PCR的應用5’3’3’5’引物25’3’引物15’3’RQ熒光基團淬滅熒光基團探針探針完整時，熒光基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收，不產生熒光；1．實時熒光定量PCR技術檢測病毒核酸病毒感染的常規檢測方法是通過實時熒光PCR鑒定。實時熒光PCR擴增目的基因，需額外添加熒光標記探針(一小段單鏈DNA，可與目的基因中部序列特異性結合)。34PCR定點突變技術反向PCR技術PCR技術拓展應用PCR技術拓展應用重疊延伸PCR大引物PCR清楚兩種PCR的大致過程，能看懂圖示作答過程意義5’3’3’5’引物25’3’引物15’3’RQ熒光基團淬滅熒光基團探針探針完整時，熒光基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收，不產生熒光；1．實時熒光定量PCR技術檢測病毒核酸熒光基團R連接在探針的5’端345’3’3’5’引物25’3’引物15’3’RQ熒光基團淬滅熒光基團探針在PCR過程中，DNA聚合酶沿模板利用酶的外切酶活性將與目的基因結合的探針降解，報告基團與淬滅基團分離，報告基團發出熒光。1．實時熒光定量PCR技術檢測病毒核酸345’3’3’5’引物25’3’引物15’3’R熒光基團淬滅熒光基團探針Q1．實時熒光定量PCR技術檢測病毒核酸該反應體系中并未加入ATP，但新鏈的合成需要消耗能量，解旋的能量來自于高溫，聚合的能量來自于原料。在PCR過程中，DNA聚合酶沿模板利用酶的外切酶活性將與目的基因結合的探針降解，報告基團與淬滅基團分離，報告基團發出熒光。每擴增一次，就有一個熒光分子產生。1．實時熒光定量PCR技術檢測病毒核酸熒光強度主要與擴增次數、病毒初始數量通過實時熒光PCR檢測某冠狀病毒感染時，檢測到的熒光強度變化如圖乙，熒光到達預先設定閾值的循環數(Ct值)越小，說明病毒核酸濃度越高。熒光擴增曲線圖中平臺期出現的原因：試劑盒中的原料、引物、探針數量有限在該反應中TaqDNA聚合酶有兩個作用，一是催化DNA子鏈的延伸，形成子鏈的磷酸二酯鍵，二是催化探針水解，破壞磷酸二酯鍵√1.熒光定量PCR技術可定量檢測樣本中某種DNA的含量，其原理是在PCR體系中每加入一對引物的同時加入一個與某條模板鏈互補的熒光探針，當耐高溫的DNA聚合酶催化子鏈延伸至探針處，會水解探針，使熒光監測系統接收到熒光信號，即每擴增一次，就有一個熒光分子生成。下列敘述錯誤的是(

)A．引物與探針均具有特異性，與模板結合時遵循堿基互補配對原則B．反應最終的熒光強度與起始狀態模板DNA含量呈負相關C．耐高溫的DNA聚合酶催化DNA合成的方向總是從子鏈的5′端到3′端D．若用上述技術檢測某基因的轉錄水平，則需要用到逆轉錄酶解析：引物與探針均具有特異性，與模板結合時遵循堿基互補配對原則，A正確；模板DNA含量越高，PCR擴增過程中形成的熒光分子越多，熒光強度越大，即反應最終的熒光強度與起始狀態模板DNA含量呈正相關，B錯誤；耐高溫的DNA聚合酶催化DNA合成的方向總是從子鏈的5′端到3′端，C正確；若要用熒光定量PCR技術檢測某基因的轉錄水平，即檢測細胞中mRNA的含量，則先要將mRNA逆轉錄形成DNA再檢測，故需要用到逆轉錄酶，D正確。典例分析2．熒光PCR法根據化學發光原理可以分為染料法和探針法。染料法中特殊染料本身不發光，但是當PCR擴增的時候，染料能夠與DNA雙鏈結合從而發光，如圖1所示。探針法中除了引物外另外設置了一個探針，在探針的兩端分別帶上發光基團和淬滅基團，此時發光基團并不發光，但是當DNA通過引物合成的時候，探針被酶切降解釋放出發光基團和淬滅基團，兩種基團分開后產生熒光，如圖2所示。下列說法不正確的是(

