生物工程專業(yè)綜合實驗

第一部分

操作性實驗人參發(fā)根培養(yǎng)及皂苷含量分析

第一節(jié)發(fā)根的由來1.發(fā)根培養(yǎng)體系的建立

發(fā)根是由發(fā)根農(nóng)桿菌Agrobacteriumrhizogenes,侵染植物創(chuàng)傷部位細胞，轉(zhuǎn)化并整合發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒上的一段基因到植物細胞中，這段基因的表達導(dǎo)致細胞分化形成發(fā)根。嚴格來說是一種植物疾病。它是一個革蘭氏陰性土壤細菌。

發(fā)根生長快，不依賴于激素，可被開發(fā)成生產(chǎn)植物次生代謝產(chǎn)物的有效資源。

此外，發(fā)根可以在一定條件下再生成對應(yīng)的整株植物，而且發(fā)根的基因和代謝性狀比較穩(wěn)定。圖1發(fā)根形成原理示意圖圖2人參發(fā)根發(fā)根誘導(dǎo)圖第二節(jié)

實驗流程、目的、原理及注意事項實驗內(nèi)容概要圖3實驗內(nèi)容概要1.人參發(fā)根培養(yǎng)1.1實驗的目的及意義（1）掌握植物組織（發(fā)根）的培養(yǎng)方法及生長數(shù)據(jù)的測定及曲線繪制方法。（2）了解植物組織（發(fā)根）的形成原理；（3）了解發(fā)根生長過程形態(tài)變化。1.2實驗原理人參發(fā)根是發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)人參創(chuàng)傷組織而形成的無性系、不依賴于激素、可無限增殖的根組織，在MS培養(yǎng)基上發(fā)根可以利用其大量和微量元素及碳源快速成長并合成皂苷。1.3具體流程1.3.1培養(yǎng)基配制滅菌

采用1/2MS成品培養(yǎng)基，按藥品說明配制（2.47g1/2MS成品，30g蔗糖，定容到1000ml，充分溶解15-20min），用1mol/L的NaOH或HCl調(diào)酸堿度為pH5.8（用精密pH試紙或pH計），培養(yǎng)基分裝到500ml三角瓶100ml/瓶；封口膜封口后，116攝氏度高壓滅菌30min，冷卻至室溫備用。1.3.2接種

取1/2MS培養(yǎng)好的人參發(fā)根，手術(shù)刀于滅菌平皿中切取約1-2cm發(fā)根10根約0.5g，接種到滅菌冷卻后的500ml三角瓶中，25℃搖床110rpm培養(yǎng)。備注：若需固體培養(yǎng)保存發(fā)根，在液體培養(yǎng)基中加入12g/L瓊脂即可。1.3.3生長數(shù)據(jù)及曲線繪制

每組接種15瓶（視情況可適當縮減瓶數(shù)最少10瓶）視發(fā)根提供量靈活掌握，起始接種量不用精確，每隔5天（周期30-35天），取10（或6）瓶測定發(fā)根濕重（在無菌室或超凈臺上，用滅菌鑷子取出，在滅菌濾紙上吸干，于滅菌平皿或濾紙上稱量，注意去皮），稱量后繼續(xù)放回原三角瓶培養(yǎng)。若發(fā)根后期量大不好用鑷子取出則用滅菌移液器把液體抽出，稱重發(fā)根和三角瓶總重后再把培養(yǎng)液放回，這一步一定要注意在裝培養(yǎng)基前稱量三角瓶的重量并編號記錄。

數(shù)據(jù)用3次平均后記錄并以時間d為橫坐標發(fā)根濕重為縱坐標繪制生長曲線(理論上培養(yǎng)3瓶即可，多測定幾瓶主要考慮的是操作染菌裕度）。并依據(jù)含水率繪制干重曲線。圖4生長曲線例圖1.3.4儀器及試劑試劑耗材備注儀器備注1/2MS培養(yǎng)基、蔗糖

