雙手，整個過程至少一分鐘以上。④用一手打開飲用水龍頭開關，把雙手放在水龍頭下，讓水龍頭出水將雙手上的洗手液沖洗至無滑膩感、無泡沫、污跡，如有則重復此步驟。內、外、夾、弓、大、立、腕操作前的準備

4.洗手與消毒⑤將雙手放在自動烘手機下，由指尖至腕部、掌背至掌心方向來回烘手，至指尖至腕部均無水跡，有干燥感。⑥手消毒方法：把雙手放在自動噴霧消毒器下方1～2cm處片刻，消毒劑將自動噴在雙手上，雙手翻過來再吸一次，務必使消毒劑噴到手掌、手指、手腕的每一部分并保持一分鐘以上，把手自然揮干。用棉球蘸70%酒精涂擦雙手各部位，或將雙手放入酒精溶液中浸泡5分鐘。或用快速消毒液消毒雙手。操作前的準備

5.超凈工作臺的使用超凈工作臺是一種提供局部無塵無菌工作環境的單向流型空氣凈化設備。能保護在工作臺內操作的物品等不受污染。超凈工作臺原理是在特定的空間內，室內空氣二級過濾，吹出潔凈均勻的斷面氣流，以排除工作區原來的空氣，將塵埃顆粒和生物顆粒帶走，以形成無菌的高潔凈的工作環境。①使用前30分鐘開啟紫外滅菌燈，對工作區域進行照射殺菌。②使用前20分鐘將通風機啟動。③使用時，關閉紫外滅菌燈，開啟日光燈。④使用光畢，應擦凈工作臺面，開啟紫外滅菌燈消毒滅菌，20分鐘后關閉紫外燈，關閉潔凈臺電源。⑤操作區不允許放置不必要的物品，保持潔凈、氣流通暢。⑥擋風玻璃上下移動時不要用力過猛，以防玻璃破損傷人。⑦長期不使用的工作臺要撥下電源插頭。⑧請勿在周圍有人時開啟紫外燈。操作前的準備

5.超凈工作臺的使用①將所用到的實驗物品先放入超凈臺中，關上玻璃門；②打開電源；關掉通風（默認為標準通風）；打開紫外燈開關開始滅菌，約10～15min即可；③關閉紫外燈，將玻璃門稍微打開，并打開通風小吹2～3min；將通風關閉，或改為低速；④打開照明燈，用75%的酒精或0.5%過氧乙酸噴灑擦拭超凈工作臺面。⑤點燃酒精燈開始實驗操作；實驗完成后關閉酒精燈，并將個人實驗用品帶走；⑥最后清理干凈臺面，用消毒液擦拭臺面，關閉工作電源，重啟紫外燈照射15分鐘關閉電源。進入實驗室前應先洗手、戴上已經消毒好的口罩、帽子（或頭罩），穿上實驗服和無菌拖鞋。操作者再次消毒雙手后戴上無菌手套（橡膠手套）方可進入微生物實驗室。1.工作臺消毒取酒精棉球對操作臺進行消毒。注意消毒時酒精棉球應按照一定的順序擦拭操作區域（從左到右依次消毒，擦拭臺面不可重復，面積與肩同寬，棉球不得往返使用）。用后的棉球放入廢棄缸內，操作臺消毒完畢后再次夾取酒精棉球對操作者手套進行消毒。操作步驟消毒

用鑷子夾取酒精棉球對操作者的手臂進行擦拭消毒，并對操作臺消毒（由內向外畫圈，與肩同寬的面積）2.點燃酒精燈將酒精燈置于操作臺正前方，取出燈蓋置于操作臺前面，用火柴點燃酒精燈（一般不用打火機），火柴根應熄滅后放入盛水的燒杯內或廢棄缸內。切記未熄滅就放入丟棄有酒精棉球的廢棄缸內。①新購置的酒精燈應首先配置燈芯。燈芯通常是用多股棉紗線擰在一起，插進燈芯瓷套管中。燈芯不要太短，一般浸入酒精后還要長4～5cm。②對于舊燈，特別是長時間未用的燈，在取下燈帽后，應提起燈芯瓷套管，用洗耳球或嘴輕輕地向燈內吹一下，以趕走其中聚集的酒精蒸氣。再放下套管檢查燈芯，若燈芯不齊或已燒焦都應用剪刀修整為平頭等長。③燈壺內酒精少于其容積1/3（1/4）的都應添加酒精。