Maizechloroticmottlevirus--Morphologicalidentificationmetho2023-12-15發(fā)布2024-20001.4《標準編寫規(guī)則第4部分：試驗方法標準請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔識別專利的責任。本文件由中國材料與試驗標準化委員會科學2病毒之一復(fù)合侵染引起的玉米致死壞死病（cornletha番茄叢矮病毒科（Tombusviridae）、玉米褪綠斑駁病毒屬（Machlomovirus附錄A）。應(yīng)用透射電米褪綠斑駁病毒形態(tài)學檢測診斷工作，特制定該病毒透射電子顯微鏡形態(tài)學檢測方法的標準。玉米褪綠斑駁病毒形態(tài)學檢測透射電子顯微鏡法可能的安全問題。使用者有責任采取適當?shù)陌踩徒】荡胧┫铝形募械膬?nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適GB/T31810玉米褪綠斑駁病毒檢疫JY/T0581透射電子顯微鏡分析方一種嚴重侵害玉米等作物的檢疫性植物病毒4利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理在超微結(jié)構(gòu)水平上定位、定性及半定量顯示抗原的技術(shù)方法，分超薄切片術(shù)ultrathinsectio采用超薄切片機把經(jīng)過包埋后的樣品切成厚度為50nm~100nm5儀器設(shè)備、試劑和材料、實驗室資質(zhì)及環(huán)境條件5）；）；）；）；5.3.1實驗室安全資質(zhì)：植物病毒對于哺乳動物和人不具感染性，本文件規(guī)定的實驗操作可以在普通5.3.2環(huán)境條件：超薄切片機、透射電鏡應(yīng)安裝在獨立的房間內(nèi)，工作環(huán)境應(yīng)符b)透射電鏡：相對濕度小于60%，溫度（20±5）℃,電源電壓（220±22）V，電源頻率（50±1）66.2.2進出境植物檢疫的取樣按SN/T21待檢種子樣品可保存于室溫或4℃冰箱內(nèi)；用于超薄切片的葉片樣品應(yīng)保濕存放于4℃冰箱內(nèi)，其它病株樣品可在-20℃以下冰箱凍存。種子樣品在室6.4.1組織粗汁液樣品：將玉米葉片組織加等體積0.05mol/L磷），也可以在適當溫度和光照條件下使其發(fā)芽后再制備獲取組織6.4.2提純病毒樣品：將分離提純的MCMV樣品用雙蒸6.4.3超薄切片樣品：選擇有明顯褪綠斑駁癥狀的玉米葉片，用雙面刀片切取病葉的褪綠斑駁邊緣部色，染色時間1min~2min，用濾紙片從銅網(wǎng)邊緣吸掉多余染色液，干燥后待檢。漂浮法：在培養(yǎng)皿內(nèi)鋪封口膜，用移液器吸一滴病毒樣品液體滴在封口膜上，將銅網(wǎng)膜面朝下倒扣在病毒懸液滴上靜置1min~2min，然后夾起銅網(wǎng)，用濾紙片從網(wǎng)倒扣在2%磷鎢酸負染色液滴（pH6.8）上進行負染色，染用濾紙片吸掉抗體余液后，將銅網(wǎng)膜面朝下放置于病毒樣品懸液滴上，在培養(yǎng)皿中保濕反應(yīng)30min（如種子的病毒含量低，反應(yīng)時間可延長至數(shù)小時或7用濾紙片吸除余液后，用2%磷鎢酸戊二醛固定液中前固定2h（4℃)。戊二醛固定液配制參見附錄B。漂洗：用0.1mol/L磷酸緩沖液充分漂洗三次，每次10min~15min。后固定：經(jīng)過漂洗后的樣品置于0.1mol/L磷酸緩沖液（pH7min，然后用100％丙酮脫水2次，每次30min。浸透與包埋：樣品脫水后在丙酮：包埋劑（1：1）浸透1h1：3）浸透3h，然后在純包埋劑中浸透過夜，用膠囊或包埋管進行樣品包埋。推薦采用Spurr低粘度包埋劑，其配制修塊和定位：聚合后的包埋塊修成易于超薄切片的形狀，然后在超薄切片機上用玻璃刀進行超薄切片：修塊和定位后的包埋塊在超薄切片機上用玻璃刀或鉆石刀切成超薄切片，切片厚染色：采用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛在室溫下對超薄切片進行雙重染色，醋酸雙氧鈾染色時間7.2.1按照透射電鏡操作程序開機，抽真空至正常工作狀態(tài)，精確合軸，消除聚光鏡和物鏡像散，使7.2.3推薦加速電壓范圍：60kV7.2.4推薦放大倍率范圍：4,000×~50,000×。