三角瓶500ml及封口膜和繩

酒精棉球

平皿90

圓形濾紙和平皿配套

手術(shù)刀及刀架

稱量紙、滅菌包裹用紙，如報紙或錫紙

醫(yī)用鑷子、玻璃棒、容量瓶、膠頭滴管、移液管、試劑瓶

pH試紙精密含5.8

精密電子秤

蒸餾水、無水乙醇

搖床

口罩

無菌室或超凈臺、酒精燈、打火機

滅菌鍋

吹洗瓶

標簽、鉛筆，標記筆等標記工具

表1.1發(fā)根培養(yǎng)所需試劑儀器2.人參發(fā)根總皂苷提取及含量分析2.1實驗的目的意義（1）掌握植物組織（發(fā)根）生物活性物質(zhì)皂苷提取的基本步驟；（2）掌握分光光度儀測定生物活性物質(zhì)皂苷的基本操作。2.2實驗原理（1）利用皂苷可溶于有機溶劑酒精，把皂苷從發(fā)根中通過回流提取到酒精中。（2）香草醛比色原理：高氯酸將甙元的酚羥基氧化為羧基,增加1個雙鍵結(jié)構(gòu),再經(jīng)雙鍵位移,雙分子縮合等反應(yīng)生成共軛雙鍵系統(tǒng),又在酸的作用下形成陽碳離子鹽而顯色，從而用比色法測定。1.4.1皂苷提取（1）發(fā)根用蒸餾水沖洗干凈，濾紙吸干發(fā)根表面水分；烘箱烘干至恒重60oC（約3h），粉末置于干燥器中干燥保存?zhèn)溆谩渥ⅲ哼@一步最好與前一部分最后實驗銜接好時間。（2）干燥的發(fā)根研缽細細研磨成粉末，精確稱取1g粉末，置入試管，配置并加入70%酒精20mL，70oC水浴回流提取3h。（3）放置冷卻至室溫，800rpm離心3min，取上清液，雙層濾紙過濾，用70%酒精和容量瓶重新定容到20mL。（4）取2ml提取液置入試管或比色管水浴80oC揮去乙醇后（約30-60min，成膏狀即可），按標準曲線里的比色法測定皂苷含量，依據(jù)回歸方程計算含量。同時另取2ml同法揮去乙醇，用甲醇重定容到1ml，為最后一部分的色譜分析提供待測樣品。（做3組平行數(shù)據(jù)平均，也就是取3次2ml進行實驗）2.2標準曲線制作（1）精準稱量人參皂苷Re標準品10mg，后加甲醇定容至5mL，加水稀釋成0.5mg/mL標準液。（昂貴藥品5組做1次即可）（2）精準稱量標準品溶液0mL、0.04mL、0.08mL、0.12mL、0.16mL、0.20mL放在比色管或具塞試管中揮干（50度-20-30min）。（3）取準備好的5%(5g/100ml)的香草醛冰醋酸溶液0.2mL，高氯酸0.8mL，并將其移取至6支揮干的具塞試管之中，保持65℃的恒溫，加熱，取出用自來水降溫3min，加入冰醋酸5mL，混勻，放置5-10min。（4）在波長546nm處檢測吸光度。將吸光度（A）作為縱坐標，標準溶液Re的濃度（C）為橫坐標，繪制出標準曲線，得出回歸曲線方程。*****注意：3組平行數(shù)據(jù)的平均，和空白對照***。2.3試劑及儀器表2.1發(fā)根皂苷分析需試劑儀器試劑備注儀器備注無水乙醇