酒精不能裝得太滿，以不超過燈壺容積的2/3為宜。（1/4-2/3）（酒精量太少則燈壺中酒精蒸氣過多，易引起爆燃；酒精量太多則受熱膨脹，易使酒精溢出，發生事故）。添加酒精時一定要借助一個小漏斗，以免將酒精灑出。燃著的酒精燈，若需添加酒精，必須熄滅火焰。決不允許燃著時加酒精，否則，很易著火，造成事故。萬一灑出的酒精在桌上燃燒起來，要立即用濕棉布鋪蓋滅。酒精燈的使用方法④新燈加完酒精后須將新燈芯放入酒精中浸泡，而且移動燈芯套管使每端燈芯都浸透，然后調好其長度，才能點燃。因為未浸過酒精的燈芯，一經點燃就會燒焦。⑤點燃酒精燈一定要用燃著的火柴，決不能用一盞酒精燈去點燃另一盞酒精燈。否則易將酒精灑出，引起火災。（有時用打火機也行，但較容易燒到手，不提倡，不過在沒有火柴的情況下也可以用打火機，實驗操作考試時必須用火柴）⑥酒精燈燈焰分為外焰、內焰、焰心三部分，在給物質加熱時，一般用溫度最高的外焰進行消毒或加熱。加熱的器具與燈焰的距離要合適，過高或過低都不正確。與燈焰的距離通常通過燈的墊木或者鐵環的高低來調節。被加熱的器具必須放在支撐物(三腳架、鐵環等)上或用坩堝鉗、試管夾夾持，決不允許徒手拿儀器加熱。⑦用燈帽將其蓋滅，熄滅后需再重蓋一次，一是檢查熄滅沒有，二是放走酒精蒸汽，讓空氣進入，免得冷卻后蓋內造成負壓使蓋打不開。決不允許用嘴吹滅，以免引起燈內酒精燃燒，發生危險。酒精燈的使用方法⑧不用的酒精燈必須將燈帽罩上，以免酒精揮發，因為酒精燈中的酒精，不是純酒精，所以揮發后，會有水在燈芯上，致使酒精燈無法點燃。⑨酒精燈不用時，應蓋上燈帽。如長期不用，燈內的酒精應倒出，以免揮發；同時在燈帽與燈頸之間應夾小紙條，以防粘連。⑩要用酒精燈的外焰加熱，給玻璃儀器加熱時應把儀器外壁擦干，否則儀器炸裂，給試管中的藥品加熱，首先必須預熱，然后在對著藥品部位加熱。加熱時不能讓試管接觸燈芯，否則試管會炸裂。酒精燈的使用方法

接種環消毒：從試管架上選用平整、圓滑的接種環（使用前接種環在70%乙醇里浸泡備用）。右手持接種環，置于酒精燈火焰的外焰上順次燒紅3次以充分滅菌（深入試管內的接種環其余部分也要充分滅菌）；灼燒滅菌后待冷卻后再進行接種劃線，劃線之間要進行灼燒滅菌。3.接種環滅菌：接種環是細菌培養時常用的一種接種工具，由鎳合金絲制成，分為接種環、金屬桿和絕緣柄三部分。廣泛應用在微生物檢測、細胞微生物、分子生物學等眾多學科領域。①從試管架上選取平整、圓滑的接種環。②右手采用執筆式（拿毛筆）手持接種環絕緣柄，直立于火焰外焰，先灼燒整個環端及螺口，充分燒紅。③再將金屬桿部分在外焰水平方向來回通過三次灼燒滅菌。④灼燒滅菌后的接種環在火焰旁稍冷后方可使用。⑤使用后的接種環同樣需在酒精火焰上灼燒滅菌后放置或繼續使用。操作步驟3.接種環滅菌：使用后的接種環滅菌方法：當接種環上菌體較多時，假如直接進行高溫灼燒會使菌體急速受熱形成氣溶膠噴濺，污染空氣和操作臺面，既會影響無菌操作的效果，也可能引起操作者的感染。其滅菌方法是：①先斜持接種環約30°置于酒精燈內焰附近進行加熱(也可將接種環置于離外焰一定距離處烘烤)，此處溫度相對較低，不會引起菌體快速受熱形成氣溶膠噴濺；②待菌體受熱完全干燥以后(根據經驗估計時間)，再按照上述方法灼燒滅菌。值得注意的是，當接種環上液體較多時，受熱后液滴炸裂更易形成微生物氣溶膠，通常需要先用吸水紙吸干再灼燒滅菌。