ICS65.020.20江蘇省地方標(biāo)準(zhǔn)DB32/T5099—2025甘藍(lán)類蔬菜黑斑病菌分子檢測(cè)技術(shù)規(guī)程TechnicalcodeofpracticeformoleculardetectionofAlternariabrassicicolaoncolevegetables2025-03-25發(fā)布2025-04-25實(shí)施江蘇省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)發(fā)出布版Ⅰ前言 Ⅲ 2規(guī)范性引用文件 3術(shù)語(yǔ)和定義 4縮略語(yǔ) 6試劑和材料 7儀器設(shè)備 8試驗(yàn)步驟 9結(jié)果判定 附錄A（資料性）甘藍(lán)類蔬菜黑斑病 附錄B（規(guī)范性）RPA產(chǎn)物電泳圖 Ⅲ本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由江蘇省園藝標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)提出、歸口并組織實(shí)施。本文件起草單位：江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院、江蘇省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣總站、江蘇益禾農(nóng)業(yè)科技有限公司。1DB32/T5099—2025甘藍(lán)類蔬菜黑斑病菌分子檢測(cè)技術(shù)規(guī)程本文件規(guī)定了甘藍(lán)類蔬菜黑斑病菌分子檢測(cè)的原理、試劑和材料、儀器設(shè)備、試驗(yàn)步驟和結(jié)果判定。本文件適用于甘藍(lán)類蔬菜葉片、花莖、角果等部位黑斑病菌的分子檢測(cè)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法SN/T2965植物病原真菌分子生物學(xué)檢測(cè)規(guī)范3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1蕓薹生鏈格孢Alternariabrassicicola引起甘藍(lán)類蔬菜黑斑病的主要病原，屬半知菌亞門，絲孢目，暗色菌科，鏈格孢屬。注：甘藍(lán)類蔬菜黑斑病癥狀及病原菌形態(tài)特征見附錄A。4縮略語(yǔ)下列縮略語(yǔ)適用于本文件。DNA：脫氧核糖核酸（Deoxyribonucleicacid）PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerasechainreaction）RPA：重組酶聚合酶擴(kuò)增（Recombinasepolymeraseamplification）Tris：三羥甲基氨基甲烷[Tris（hydroxymethyl）aminomethane]TAE：三羥甲基氨基甲烷/乙酸/乙二胺四乙酸（Tris/aceticacid/ethylenediaminetetraaceticacid）5原理重組酶聚合酶擴(kuò)增是一種快速分子檢測(cè)技術(shù)，主要依靠重組酶、單鏈結(jié)合蛋白和鏈置換DNA聚合酶，在特定恒溫條件下實(shí)現(xiàn)對(duì)甘藍(lán)類蔬菜黑斑病菌靶標(biāo)序列的高效擴(kuò)增。RPA反應(yīng)開始時(shí)，重組酶在三磷酸腺苷的參與下結(jié)合引物，形成重組酶?引物復(fù)合體。這些復(fù)合體能夠掃描與引物序列互補(bǔ)的目標(biāo)雙鏈DNA，然后侵入5′端位點(diǎn)，隨后單鏈結(jié)合蛋白與被置換單鏈結(jié)合使其穩(wěn)定。最后鏈置換DNA聚合酶結(jié)合在核酸蛋白復(fù)合體的游離3′端，進(jìn)行鏈延伸。以上步驟循環(huán)進(jìn)行，實(shí)現(xiàn)甘藍(lán)類蔬菜黑斑病菌靶標(biāo)序列的指數(shù)式擴(kuò)增。26試劑和材料6.1水：實(shí)驗(yàn)室用水符合GB/T6682的規(guī)定。