目錄中文摘要……………ⅠAbstract……………Ⅱ引言……………………11材料與方法…………41.1材料………………41.2方法………………41.2.1細菌的分離純化………………51.2.2細菌的鑒定……………………61.2.3藥敏試驗………………………72結果…………………82.1細菌的分離培養和形態學觀察…………………82.2生化鑒定…………92.3PCR鑒定…………92.4藥敏試驗………………………103討論………………13致謝…………………14參考文獻……………15圖1細菌在麥康凱培養基上的形態………………8圖2革蘭氏染色后顯微鏡下的形態………………9圖3987P引物片段擴增結果……………………10圖4藥敏試驗抑菌圈……………11表1上、下層普通營養瓊脂培養基以及營養肉湯培養基配料表………………5表24種致病性大腸桿菌毒力基因PCR引物………7表3分離菌株的生化鑒定…………9表4分離菌株藥敏試驗結果……………………11引言大腸桿菌（Escherichiacoli），又叫大腸埃希氏菌，屬于腸桿菌科埃希氏菌屬，是短桿菌，它的兩端呈鈍圓形，大小一致，革蘭氏染色下呈現紅色，為革蘭氏陰性菌，一般情況下多是單一或兩個存在，但不會排列成長鏈。大多數的大腸桿菌具有莢膜，但是不能形成芽孢，多數的大腸桿菌菌株長有菌毛。在不同的培養基上大腸桿菌呈現的生長情況也不一樣，在普通瓊脂平板上會長出灰白色的露珠樣的光滑、隆起、邊緣整齊的菌落，在麥康凱培養基上，會長出紅色圓形菌落，在伊紅美藍瓊脂平板上會長出帶金屬光澤的紫黑色菌落，在三糖鐵瓊脂培養基上會呈現出斜面底部為黃色，產生氣體的現象。大腸桿菌的生化代謝是很活躍的。大腸桿菌可以發酵葡萄糖，絕大多數產酸產氣，還可以發酵很多種碳水化合物，也可以利用多種有機酸鹽。在常用生化特性檢測項目中，甲基紅試驗呈陽性，吲哚試驗為陽性，尿酸酶和氧化酶呈陰性，檸檬酸鹽利用呈陰性。根據這些形態學特征和生化特征可以對大腸桿菌進行初步的鑒定。大腸桿菌的種類很多，采用不同的分類方法可將其分為不同的類型。按照致病作用進行分類，可分為致病性大腸桿菌和非致病性大腸桿菌，其中致病性大腸桿菌主要有六類，即能夠致使胃腸道感染的腸道致病性的大腸桿菌(EPEC)、腸道產毒素性的大腸桿菌(ETEC)、腸道侵襲性的大腸桿菌(EIEC)、腸道出血性的大腸桿菌(EHEC)、腸集聚性的大腸桿菌(EAEC)以及近年來發現的腸產志賀樣毒素同時具有一定侵襲力的大腸桿菌(ESIES)。另外，還有能夠致使尿道感染的尿道致病性的大腸桿菌(UPEC)，以及最新命名的腸道集聚性的黏附大腸桿菌(EAggEC)REF_Ref18915\r\h[1]。按溶血性來分，根據大腸桿菌的感染性狀能否產生溶血素和有無溶血的能力，可將大腸桿菌分為兩大類:即溶血性的大腸桿菌和非溶血性的大腸桿菌REF_Ref18915\r\h[1]。另外，按產腸毒性分類，根據大腸桿菌在感染過程中能否產生腸毒素，將大腸桿菌分為產腸毒素性的大腸桿菌和非產腸毒素性的大腸桿菌REF_Ref18915\r\h[1]。大腸桿菌是自然界中普遍存在的一種細菌，在人和動物的體內和體外均存在，但一般不導致疾病的發生，屬于在動物腸道內的正常寄生菌，只有少數產腸毒素的大腸桿菌會導致人和動物的腸道疾病，屬于人畜共患病。在養殖行業中，主要感染豬，雞等家畜家禽，是非常嚴重的致病菌，危害幼齡動物，而且發病率高，致死率也高，對養殖行業危害非常大，令養殖戶和豬場損失嚴重。致病性大腸桿菌能引起溫血動物的腹瀉，主要表現腸炎、腸毒血癥等多種臨床癥狀。仔豬黃白痢發生于1周齡內初生仔豬拉黃痢和30日齡內仔豬拉白痢為特征的急性致死性傳染病REF_Ref23306\r\h[2]。仔豬黃痢發病的集中日齡在1～7日齡，通常是出生幾小時至１周齡的新生仔豬易發，尤其是1～3日齡最易發病，其中初產青年母豬所產的仔豬更容易發病。在一窩新生仔豬中，剛出生后的體溫正常，短時間內就會突然有1～2頭表現出明顯衰弱，快速死亡，隨后其他仔豬陸續出現發病，排出黃白色或者黃色的漿糊狀稀便，其中混雜凝乳碎片，體型快速消痩，最終死亡REF_Ref25034\r\h[3]。仔豬白痢的發病日齡為10～30日齡，主要特征是下痢，排出灰白色或者乳白色的糊狀稀糞，并散發腥臭味。病豬往往突然持續腹瀉，機體日漸消痩，發育減緩。部分能夠自愈，但往往反復發作，容易變為僵豬REF_Ref25034\r\h[3]。仔豬的水腫病也是由大腸桿菌引起的，通常是斷奶前后仔豬易發，主要特征是突然出現發病，頭部發生水腫，共濟失調，驚厥以及麻痹。