度較大斑塊，觀察樣品全貌。逐步提高放大倍率，仔細尋找直徑30nm的球狀病毒粒子，由于田間樣品nm線狀病毒粒子。種子樣品中的病毒含量通常較低，電鏡視野下可觀察到的病毒粒子較少。病毒粒子圖像精細聚焦后用CMOS或CCD相機記錄并儲存。MCMV病毒粒子的典型形態(tài)見附錄8現(xiàn)病變的細胞。逐步提高放大倍率，仔細觀察細胞超微結(jié)構(gòu)的異常變化。在MCMV侵染的病變細胞中可以觀察到大量直徑30nm典型的球狀病毒粒子分布在細胞質(zhì)內(nèi)，局部還有結(jié)晶狀排列的病毒構(gòu)中積累了大量纖維狀物質(zhì)，后期線粒體崩解，纖維狀物質(zhì)釋放到細胞質(zhì)。MCMV感染的細胞圖像精確聚焦后用CMOS或CCD相機記錄并儲存。感染MCMV的病變細胞特征和健康對照圖片見附錄C。產(chǎn)生周邊復(fù)制小泡，根據(jù)這些細胞形態(tài)學特征就可判MCMV檢測過程中使用過的樣品材料，在檢測完畢后需要進行消毒和無害化處理。送檢種子樣品保存在4℃冰箱內(nèi)，病葉樣品保存在-20℃以下冰箱或凍干保存三個月備查，保存期滿后及時進行滅活9檢測報告j)檢測報告的頁碼；）：）：）：種（Species）：玉米褪綠斑駁病毒（Maizechloro玉米褪綠斑駁病毒的自然寄主為玉米，還可侵染小麥、病毒引起褪綠斑駁、壞死、矮化、穗發(fā)育差或無穗、過早死亡等癥狀。常與甘蔗花葉病毒等馬鈴病毒易通過機械接種傳播，也可以經(jīng)種子、介體葉甲、薊馬傳毒，在田間擴散容易。分布于阿根廷、墨西哥、秘魯、美國，在東非和東南亞地區(qū)也有發(fā)現(xiàn)，200MCMV具有中等到強的免疫原性，在凝膠擴散中形成單條沉淀線，與其他一些禾谷類植物病毒無病毒粒子為等軸對稱二十面體（T=3直徑為30pH6穩(wěn)定，可由二價陽離子穩(wěn)定。單分子正義單鏈RNA，長度為4437nt。RNA的3'端無Poly（A5'端可能是未加帽的。病毒基因3超讀產(chǎn)物的功能尚不清楚，ORF2編碼蛋白及其超讀產(chǎn)物可能是病毒的大量病毒粒子分布在細胞質(zhì)中；過氧化物酶體增生并聚集，形成周邊復(fù)制A液：0.2mol/L磷酸二氫鈉水溶液NaH2PO4.H2OB液：0.2mol/L磷酸氫二鈉水Na2HPO4.2H2O35.61g（或Na2HPO4.12H2O不同pH值磷酸緩沖液貯存液配制見表B.1，pH值468將裝有四氧化鋨晶體的安瓿（0.5g）清洗干凈，用玻璃劃割器在上面刻痕，再用雙次，放入潔凈棕色廣口瓶內(nèi)，加上25mL雙蒸餾水，用潔凈玻璃棒搗破安瓿，快B.2.2.20.1mol/L磷酸緩沖液配制的四氧化鋨固B.3.1Spurr低黏度包埋劑配制見表B.3。NSA8888327B.3.2按表B.3比例將前三種成份混合均勻，再加DMAE催化劑攪拌。配好的包埋劑在低溫和防潮狀稱取1g磷鎢酸，用50mL雙蒸餾水配制成2%的水溶液，用1mol/L低鹽的病毒提純試樣也可用飽和醋酸雙氧鈾水溶液進行負染色，具有更高的圖像分辨率。飽和醋酸雙氧鈾負染色液用雙蒸餾水配制，pH值4.2，室溫下避光保B.4.3.1醋酸雙氧鈾染色液：用50%乙醇配制成1%~3%的飽和溶液B.4.3.2檸檬酸鉛染色液：稱取硝酸鉛1.33g、檸檬酸三鈉1.76g，放入50mL容量瓶中，加預(yù)先煮沸過AACBBDBDACBDACBABA本文件起草單位：浙江大學，云南省農(nóng)業(yè)科學院，拱北海關(guān)技術(shù)中心，上海海關(guān)動植物與食本文件主要起草人：洪健，謝禮，王華，李云琴，尚衛(wèi)娜，吳建祥、張仲凱、張衛(wèi)東、于InternationalCommitteeonTaxonomyofViruses(2020).ArchivesofVirology,2020,165:2737-2748.[3]LiXie,JingzeZhang,QiangWang,ChunmeiMeng,JianHong,XuepingZhou.CharacterizationofMaizechloroticmottlevirusAssociatedwithMaizeLethalNecrosisDiseaseinChina.Phytopathol.2011,159:191-193.[4]QiangWang,ChunyanWang,ZhengheLi,JianHong,