)典例分析2．下列說法不正確的是(

)A．兩種方法均可用于目標DNA的定量分析B．與染料法相比，探針法的特異性更強C．通過適當延長引物長度和降低復性溫度可提高熒光PCR的特異性D．用熒光PCR法檢測人體是否感染病毒前不一定要先進行逆轉錄C染料法中“染料能夠與DNA雙鏈結合從而發光”，探針法中“兩種基團分開后產生熒光”，熒光強度和DNA含量成正相關，A正確。染料法中，染料不與單鏈DNA鏈結合，只要摻入DNA雙鏈中就可以發光；探針法中，只有探針結合的片段上發生擴增才能發光，探針法的特異性更強，B正確。適當延長引物長度，和引物互補配對的特定DNA序列更長，能提高熒光PCR的特異性；降低復性溫度，則引物和DNA序列更容易結合，可能發生錯誤配對，降低熒光PCR的特異性，C錯誤。檢測人體是否感染病毒前不一定要先進行逆轉錄，D正確。3.(2023·河北唐山一中高三模擬)“實時熒光定量qPCR”是新冠疫情防控的一把利刃，通常在1～2h內即可得到檢測結果。Taqman探針是實時熒光定量RT—PCR技術中的一種常用探針(如圖1)，其5′端連接熒光基團(R)，3′端連接淬滅劑(Q)。當探針完整時，R發出的熒光信號被Q吸收而不發熒光。(1)結合圖1和圖2分析，“熒光RT—PCR技術”所用的試劑盒中通常都應該含有_________酶、_____________酶、Taqman探針、引物、dNTP、Mg2＋、緩沖劑等。這種分子錄逆轉TaqDNA聚合層面的熒光RT—PCR檢測具有特異性和靈敏性都很高的特點，主要與試劑盒中的_____、______________有關。引物Taqman探針典例分析(2)根據Taqman探針功能分析，探針中堿基序列的設計應主要依據________________________________________________________________________。新冠病毒是冠狀病毒大家庭中新新冠病毒RNA內部的一段序列(或新冠病毒RNA逆轉錄形成的DNA的部分序列)的一員，其堿基序列與引起SARS的冠狀病毒堿基序列有79.5%的相似性，與流感病毒堿基相似度也較高，因此在設計Taqman探針時應篩選出該病毒特有的序列，以避免_______(填“假陰性”或“假陽性”)的出現。假陽性(3)雖然熒光RT—PCR是當前被廣泛認可的檢測手段之一，但是不斷有“假陰性”現象報道，通過上述過程分析，“假陰性”的可能原因有_____(填字母)。a.通過咽拭子取樣不規范或取樣所獲樣本量不足b.在樣本運輸、檢測中出現了損壞和污染c.病毒相應關鍵序列發生了基因突變abc典例分析2．PCR定點突變——重疊延伸PCR技術大引物PCR擬突變位點引物4引物3引物1引物22．