現在也有專門的紅外接種環滅菌器，完全替代酒精燈，方便快捷。操作步驟可見，接種環灼燒滅菌操作的每一個步驟都有其重要作用，不可隨意省略或顛倒。規范化的操作有利于科學態度和科學素養的培養，使學生形成嚴謹治學的科學作風，對以后的發展大有裨益。接種環的使用方法①劃線法：用接種環粘取含菌材料，在固體培養基表面劃線。②點植法：用接種環在固體培養基表面接觸幾點。③傾注法：取少許含菌材料放入無菌培養皿中，傾注已融化的48℃左右的瓊脂培養基，搖勻冷卻。④穿刺法：用接種環粘取微生物穿刺而進入半固體培養基深層培養。⑤浸洗法：用接種環挑取含菌材料，在液體培養基中沖洗。操作步驟4.取材料

（1）液體材料的采取直接用滅菌的接種環取病料。①用左手持盛有被檢材料的試管（或廣口瓶），將菌種試管口四周在酒精燈外焰上過火3次（每次2~3秒）滅菌。②用右手手掌邊緣與小指或小指與無名指夾住管（瓶）塞拔出，將對試管口與棉塞置于酒精燈火焰上過火滅菌。③右手持滅菌稍冷卻的接種環伸入試管內，從菌液中挑取菌種一環取出(試管

、瓶口保持對著火焰)。④試管口與棉塞過火滅菌后蓋上管塞，再次過火2-3次后放回試管架上。要求：取菌過程中保持試管口對著火焰，取出的菌樣離火焰距離適當。方法步驟4、無菌操作取病料（2）平皿內取樣①左手持盛有被檢材料的平皿，在酒精燈的火焰上灼燒一下培養皿的邊緣，置于酒精燈旁（3-5㎝即為無菌區）。②用左手拇指、食指及中指將靠近酒精燈一側的皿蓋揭開呈20°左右的角度(角度愈小愈好，以免空氣中的細菌進入皿中將培養基污染)。③右手持消毒滅菌后稍冷卻的接種環從打開的口子伸入，將接種環置于平皿邊緣冷卻，從菌落中蘸取菌種少許（保持平皿口對著火焰）。④取出接種環后立即蓋好平皿蓋，平皿倒置放置于操作臺上。方法步驟平皿開蓋方法平皿內取樣4、無菌操作取病料（3）組織病料采取①將手術刀或手術剪在酒精燈火焰上灼燒滅菌。②用燒紅的刀、剪在病料表面燒烙進行滅菌。③刀、剪再次灼燒滅菌后稍冷卻，在燒烙面的中央做一切口。④用滅菌接種環從切口插入組織中緩緩轉動接種環，取少量組織或液體。方法步驟組織病料取樣4.無菌操作取病料（4）送檢病料取樣送檢病料均應用75%酒精棉消毒開啟部位及其周圍，再用火焰滅菌的剪刀剪開，嚴格按無菌操作要求取樣。冷凍樣品解凍冷凍樣品取出后，按包裝原樣在室溫下自然解凍；也可在0～4℃環境解凍，時間不超過18小時；也可在溫度不超過45℃環境中解凍，時間不超過15min。將樣品解凍到半解凍狀態（剪刀能剪開）。冷凍樣品來不及檢驗應放入-15℃以下冰箱內，待檢樣品存放時間不應超過36h。干燥食品可放在常溫冷暗處，易腐和冷卻樣品應放入10℃環境。樣品外包裝消毒先將樣品外包裝正反面用75%酒精噴灑（如果樣品表面有冷凝水先擦拭干凈后再用酒精噴灑）。固體樣品：再用火焰滅菌的剪刀剪開，用火焰滅菌后的剪刀和鑷子取樣，稱取25g有代表性樣品，加入225ml的滅菌磷酸鹽緩沖液（開蓋瓶塞時瓶口部和瓶塞應在火焰通過1～2次，以殺滅從空氣中落入雜菌）后，均質后將樣品封口。擦拭干凈剪刀鑷子后浸泡于75%酒精容器中。方法步驟4.取材料液體樣品：冷凍樣品完全解凍后使用。75%酒精棉消毒開啟部位及其周圍，再用火焰滅菌的剪刀開啟，用滅菌吸管取充分混合后樣25ml，余同上。