6.2RPA所用的引物序列見表1。表1引物序列引物正向引物CAGACATGAACACGCCAACATGACTAGACC反向引物GTGAGGCTTAGCGTAGAGTGTCAACGGTTC6.4基因組DNA提取試劑盒。6.5RPA試劑盒：包含A緩沖液、B緩沖液和含有凍干粉劑的反應(yīng)管。6.8瓊脂糖。6.9核酸染料。6.11微量移液器配套的帶濾芯吸頭。7儀器設(shè)備7.2臺(tái)式低溫高速離心機(jī)：轉(zhuǎn)速≥13000r/min，溫度4℃可控。7.4PCR儀或恒溫水浴鍋。7.54℃冰箱和-20℃冰箱。7.6水平電泳儀。7.7凝膠成像儀。8試驗(yàn)步驟8.1樣品采集樣品保存于4℃冰箱，保存期不超過(guò)48h。8.2樣品處理按照SN/T2965的規(guī)定處理樣品，處理后的樣品置于液氮中充分研磨，稱取約100mg于1.5mL離心管中，使用基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，保存于-20℃冰箱備用。38.3RPA反應(yīng)以提取的樣品基因組DNA為模板，采用DNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行RPA反應(yīng)。同時(shí)設(shè)置以下對(duì)照：陽(yáng)性對(duì)照中添加蕓薹生鏈格孢基因組DNA作為模板；陰性對(duì)照中添加健康甘藍(lán)類蔬菜葉片來(lái)源的基因組DNA作為模板；空白對(duì)照中添加滅菌超純水作為模板。檢測(cè)體系見表2。表2蕓薹生鏈格孢RPA檢測(cè)反應(yīng)體系組分體積/μLA緩沖液正向引物（10μmol/L）2反向引物（10μmol/L）2模板2滅菌超純水B緩沖液總體積依次向含有凍干粉劑的反應(yīng)管中加入上述組分，充分混勻后置于PCR儀或恒溫水浴鍋中，38℃孵育30min。反應(yīng)結(jié)束后加入等體積DNA抽提液，4℃條件下以不低于13000r/min的轉(zhuǎn)速離心5min，轉(zhuǎn)移上清至新的離心管中。配制1×TAE緩沖液和1%瓊脂糖凝膠（每50mL瓊脂糖溶液中加入5μL10000×核酸染料用微量移液器各吸取5μLDL2000DNAmarker和10μL上清點(diǎn)樣，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。9結(jié)果判定9.1試驗(yàn)成立條件試驗(yàn)成立應(yīng)符合附錄B的要求，即陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)目的條帶，陰性對(duì)照和空白對(duì)照無(wú)目的條帶；如陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照任意一項(xiàng)不滿足以上條件，此次試驗(yàn)視為無(wú)效。9.2試驗(yàn)結(jié)果判定被檢樣品出現(xiàn)目的條帶，判為檢出蕓薹生鏈格孢，否則判為未檢出。4DB32/T5099—2025（資料性）甘藍(lán)類蔬菜黑斑病A.1甘藍(lán)類蔬菜黑斑病癥狀甘藍(lán)類蔬菜的葉片、花莖和角果均能發(fā)病。該病多發(fā)生在外葉上，發(fā)病初期在葉面上產(chǎn)生黑色小斑30mm，具明顯的同心輪紋，并伴有黃色暈環(huán)，濕度大時(shí)病斑上產(chǎn)生黑色霉層。后期葉片上多個(gè)病斑匯合，有時(shí)中間穿孔或破裂。花莖、角果染病，則現(xiàn)出黑褐色長(zhǎng)梭形條狀斑，導(dǎo)致結(jié)實(shí)少或種子瘦癟。A.2病菌生物學(xué)特性蕓薹生鏈格孢的菌落（見圖A.1）呈青褐色，氣生菌絲少，易產(chǎn)生孢子。分生孢子梗單生或簇生，常見直立生長(zhǎng)，少見屈膝狀彎曲。分生孢子常串生，倒棍棒狀，淡褐色至深褐色，具橫膈膜1個(gè)~11個(gè)，縱、斜標(biāo)引序號(hào)說(shuō)明：A——蕓薹生鏈格孢的菌落形態(tài)；B——蕓薹生鏈格孢的孢子形態(tài)。圖A.1蕓薹生鏈格孢菌落和孢子形態(tài)5DB32/T5099—2025