PCR定點突變——重疊延伸PCR技術重疊延伸PCR大引物PCR擬突變位點引物4引物3引物1引物2擬突變位點引物1引物2PCR1使用引物1和引物2擬突變位點引物4引物3PCR2使用引物3和引物4PCR定點突變技術重疊延伸PCR大引物PCR擬突變位點引物4引物3引物1引物2擬突變位點引物1引物2PCR1使用引物1和引物2擬突變位點引物4引物3PCR2使用引物3和引物4擬突變位點引物1引物2第一次第一次擬突變位點引物4引物3重疊延伸PCR大引物PCR擬突變位點引物4引物3引物1引物2擬突變位點引物1引物2PCR1使用引物1和引物2擬突變位點引物4引物3PCR2使用引物3和引物4擬突變位點引物1引物2第一次第一次擬突變位點引物4引物3第二次引物2引物1第二次引物3混合，變性后雜交引物4重疊延伸PCR大引物PCR擬突變位點引物4引物3引物1引物2擬突變位點引物1引物2PCR1使用引物1和引物2擬突變位點引物4引物3PCR2使用引物3和引物4擬突變位點引物1引物2第一次第一次擬突變位點引物4引物3第二次引物2引物1第二次引物3混合，變性后雜交引物2引物3方案一：引物1引物4引物4方案二：Taq酶Taq酶Taq酶Taq酶引物4引物1分別帶有引物1和引物4（非重疊）的雜交鏈才是我們需要的。此處不需要引物互為模板和引物重疊延伸PCR大引物PCR擬突變位點引物4引物3引物1引物2擬突變位點引物1引物2PCR1使用引物1和引物2擬突變位點引物4引物3PCR2使用引物3和引物4擬突變位點引物1引物2第一次第一次擬突變位點引物4引物3第二次引物2引物1第二次引物3?引物2引物3方案一：引物1引物4引物4方案二：Taq酶Taq酶Taq酶Taq酶引物4引物1PCR3引物4引物1使用引物1和引物4大量引物4引物1擬突變位點引物4引物3引物1引物2突變前：突變后：引物3？？引物2？？互補互補GGGTTC突變成TTCGGG①②③④引物2（①）的序列和突變后的序列④完全相同怎么快速判斷引物的堿基序列？2．PCR定點突變——重疊延伸PCR技術GC互為模板和引物AT突變成GC體系1體系2體系32024南昌一模試題（節選）2024南昌一模試題（節選）mRNA:5’3’ACCUCUGUG248249250絲氨酸5’3’ACC???GUG248249250丙氨酸定點突變2024南昌一模試題（節選）mRNA:5’3’ACCUCUGUG248249250絲氨酸5’3’ACCGCUGUG248249250丙氨酸定點突變DNA1:3’5’TGGAGACACDNA2:5’3’ACCTCTGTG3’5’TGGCGACAC5’3’ACCGCTGTG定點突變TGGGACACC5’3’3’5’ACCCTGTGG反向PCR技術PCR技術拓展應用PCR技術拓展應用熒光定量PCR2．PCR定點突變——重疊延伸PCR技術重疊延伸PCR技術的主要設計思路是用具有互補配對片段的引物(圖中的引物2和3，突起處代表與模板鏈不能互補的突變位點)，分別進行PCR，獲得有重疊鏈的兩種DNA片段，再在隨后的擴增反應中通過重疊鏈的延伸獲得想要的目的基因。如某科研團隊運用重疊延伸PCR技術在水蛭素基因中的特定位點引入特定突變，使水蛭素第47位的天冬酰胺(密碼子為AAC、AAU)替換為賴氨酸(密碼子為AAA、AAG)，從而提高水蛭素的抗凝血活性。原理如下圖所示。DNA1:3’5’TTGTTAmRNA:5’3’AACAAUDNA2:3’5’TTTTTCmRNA:5’3’AAAAAG