粉末狀樣品以及半固體樣品：先將樣品混合均一化。75%酒精棉消毒開啟部位及其周圍，再用火焰滅菌的剪刀開啟，以無菌匙采取混合后樣10g。加入90ml滅菌磷酸鹽緩沖液，開蓋瓶塞時瓶口部和瓶塞應在火焰通過1～2次，以殺滅從空氣中落入雜菌。備注：從罐頭取樣時，在表面放上小塊酒精棉（倒上少量酒精）點火燃燒后開罐。罐頭起子用酒精棉擦拭火焰滅菌后使用。75%酒精必須保證一周換3次，如果容器內有明顯的污物應立即更換。火焰滅菌的剪刀、鑷子通過火焰4～5s即可。方法步驟4.取材料樣品稀釋①從均質袋準確吸取樣液1mL，②沿管壁徐徐接種到含9mL磷酸鹽緩沖液里，蓋上試管塞后充分震蕩混勻為1：100稀釋液。（勿使吸管尖端伸入稀釋液內，以免吸管外部粘附的待檢液溶于其內。）③重復該操作，按需要配制1：1000、1：10000…稀釋液。④為減少樣品稀釋誤差，在連續遞增稀釋時（原液在前稀釋液在后），每一稀釋液應充分振搖，使其均勻，同時每一稀釋度應更換一支吸管。⑤不要在稀釋劑中吹洗吸管。備注：樣液稀釋必須加以足夠震搖，確保液體混勻，形成的菌落能以10倍遞增或遞減，符合邏輯性。方法步驟4.取材料（3）樣液接種：①從吸管筒沿筒上壁抽出吸管，在火焰旁吹洗吸耳球同時在吸管尾端插上吸耳球后，從吸管尾端至尖端快速通過火焰，并且排空吸管里殘留的水。②以吸管插入均質袋樣液內的深度不超過2.5cm處，準確吸取樣品勻液（吸管尖不要碰著袋口。吸入的液體應先高于所要求的刻度,然后提起吸管使其尖端離開液面并貼在袋內將液體調至所要求的刻度。）1mL、0.2mL無菌操作分別在2～4s內完全注入已標識清楚的平皿中。③如果某一樣品液在接種前放置時間超過3min，應重新均質。④為了驗證稀釋液、培養基、平皿、吸管等器具無菌需做空白對照。方法步驟生物材料取材后的無害化處理

生物材料取材應避免污染和病毒、細菌的擴散傳播，對廢棄物應嚴格處理，對環境嚴格消毒。1.取材后的血液、口鼻分泌物、乳汁、膿汁或局部腫脹滲出液、體腔液、尿液、生殖道分泌物和糞便等生物材料應封裝進行無害化處理。2.一次性注射器和一次性防護用品等應裝入密封袋中并進行無害化處理。3.對于所使用的器具、器械的處理；注射器針頭、手術刀片等使用后，應置入銳器盒內封閉并進行無害化處理。4.材料采集后動物尸體，應及時噴灑消毒劑，用密封袋包裝后進行無害化處理。5.取材結束，人員需要進行更衣消毒，并對環境進行嚴格的清潔、消毒。5、平板劃線細菌平板劃線分離技術的原理是將微生物樣品在固體培養基表面多次作"由點到線"稀釋而達到分離目的的。細菌平板劃線分離時，含菌量較少的標本可不分區，直接進行“Z”字形連續劃線；含菌量較多的標本，則可根據含菌量多少將平板進行分區劃線。可分三區、四區、五區等。方法步驟“Z”字形連續劃線法“Z”字型劃線法

左手將平皿置于酒精燈旁，用拇指、食指和中指將皿蓋一側打開（打開靠近酒精燈的一側，打開角度以能順利劃線為宜，但以角度小為佳，以免空氣中的細菌污染培養基）。右手拿接種棒，先將細菌標本涂布于培養基一角，并以此為起點，從培養皿一端到另一端，進行連續不重復的“Z”字形劃線，劃線多少應視菌量多少來定。菌落