圓底燒瓶、研缽、洗瓶

人參皂苷Re

冷凝回流管及配套膠管和圓底燒瓶配套冰醋酸

水浴鍋、分光光度儀、電子秤

香草醛

燒杯

高氯酸

比色管或具塞試管、試管架

甲醇

容量瓶5ml，20ml

蒸餾水

移液管、移液槍

烘箱、干燥器、及干燥劑

小型抽濾裝置及漏斗和配套濾紙

3.皂苷液相色譜分析3.1實驗?zāi)康囊饬x（1）掌握液相色譜分析生物活性物質(zhì)皂苷的基本原理及操作3.2實驗原理

利用高壓輸液泵將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，經(jīng)進樣閥注入待測樣品，由流動相帶入柱內(nèi)，在柱內(nèi)各成分移動速度不同而被分離，分離后依次進入檢測器進行定性或定量檢測，從而實現(xiàn)對試樣的分析。圖5液相色譜分析流程3.3具體流程（1）稱取0.5mg皂苷Re甲醇定容至1mL；用0.45μm膜過濾（注射式）；（2）準備流動相乙腈：水（19：81，v/v）300mL；用0.45μm膜過濾；（3）開機，流動相接入排氣，2min沖洗5.0ml/min；（4）按色譜條件設(shè)定參數(shù)，柱溫：25℃，檢測波長：203nm，流速：1.0mL/min；（5）上樣10μL，自動數(shù)據(jù)采集，注意觀察Re的峰值，此外做一組空白對照(甲醇10μL)分析；依據(jù)空白對照，找出Re峰，并記錄標準峰出峰時間和峰面積。（6）取前述2ml提取液揮干物質(zhì)，甲醇重定容1ml，膜過濾后取10μL上樣，對照標準峰，計算皂苷含量。（7）用純甲醇試劑沖洗系統(tǒng)，1.0ml/min沖洗40分鐘后，關(guān)機。含量計算：

標準品濃度C1，進樣量體積V1，得到一定的液相峰面積S1；待測樣品進樣量體積V2，得到一個峰面積S2。圖6色譜峰3.4試劑儀器表3.1發(fā)根皂苷色譜分析需試劑儀器試劑備注儀器備注乙腈

注射過濾器

甲醇

微膜大量過濾器0.45μm膜

0.45μm膜

色譜柱和液相色譜儀

人參皂苷Re

電子秤

4.注意事項（1）嚴格遵守實驗室規(guī)章，儀器設(shè)備操作要按照實驗室老師的要求和規(guī)程進行。操作過程要仔細認真。（2）安全：操作過程要仔細謹慎避免試劑特別是有毒試劑（如本實驗中的甲醇、乙腈）誤入口中或撒濺到眼睛、皮膚或衣服上，試劑瓶上都標有毒性級別，應(yīng)注意。應(yīng)佩戴口罩。廢棄物處理要科學(xué)規(guī)范。無菌室或超凈臺必須關(guān)閉紫外線后再行操作，烘箱需有人值守避免起火。（3）發(fā)根培養(yǎng)是無菌培養(yǎng)，要注意每個操作環(huán)節(jié)的無菌要求，避免染菌。（4）提前預(yù)習(xí)，每次實驗前規(guī)劃好細化的實驗步驟、方法,并把握實驗每一細節(jié)。班長負責(zé)分組，組長負責(zé)各人分工，配合協(xié)作完成任務(wù)。（7）數(shù)據(jù)記錄及處理：每個實驗節(jié)點的實驗數(shù)據(jù)、實驗現(xiàn)象（最好圖片記錄）都要實時、實事求是的記錄；養(yǎng)成科學(xué)嚴謹?shù)膽B(tài)度。不得捏造和篡改實驗數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)者直接計零分。

皂苷分析必須做空白對照Control。&實驗數(shù)據(jù)應(yīng)為3次或以上的平均值。第二部分設(shè)計性實驗1.設(shè)計性實驗題目及主要步驟1.1設(shè)計性實驗的題目：（1）植物發(fā)根誘導(dǎo)；（2）培養(yǎng)條件對植物發(fā)根主要活性物質(zhì)含量的影響。兩個題目任選其一，完成《設(shè)計性實驗項目申請書》,字數(shù)不少于3000。1.2步驟概要：

（1）查閱相關(guān)文獻選定具體題目：如“桔梗發(fā)根誘導(dǎo)”、Tween-80對柴胡發(fā)根皂苷含量的影響”等。（2）充分閱讀文獻，設(shè)計實驗方案，按實驗教學(xué)中心提供的項目申請書模板充實相關(guān)內(nèi)容。（3）

按格式完成實驗項目申請書（結(jié)合申請書模板講解）。

特別說明：參考文獻要按國標引用和列出。

可以用參考文獻管理軟件，如