定點突變G變TA變CA變T典例分析解析：DNA的合成方向是從子鏈的5′端向3′端延伸，據此可知，圖中限制酶a和限制酶b的識別位點分別加在引物1和引物2的5′端，A錯誤；PCR反應體系中需要加入脫氧核苷酸、耐高溫的DNA聚合酶和擴增緩沖液(含Mg2＋)等物質，B錯誤；第2輪PCR中，引物1與圖中②結合形成兩條鏈不等長的突變基因，C錯誤；在第3輪PCR結束后，會產生23＝8個DNA分子，其中含突變堿基對且兩條鏈等長的DNA分子有兩個，其他的DNA分子均是不等長的，故含突變堿基對且兩條鏈等長的DNA分子所占的比例為1/4，D正確。故選D。1.重疊延伸PCR是一種通過寡聚核苷酸鏈之間重疊的部分互相搭橋、互為模板，經過多次PCR擴增，獲得目的基因的方法。該技術在擴增較長片段的DNA、不同來源的DNA片段拼接、基因的定點誘變等方面具有廣泛的應用前景，下圖表示利用重疊延伸PCR技術擴增某目的基因的過程。下列敘述錯誤的是(

)A．引物中G＋C的含量越高，引物與模板DNA結合的穩定性越高B．在第一階段由于引物2和引物3發生堿基互補配對，因此兩者置于不同反應系統中置于不同體系原因是：引物2和引物3中存在互補配對的片段，置于同一反應體系中時，它們會發生結合而失去作用典例分析解析：DNA的合成方向是從子鏈的5′端向3′端延伸，據此可知，圖中限制酶a和限制酶b的識別位點分別加在引物1和引物2的5′端，A錯誤；PCR反應體系中需要加入脫氧核苷酸、耐高溫的DNA聚合酶和擴增緩沖液(含Mg2＋)等物質，B錯誤；第2輪PCR中，引物1與圖中②結合形成兩條鏈不等長的突變基因，C錯誤；在第3輪PCR結束后，會產生23＝8個DNA分子，其中含突變堿基對且兩條鏈等長的DNA分子有兩個，其他的DNA分子均是不等長的，故含突變堿基對且兩條鏈等長的DNA分子所占的比例為1/4，D正確。故選D。1.重疊延伸PCR是一種通過寡聚核苷酸鏈之間重疊的部分互相搭橋、互為模板，經過多次PCR擴增，獲得目的基因的方法。該技術在擴增較長片段的DNA、不同來源的DNA片段拼接、基因的定點誘變等方面具有廣泛的應用前景，下圖表示利用重疊延伸PCR技術擴增某目的基因的過程。下列敘述錯誤的是(

)C．引物1、2組成的反應系統和引物3、4組成的反應系統中均進行一次復制后，共產生4種雙鏈DNA分子D．在引物1、2組成的反應系統中，經第一階段要形成圖示雙鏈DNA，至少要經過2次復制√3種2．幽門螺桿菌是一種常見的人類致病菌，其骨架蛋白MreB通過影響脲酶活性而參與調控其致病性。為了更準確地分離出MreB蛋白，用重疊延伸PCR技術(指在PCR的基礎上，采用具有互補末端的引物，使PCR產物形成重疊鏈，通過重疊鏈的延伸，將不同來源的片段重疊拼接起來的一項技術)將幽門螺桿菌MreB基因中編碼終止密碼子前的DNA序列與TAP標簽(可以標記幽門螺桿菌基因組中任何一個基因，且不會影響基因的表達)進行連接，構建了融合表達蛋白MreB和TAP標簽的質粒，實驗流程如下圖所示。(1)重組質粒的構建①為將帶有標簽的MreB基因定向插入pK18mobsacB質粒中，需要在引物末端添加限制酶識別序列，據圖分析，在引物1末端添加的序列所對應的限制酶是________，在引物4末端添加的序列所對應的限制酶是_________。SmaⅠXhoⅠ典例分析典例3.利用重疊延伸PCR技術進行定點突變可以實現對纖維素酶基因進行合理性改造，其過程如下圖所示。下列分析不正確的是（