三區劃線（農科院推薦）四區劃線五區劃線5、平板劃線（四區）我們一般將平板分成四個不同面積的小區進行劃線，第一區(A區)面積最小，作為待分離菌的菌源區，第二和第三區(B、C區)是逐級稀釋的過渡區，第四區(D區)，則是關鍵區，使該區出現大量的單菌落以供挑選純種用。為了得到較多的典型單菌落，平板上四區面積的分配應是D>C>B>A。劃線的形式有多種，又可分為平行劃線法與“Z”字形劃線法。方法步驟平行劃線與“Z”字形劃線5、平板劃線（三區）用沾有少量待純化培養物的接種環在已凝固的培養基表面輕輕劃線(以不劃破瓊脂為度)，劃線方式主要有以下兩種：在瓊脂表面輕輕劃第1區的三條線(注意接種環與接種平板表面之間保持為30°—40°角)，將培養皿轉動90°，燒接種環，連著1區第三條線1-c劃第二區的2-a，然后單劃2-b、2-c，再將培養皿轉90°，燒接種環，連著2-c劃第3區的3-a，然后單獨劃3-b、3-c。方法步驟1235、平板劃線（三區）也可如圖進行連續劃線。方法步驟5、平板劃線（四區）（1）劃A區：左手將平皿（皿蓋在上面）置于酒精燈旁，用拇指、食指及中指將皿蓋打開一側（酒精燈一側，角度大小以能順利劃線為宜，但以角度小為佳，以免空氣中細菌污染培養基）。右手持接種環，將已取菌種的接種環伸入平皿A區靠近邊緣一側，然后自涂抹處以腕力在平板表面輕輕地劃3-5條連續的“Z”字形平行線。線條多少依挑菌量的多少及分區多少而定。接種環與平皿夾角30～45°之間。劃完A區后應立即燒掉環上的殘菌，以免因菌過多而影響后面各區的分離效果。在燒接種環時，左手持皿蓋并將其覆蓋在平皿上方，以防止雜菌的污染，也可將平皿倒置于桌面上。（也有人主張在平皿上涂抹后滅掉接種環的細菌，然后再從涂抹處進行劃線）方法步驟平板劃線角度畫A區取菌培養平板劃線位置在酒精燈火焰旁平板劃線（四區劃線法）（2）畫B區:將平皿在手上逆時針轉動60°左右，使B區轉到燈的對側。打開皿蓋，將燒去殘菌后的接種環在平板培養基邊緣或皿蓋上冷卻一下，接種環通過A區(菌源區)將菌帶到B區，隨即畫數條致密的平行線，仍燒掉環上的殘菌。（3）畫C區：以相同的方式從B區作C區的畫線。（4）畫D區：以相同的方式經C區作D區的畫線,D區的線條應與A區平行,但畫D區時切勿重新接觸A、B區，以免該兩區中濃密的菌液帶到D區，影響單菌落的形成。隨即將平皿蓋住,倒置于桌面。燒去接種環上的殘菌，熄滅酒精燈。B區C區D區5、平板劃線（2）劃其他區：①將培養基轉動一定角度（角度大小與分區多少有關，分三區轉動90°分四區轉動約600）。②將火焰滅菌后的接種環稍冷卻后伸入平板內。（也可在平皿內培養基的邊緣或皿蓋上輕點一下冷卻）③將接種環從A區(菌源區)的邊緣將菌帶到B區，可帶1～3次。隨即劃數條致密的平行線。有的要求必須從A區的線尾帶菌劃線。④燒掉環上的殘菌，再從B區作C區的劃線。接種環滅菌后經C區作D區的劃線，D區的線條應與A區平行，但劃D區時切勿重新接觸A、B區，以免該兩區中濃密的菌液帶到D區，影響單菌落的形成。方法步驟最新版整理ppt73固體斜面接種法（1）用左手大姆指、食指和無名指夾住菌種試管和待接種和斜面試管，右手擰松棉塞、不取下。（2）右手拿接種環，在火焰上燒灼滅菌，特別是箍處。最新版整理ppt74（3）火焰邊取下兩個棉塞，不能放下；燒灼管口一周。（4）將接種環伸入試管內，冷卻后，輕輕挑取少量菌體，立即將接種環抽出。最新版整理ppt75（5）火焰旁將沾有菌種的接種環迅速伸到斜面培養基的底部，由里向外畫蛇形細線，線要畫得細些。