）A.PCR1過程中的產物AB是依賴引物a和引物b擴增的結果

B.引物c和引物b上均含有與模板鏈不能互補的堿基

C.①過程需要先加熱至90℃以上后再冷卻至50℃左右

D.②過程需要利用引物a和引物d獲得突變產物ADD典例分析在第3輪PCR結束后，含突變堿基對且兩條鏈等長的DNA占1/4(

)√4．通過引物設計，運用PCR技術可以實現目的基因的定點誘變，如圖為基因工程中獲取突變基因的過程，其中引物1序列中含有一個堿基T不能與目的基因片段配對，但不影響引物與模板鏈的整體配對，反應體系中引物1和引物2分別設計增加限制酶a和限制酶b的識別位點。典例分析在第3輪PCR結束后，會產生23＝8個DNA分子，其中含突變堿基對且兩條鏈等長的DNA分子有兩個，其他的DNA分子均是不等長的，故含突變堿基對且兩條鏈等長的DNA分子所占的比例為1/4。擬突變位點常規下游引物突變上游引物常規上游引物PCR1使用常規下游引物和突變上游引物3．PCR定點突變——大引物PCR技術大引物PCR需要用到三條引物進行兩輪PCR，這三條引物分別是突變上游引物、常規上游引物和常規下游引物。擬突變位點常規下游引物突變上游引物常規上游引物大引物PCRPCR定點突變技術PCR1使用常規下游引物和突變上游引物常規下游引物突變上游引物第一次復制3．PCR定點突變——大引物PCR技術擬突變位點常規下游引物突變上游引物常規上游引物大引物PCRPCR定點突變技術PCR1使用常規下游引物和突變上游引物常規下游引物突變上游引物第一次復制第二次復制突變上游引物常規下游引物作為下一輪PCR的大引物大引物是誘變引物的互補鏈PCR體系1得到不完整的含有突變位點的DNA片段不選另一條鏈作為大引物的原因是：以野生型DNA作為模板，另一條鏈作為大引物時無法延伸出新的子鏈。擬突變位點常規下游引物突變上游引物常規上游引物大引物PCRPCR定點突變技術PCR1使用常規下游引物和突變上游引物常規下游引物突變上游引物第一次復制第二次復制突變上游引物常規下游引物作為下一輪PCR的大引物PCR2用原始的DNA模板使用常規上游引物和大引物第一次復制常規下游引物大引物擬突變位點常規下游引物突變上游引物常規上游引物大引物PCRPCR定點突變技術PCR1使用常規下游引物和突變上游引物常規下游引物第一次復制PCR2使用常規上游引物和大引物第一次復制常規下游引物大引物第二次復制大引物常規上游引物得到完整的含有突變位點的DNA片段。大引物PCRPCR定點突變技術典例分析1.抗生素的長期使用易導致病菌產生嚴重的耐藥性。抗菌肽以其快速殺菌活性、低耐藥可能性、免疫調節特性和促進傷口愈合的潛力成為最有前景的抗菌藥物。研究發現將抗菌肽第52位的脯氨酸(密碼子為CCA)替換成蘇氨酸(密碼子為ACA)可增強抗菌肽的殺菌活性。科研人員利用大引物PCR定點誘變技術對抗菌肽基因進行改造的過程如圖所示。(1)將抗菌肽第52位的脯氨酸換成蘇氨酸，需要將mRNA的對應堿基序列中第

位的堿基替換，且基因模板鏈對應的堿基改變為

。154G變為T典例分析【詳解】A、第一輪PCR中，需要先合成一條鏈，再用這條鏈合成互補鏈，至少需要2個循環才能獲得相應的大引物模板，A正確；B、第一輪產物作第二輪PCR擴增的大引物外，第二輪PCR仍需加入的引物是另一種側翼引物，以便進行另一條鏈的延伸，B錯誤；C、若要使得目的基因可以表達出蛋白質，則需要在PCR擴增的定點誘變產物上具備啟動子和終止子，誘導基因轉錄，C正確；D、為了使兩輪PCR反應在同一支試管中進行，引物設計時應考慮不同的退火溫度，第二輪PCR的退火溫度應該比第一輪高，D正確。故選B。

反向PCR技術PCR技術拓展應用PCR技術拓展應用熒光定量PCRPCR定點突變技術1.抗生素的長期使用易導致病菌產生嚴重的耐藥性。抗菌肽以其快速殺菌活性、低耐藥可能性、免疫調節特性和促進傷口愈合的潛力成為最有前景的抗菌藥物。研究發現將抗菌肽第52位的脯氨酸(密碼子為CCA)替換成蘇氨酸(密碼子為ACA)可增強抗菌肽的殺菌活性。科研人員利用大引物PCR定點誘變技術對抗菌肽基因進行改造的過程如圖所示。回答下列問題：(2)PCR過程中溫度的控制至關重要，若變性時溫度偏低則會導致反應效率降低，原因是

。溫度偏低時DNA

雙鏈解旋不充分，延伸時模板減少，產生的產物量偏少典例分析【詳解】A、第一輪PCR中，需要先合成一條鏈，再用這條鏈合成互補鏈，至少需要2個循環才能獲得相應的大引物模板，A正確；B、第一輪產物作第二輪PCR擴增的大引物外，第二輪PCR仍需加入的引物是另一種側翼引物，以便進行另一條鏈的延伸，B錯誤；C、若要使得目的基因可以表達出蛋白質，則需要在PCR擴增的定點誘變產物上具備啟動子和終止子，誘導基因轉錄，C正確；D、為了使兩輪PCR反應在同一支試管中進行，引物設計時應考慮不同的退火溫度，第二輪PCR的退火溫度應該比第一輪高，D正確。故選B。

反向PCR技術PCR技術拓展應用PCR技術拓展應用熒光定量PCR1.抗生素的長期使用易導致病菌產生嚴重的耐藥性。抗菌肽以其快速殺菌活性、低耐藥可能性、免疫調節特性和促進傷口愈合的潛力成為最有前景的抗菌藥物。研究發現將抗菌肽第52位的脯氨酸(密碼子為CCA)替換成蘇氨酸(密碼子為ACA)可增強抗菌肽的殺菌活性。科研人員利用大引物PCR定點誘變技術對抗菌肽基因進行改造的過程如圖所示。(3)據圖分析“大引物PCR

定點誘變”技術中設計的“誘變引物”應為

。5’…CCTGTTAT…3’典例分析(4)產物1最早出現在PCR1的第

輪循環；PCR2的產物除改良的抗菌肽基因外，還有

；通過PCR3

快速擴增時應選用的引物是

。3

引物1和引物2誘變前的抗菌肽基因典例分析PCR定點突變技術1.抗生素的長期使用易導致病菌產生嚴重的耐藥性。抗菌肽以其快速殺菌活性、低耐藥可能性、免疫調節特性和促進傷口愈合的潛力成為最有前景的抗菌藥物。研究發現將抗菌肽第52位的脯氨酸(密碼子為CCA)替換成蘇氨酸(密碼子為ACA)可增強抗菌肽的殺菌活性。科研人員利用大引物PCR定點誘變技術對抗菌肽基因進行改造的過程如圖所示。(5)In-Fusion酶能夠識別任何具有15bp相同末端序列的線性DNA分子并使其形成黏性末端，實現目的基因和載體的連接。科研人員將載體(320bp)兩端連接上與改良的抗菌肽基因:(180bp)兩端相同的序列(15bp)并利用In-Fusion酶實現兩者的連接,如圖所示。最終獲得的重組DNA