（6）抽出接種環后，燒管口，塞棉塞，接種環滅菌。6、標記培養劃線完畢，將培養皿蓋好，倒置于操作臺上；接種環徹底滅菌后放回原處；用記號筆在培養皿底部注明被檢材料的名稱、日期和接種者等標記。嚴禁將未標記的平皿放入培養箱內。熄滅酒精燈（注意要蓋兩次）。將培養皿倒置放入37℃恒溫培養箱中，培養18～24h（24h-48h)觀察結果。良好的平板劃線培養后D區劃線上應有單個菌落生長，未在劃線上生長的為污染菌。觀察并記錄瓊脂平板表面生長的各種菌落，注意其大小、形狀、邊緣、表面結構、透明度、顏色等性狀，以及有無菌落溶血現象，是否有色素產生，是否有氣味等。7、器具歸位，整理工作現場將所有物品清理后規范擺放為初始狀態，對操作臺進行清潔消毒，清理廢棄物。凡是微生物實驗室的所有病理材料（含用過的培養基）均應經高壓滅菌后方可丟棄。離開前將衣物等用過的物品放在消毒間滅菌。最后再次消毒手臂后方可離開。方法步驟

一般三區劃線就能分離出單菌落，理想的三區分區劃線平板培養后的結果見右圖。第一區和第二區前部的細菌生長呈“直線”，第二區后部的細菌生長呈“虛線”，第三區呈“虛線”和離散的“小點”（即單菌落）培養效果觀察視頻觀看1.平板劃線分離培養①2.平板劃線分離培養②3.平板劃線分離培養③4.試管接種培養5.組織病料采取分析思考1.哪些操作環節容易被雜菌污染？2.劃線操作要領有哪些？微生物平板劃線分離有哪些需要注意的地方？1.超凈工作臺使用前要提前30分鐘打開紫外線燈對工作臺殺菌。有些人為了節省時間只殺菌了15分鐘，其實做實驗一定要花得起時間，不要為了省時間而節約那么幾分鐘，多開紫外線5分鐘，殺菌會更徹底。微生物平板劃線分離有哪些需要注意的地方？2.固體培養基在電熱爐上煮融后，要放在試驗臺上冷卻，期間不能打開封口的紙。等到大概冷卻至60℃時，再把固體培養基拿進超凈工作臺。微生物平板劃線分離有哪些需要注意的地方？3.培養基煮融后之所以不能馬上倒平板，是因為培養基溫度太高，冷卻后培養皿的蓋會有大量水蒸氣，最后會變成水珠留在培養皿內，會影響微生物培養。微生物平板劃線分離有哪些需要注意的地方？4.培養基倒平板后要馬上蓋上培養皿的蓋，不能開蓋冷卻，開蓋冷卻空氣中的細菌會污染培養基，用這種培養基分離微生物是得不到純的細菌的，這一點一定要注意。微生物平板劃線分離有哪些需要注意的地方？5.培養基倒平板凝固后不能馬上進行劃線，這時候培養基雖然凝固了，但是表面水分未干，此時進行劃線長出來的細菌會連成一片。所以培養基凝固后還要再等幾分鐘讓培養基表面的水分干了再進行劃線。微生物平板劃線分離有哪些需要注意的地方？6.每次從原料中取菌時，盛裝原料的容器口都要在酒精燈上來回灼燒兩遍，新的培養基在打開前也要在酒精燈的火焰上灼燒一下培養皿的邊緣。生物安全的概念與場景2020年2月14日，在新冠肺炎疫情發生的特殊背景下召開的中央全面深化改革委員會會議上，習近平總書記指出，要把生物安全納入國家安全體系，系統規劃國家生物安全風險防控和治理體系建設，全面提高國家生物安全治理能力。無處不在的生物安全對于普通公眾來說，“生物安全”更像是個學術概念，與日常生活的距離似乎有些遠。其實，生物安全在我們的周圍無處不在，它與每個人的生存與發展都密切相關。