分子長度為

。與傳統方法相比，這種技術的優點是

______________________。插入位點不受限制酶識別序列限制；能夠實現目的基因在載體任意位點上的插入；避免限制酶切割對質粒功能區的破壞等500bp典例分析2．大引物PCR定點突變常用來研究蛋白質結構改變導致的功能變化。單核苷酸的定點誘變僅需進行兩輪PCR即可獲得，第一輪加誘變引物和側翼引物，第一輪產物作第二輪PCR擴增的大引物，如圖表示利用大引物PCR對基因M進行定點誘變，回答下列問題。①第一輪PCR中，至少需要___個循環才能獲得相應的大引物模板。②擴增的定點誘變產物通常需具備_______________等結構才能進行轉錄③為了使兩輪PCR在同一支試管中進行，設計引物時應考慮不同的復性溫度()1和2；3和4均可以和原始模板鏈結合，且1，2，3不互補，所以可以放在一個體系中常規下游引物2常規上游引物1大引物第二輪PCR為避免1，2結合模板，而3引物很長，可穩定結合，因此適當延長1長度，并提高退火溫度2啟動子終止子√34．反向PCR擴增已知序列兩側的未知序列當DNA的某些序列已知，而需要擴增已知序列兩端的未知序列時，可采用反向PCR技術。原理是用限制酶消化該DNA，隨后使用DNA連接酶將獲得的酶切產物環化，這樣就獲得了已知序列兩側攜帶有未知序列的環狀DNA分子。以該已知序列為模板設計一對相反方向的特異性引物，該引物對已知序列反向，但對未知序列卻是相向的，從而得以擴增出未知序列。原理如下圖所示。限制酶DNA連接酶PCR定點突變技術PCR技術拓展應用PCR技術拓展應用熒光定量PCR重疊延伸PCR大引物PCR清楚兩種PCR的大致過程，能看懂圖示作答已知序列未知序列未知序列用EcoRⅠ限制酶切割已知序列未知序列未知序列自身環化4．反向PCR技術擴增已知序列兩側的未知序列注意：限制酶不可用已知序列內部的限制酶，還要產生相同粘性末端反向PCR技術已知序列未知序列未知序列用EcoRⅠ限制酶切割已知序列未知序列未知序列自身環化引物1引物2引物3引物4引物1引物2引物3引物4反向連接選哪種引物？新形成的子鏈無法成環（PCR缺少DNA連接酶）引物2引物1引物4反向PCR技術已知序列未知序列未知序列用EcoRⅠ限制酶切割已知序列未知序列未知序列自身環化引物1引物2引物3引物4反向連接選哪種引物？引物1引物2引物3引物4復制完后展開成鏈狀復制完后展開成鏈狀引物1引物2引物3引物4反向PCR技術引物1和引物2繼續擴增大量引物3和引物4繼續擴增大量例：已知基因a的一條單鏈序列為5‘—GCAATGCGTAGCCTCT…AACTATGCGCTCATGA-—3′(虛線處省略了部分核苷酸序列)，（1）則在步驟Ⅲ中選用的PCR引物是__________。A．5'—-AACTATGCGCTCATGA-—3′B．5'—-TTGATACGCGAGTACT-—3′C．5'-—GCAATGCGTAGCCTCT-—3′D．5'-—AGAGGCTACGCATTGC—-3′ADEcoRID（2）5．巢式PCR首先將目標的DNA模板與第一套引物(外引物)結合。第一套引物也可能結合到其他具有相似結合位點的片段上并擴增多種產物。但只有一種產物是目的片段(圖中未顯示可能的多種產物)。然后使用第二套引物(內引物)對第一輪PCR擴增的產物進行第二輪PCR擴增。由于第二套引物位于第一輪PCR產物內部，而非目的片段包含兩套引物結合位點的可能性極小，因此第二套引物不可能擴增非目的片段。這種巢式PCR擴增確保第二輪PCR產物幾乎或者完全沒有引物配對特異性不強造成的非特異性擴增的污染。原理如下圖所示。√3．為減少引物與模板之間的非特異性配對，人們對普通PCR進行了改良，發明了巢式PCR，其原理是利用兩套引物進行兩輪PCR擴增。首先利用第一對引物(外引物)對目的基因所在的DNA進行第一輪擴增(經過15～30次循環)，第二輪擴增以第一輪擴增產物為模板，利用第二對引物(內引物或巢式引物)結合在第一輪擴增產物內部，經過15～30次循環，獲得第二輪擴增片段(即目的基因)，最終第二輪擴增片段短于第一輪，基本過程如下圖所示。下列敘述錯誤的是(

)A．兩對引物的堿基序列不相同，但均應為單鏈DNA片段B．使用外引物至少經過3次循環，才能得到圖示的第一輪擴增產物C．若第一輪擴增產生錯誤片段，則其進入第二輪擴增的概率極低D．與巢式PCR相比，普通PCR特異性更強，錯誤率更高解析：兩對引物的堿基序列不相同，但均應為單鏈DNA片段，以便與模板互補配對，A正確；根據DNA的半保留復制的特點，可知PCR前2次循環產生的四個DNA分子的兩條鏈均不等長，第3次循環產生的DNA分子存在等長的兩條核苷酸鏈，即僅含引物之間的序列，因此，至少經過3次循環才能得到圖示的第一輪擴增產物，B正確；由于內引物擴增模板是外引物擴增后的產物，第二輪反應能否進行，也是對第一輪反應正確性的鑒定，如果第一輪擴增產生了錯誤片段，那么第二輪能在錯誤片段上進行引物配對并擴增的概率極低，C正確；巢式PCR中加入的組分與常規PCR相同，都含有模板、引物、耐高溫的DNA聚合酶、四種游離的脫氧核苷酸、緩沖液、Mg2＋等，第一輪擴增中，外引物用以產生擴增產物，此產物在內引物的存在下進行第二輪擴增，從而提高反應的特異性，獲得的產物特異性更強，D錯誤。1.臨床上常采用RT-PCR技術(以mRNA為模板逆轉錄為cDNA，再進行PCR擴增)對受試者的咽拭子取樣后進行新冠病毒核酸檢測。Q：利用RT-PCR技術獲取的目的基因不能在物種間進行交流×判斷物種間的基因交流主要依據為:一個物種的基因在另一個物種體內能否正常表達(即轉錄翻譯出相應的蛋白質).cDNA文庫是根據mRNA序列進行逆轉錄而建立的，其中保存的基因在任何物種體內都能連續編碼相應的氨基酸,從而合成出正常的蛋白質.(絕大多數生物共用一套遺傳密碼).所以不同物種之間可以通過cDNA文庫進行基因交流.但是基因組文庫是直接從一種生物體內提取DNA而建立的.而原核生物與真核生物的基因結構是不同的.原核生物的基因是連續的，全部都可以編碼蛋白質.但真核生物的基因是不連續的,分為外顯子和內含子.只有外顯子才能編碼蛋白質，而內含子是與外顯子交錯分布的.由于真核生物的基因中,編碼蛋白質的區域是不連續的.所以原核生物的基因在原核生物或真核生物之間都可以正常表達，從而可以進行物種間的基因交流.但是真核生物的基因只有在真核生物體內才能通過真核生物特有的機制正常表達,在原核生物體內不能正常表達.所以基因組文庫只能進行部分物種間的基因交流.即原核-原核，真核-真核，原核-真核生物間可以交流，但真核-原核間不能交流.2．(2024·武漢高三質檢)IKK激酶參與動物體內免疫細胞的分化。臨床上發現某重癥聯合免疫缺陷(SCID)患兒IKK基因編碼區第1183位堿基T突變為C，導致IKK激酶上第395位酪氨酸被組氨酸代替。為研究該患兒發病機制，研究人員利用純合野生鼠應用大引物PCR定點誘變技術培育出SCID模型小鼠(純合)，主要過程如圖甲、乙所示，分析并回答下列問題：(1)在圖甲獲取突變基因過程中，需要以下3種引物：引物A5′—CCCAACCGGAAAGTGTCA—3′(下劃線字母為突變堿基)引物B5′—TAAGCTTCGAACATCCTA—3′(下劃線部分為限制酶HindⅢ識別序列)引物C5′—GTGAGCTCGCTGCCCCAA—3′(下劃線部分為限制酶SacⅠ識別序列)則PCR1中使用的引物有____________，PCR2中使用的引物有______和圖中大引物的____(填“①”或“②”)鏈。引物A和引物B引物C②(3)研究人員經鑒定、篩選獲得一只轉基因雜合鼠F0，并確認突變基因已經穩定同源替代IKK基因。利用雜合鼠F0，通過雜交獲得SCID模型鼠，請將實驗步驟補充完整；①雜交親本：________________，雜交得F1；②________________得F2；③提取F2每只小鼠的基因組DNA，采用分子生物學方法，利用IKK基因探針和突變基因探針進行篩選，則_______________________________________________________________________