中國共產黨第十八屆中央委員會第三次全體會議決定設立中央國家安全委員會，完善國家安全體制和國家安全戰略等方面，確保國家安全。顯然，新設立的國安委必然將應對包括生物安全在內的國家安全的多樣性挑戰。生物安全的概念與場景生物安全是指生物的正常生存、發展以及人類的生命和健康不受人類開發利用活動侵害和損害的狀態---也可以說，生物安全是各種生物不受外來不利因素侵害和損害的狀態。其中，外來因素包括現代生物技術的開發和應用(如轉基因技術)，外來有害生物的引進和擴散，對人類生產和健康造成不利影響的各種傳染病、害蟲、真菌、細菌、線蟲、病毒和雜草等。生物安全的概念有狹義和廣義之分。狹義的生物安全是指防范現代生物技術的開發和應用所產生的負面影響，即對生物多樣性、生態環境及人體健康可能造成的風險。廣義的生物安全還包括重大新突發傳染病、動植物疫情、外來生物入侵、生物遺傳資源和人類遺傳資源的流失、實驗室生物安全、微生物耐藥性、生物恐怖襲擊、生物武器威脅等。生物安全的概念與場景生物安全防控面臨巨大挑戰作為當今世界快速發展的新興經濟體和生物多樣性大國，我國面臨的生物安全形勢十分嚴峻。當前，我國生物安全防控面臨的巨大挑戰主要表現為：新突發傳染病造成難以估量的生命、財產損失。2003年出現的SARS在極短的時間內傳播到全球30多個國家和地區，造成900余人死亡。新型冠狀病毒肺炎疫情肆虐，在給人體健康與生命安全造成巨大威脅的同時，也給社會經濟發展造成了難以估量的損失。外來入侵生物危害不斷加劇。隨著我國對外經濟貿易的不斷發展，新興業態不斷涌現，全國進境口岸截獲的外來有害生物也呈現出種類批次增多、蔓延范圍擴大、危害加劇的特點，對生態環境、農林生產和人體健康造成巨大危害。目前，我國共有667種外來入侵生物，每年造成的經濟損失高達數千億元。生物安全防控面臨巨大挑戰生物遺傳資源流失嚴重，國家利益蒙受巨大損失。我國是世界上生物遺傳資源特別豐富的國家，很多珍貴、稀有的生物遺傳資源起源于我國。為此，有的國家采取多種手段，不斷從我國搜集、掠奪生物遺傳資源，并通過市場、經濟和技術等手段，使作為生物遺傳資源原產國的我國變為受害國。據業內專家估計，我國生物遺傳資源的引進和輸出比例大概為1：10，流失情況嚴重。生物戰威脅將長期存在，生物恐怖襲擊不容忽視。目前，全世界至少有25個國家具有生產大規模殺傷性生物武器的能力，一些恐怖組織也具備利用生物戰劑發動恐怖襲擊的能力。利用細菌、病毒等病原微生物研制而成的生物戰劑，主要有炭疽桿菌、鼠疫桿菌、天花病毒、出血熱病毒等。敵對勢力和恐怖組織有可能把我國列為生物恐怖襲擊的對象，因此，我國面臨生物恐怖襲擊的威脅。生物安全防控面臨巨大挑戰轉基因生物的大規模應用可能產生潛在風險。我國已經批準種植的轉基因作物主要是抗蟲棉和抗病番木瓜。截至2019年年底，我國共培育成轉基因抗蟲棉新品種176個，累計推廣4.7億畝，減少農藥使用70%以上。2020年1月，我國自主研發的轉基因玉米和大豆獲得生產應用的安全證書，標志著我國轉基因產業發展進入新階段。但是，轉基因生物的大規模應用可能造成病蟲抗性增加、雜草化加劇、基因污染和生物多樣性降低等問題。黨中央高度重視轉基因生物安全問題，要求在確保安全的基礎上推進轉基因產品的產業化應用。我國生物安全管理的現狀與問題對策近年來，我國建立了適合國情并與國際接軌的生物安全行政管理體系和法律法規體系。其中，全國人大常委會制定了有關生物安全的多部法律，包括《傳染病防治法》《進出境動植物檢疫法》《野生動物保護法》等。國務院出臺了多部相關的行政法規，包括《病原微生物實驗室生物安全管理條例》《人類遺傳資源管理條例》《野生植物保護條例》等。此外，我國還制定了一系列有關生物安全管理的技術標準和規范，為保障生物安全奠定了堅實的基礎。例如，在轉基因生物安全管理方面，我國建立了涵蓋轉基因生物研究、試驗、生產、加工、經營、進口等各環節的法規體系，以及合理高效的行政管理體系和由12個部門組成的農業轉基因生物安全管理部際聯席會議制度，在安全評價、技術標準、檢測監測三個方面形成系統全面的技術支撐體系。我國生物安全管理的現狀與問題對策盡管如此，我國在生物安全管理方面仍存在以下短板：一是生物安全法律法規體系不完善。主要表現在：生物安全法尚未出臺，防止外來生物入侵、遺傳資源流失的法規尚未建立，生物安全風險評估、調查、監測、預警的標準體系尚不健全。二是生物安全預警與保障能力不足。主要表現在：生物安全科學研究人才缺乏，知識積累不足；安全監測和預警體系不健全，重大科研基礎設施缺乏，實驗條件和儀器設備亟待升級改造；對生物安全面臨的新威脅預判能力不足等。三是公眾生物安全意識薄弱。長期以來，國家相關部門對生物安全的法律法規和政策解讀不夠，新聞媒體對我國生物安全面臨的威脅形勢宣傳不夠，公眾參與生物安全培訓和管理的渠道不暢，這些都導致公眾對于生物安全這個概念感到陌生或理解不充分。我國生物安全管理的現狀與問題對策基于以上現狀，結合當前新冠肺炎疫情防控的經驗與啟示，筆者建議，不妨從以下幾個方面來提升我國的生物安全管理水平：首先，完善生物安全法律法規體系。盡快出臺“生物安全法”，制定“外來入侵生物防治條例”和“遺傳資源獲取與惠益分享條例”等法律法規；加強生物安全風險評估、調查、監測、預警的標準研發，形成系統、完備的生物安全標準體系等。其次，加強生物安全能力建設。重視新突發傳染病、動植物檢驗檢疫、生物入侵、生物多樣性保護與轉基因生物安全等領域的科學研究，并建立健全上述相關領域的風險評估和治理體系、監測預警網絡、信息共享網絡、應急管理體系和決策技術咨詢體系。我國生物安全管理的現狀與問題對策最后，普及公眾生物安全意識教育。可以針對不同受眾編寫一系列培訓材料和科普讀物，在全民國家安全教育日、大中小學課堂、愛國主義教育培訓基地等重要時間節點和場所，通過廣播、電視、網絡、現場講座、新媒體等多種形式，學習、宣傳有關生物安全的知識和技能，鼓勵、推動公眾參與生物安全信息采集、報送、監督和管理。生物安全相關概念無菌操作：無菌操作，是指在無菌室或超凈臺中進行以防止微生物進入人體或污染供試菌的操作技術。無菌操作是各種生物實驗和生產實踐中一項重要的基本操作。無菌操作應當遵循以下幾點原則：第一、進行無菌操作時，一定要進行環境清潔，將細菌、微生物清除干凈，操作區域一定要寬闊有利于操作，及時關門以免細菌、微生物的進入，嚴謹在人員行動頻繁的過程中進行。第二、進行無菌操作操作人員一定要注意著裝，穿上無菌衣，佩戴好口罩和帽子，操作前要洗手，佩戴好無菌手套再進行操作。生物安全相關概念第三、無菌物品一定要注意存放，且一定要存放在無菌的環境和容器當中，避免接觸到細菌微生物。第四、一