通常是臉部、眼瞼、結膜以及齒齦發生水腫，有時可見頸部、腹部皮下也發生水腫REF_Ref25034\r\h[3]。通常不會整窩出現發病，發病率較低，一般在4%左右，但死亡率能夠達到80%～100%，且康復率非常低，目前還沒有研制出特異性藥物REF_Ref13177\r\h[4]。這三種大腸桿菌導致的疾病，在新生仔豬時期非常常見，由于新生仔豬免疫系統還沒有健全，對環境的適應也相對較差，只能依靠母乳中的免疫球蛋白，來構成自身的免疫系統，這樣的免疫系統非常不堅固，所以給各種病原菌提供了可乘之機，再加上有些豬場管理條件稍差，衛生條件差，不能及時清刷豬舍，更是讓細菌有了可藏身之處，又如天氣條件不適當，寒冷，大風，暴雪，暴雨，高溫，炎熱等，都會給新生仔豬造成應激，更是減弱了免疫力，使得大腸桿菌更容易侵入仔豬體內，造成仔豬的機體紊亂，最終進入腸道，釋放出腸毒素，侵入腸上皮，破壞腸上皮細胞正常的功能代謝，造成腸上皮細胞功能紊亂，最終影響仔豬的消化系統，是消化系統功能異常，不能正常的消化食物，導致腹瀉，造成仔豬的消化不良，伴隨著營養不能及時吸收，使仔豬機體沒有足夠的營養來保持代謝正常，不能為機體各項生命活動提供營養，最終導致消瘦，嚴重的腹瀉還會造成機體脫水，而脫水到達一定程度，會引起仔豬的死亡，更嚴重的是，大腸桿菌病是一種傳染病，而且傳染性非常強，所以仔豬的黃白痢通常是由一只發病，逐漸散播到幾只，然后是一窩全部發病，接著會牽連到相鄰的小豬，導致大量新生仔豬死亡，造成嚴重的損失，這些損失，對養豬企業來講，可能只考慮它帶來的經濟損失，因為養豬企業擁有大量的豬只，這些仔豬的死亡在企業的彈性范圍內，而對于普通養殖戶來講，這些仔豬的死亡帶來的不僅僅是經濟上的損失，還有人力上的損失，物力上的損失，精力上的損失，一頭母豬從發情開始，要悉心照顧，到適配時期要抓住時機，才能配種成功，經歷大約114天的妊娠期，這期間要保證充足的營養，在分娩時還要保重仔豬順利的產出，還有可能遇上死胎、木乃伊胎的出現，最終產出十幾頭小豬，而這些小豬的健康是養殖戶數月來辛苦的回報，而仔豬的大腸桿菌病嚴重時，會使一窩小豬全部夭折，是養殖戶數月的辛苦勞作全部化為灰燼，飼料，獸藥，疫苗等，這些損失，以及在分娩的夜晚不能休息的精力耗費，這所有的損失，都對養殖戶的打擊非常大，所以，大腸桿菌病對養殖業的危害相當大。由于大腸桿菌在自然界內分布極為廣泛，所以大腸桿菌病的分布也是非常廣泛的，在世界范圍內都有分布，在流行性上，大腸桿菌病還是有一定的區域分布特征的，這也不難理解，在養殖業發達的地區和國家，流行性高，而在養殖稀少的地方，大腸桿菌病的流行性低，這主要還是因為各個國家與地區的經濟條件，社會衛生狀況等等，都不盡相同，所以才會是大腸桿菌病的流行產生區域差別。當然，這也與各個地區和國家的科技發展水平有關，在科技發展水平高的地區或國家，在養殖業方面，大量的機械化設備代替了人力，既提高了工作效率，還擴大了防疫監控范圍，使得各種病菌都少了可乘之機，而在科技發展水平低一些的地區或國家，還是依靠人力，或者半機械化，防疫做的不全面，自然流行病的流行性更強一些，所謂科技是第一生產力，還是非常有道理的。在時間上，大腸桿菌病的發病特征并不是非常明顯。主要體現在它的季節發病性上，大腸桿菌病在一年四季都有發生，在同種群體之間，它的季節發病性稍明顯，但在不同種群體之間是存在一些差異的。大腸桿菌病在豬身上一年四季都可以發生，主要在環境低溫高濕的時候，如冬春季節溫度較低，陰雨天氣濕度較大，仔豬抵抗力減弱，腸道內的致病菌往往會大量增殖，從而引起發病REF_Ref25034\r\h[3]。此外，還有豬的日齡有關，前面提到大腸桿菌病的危害時說到，仔豬黃痢通常在出生后幾天發生，仔豬白痢主要在14～21日齡發生，豬水腫病往往在42～105日齡發生REF_Ref13177\r\h[4]。而大腸桿菌病的傳播源主要是糞便中的致病性大腸桿菌，傳播途徑主要是糞口傳播。所以日常的清理糞便以及糞便的生物熱處理非常重要。為了確定煙臺海陽某豬場這起仔豬腹瀉是否為大腸桿菌引起的，本實驗對該豬場采集的棉拭子樣品進行了細菌的分離純化、革蘭氏染色鏡檢、生化試驗、PCR鑒定、血清型鑒定以及藥物敏感性檢驗。1材料與方法材料病料病料采集自海陽某豬場疑似大腸桿菌病的腹瀉仔豬的糞便及肛門拭子，共48份。材料及試劑普通營養瓊脂培養基、麥康凱瓊脂培養基、營養肉湯培養基（LB肉湯）、革蘭氏染色劑、細菌微量生化鑒定管、96孔酶標板、Tris-乙酸電泳緩沖液（50×TAE緩沖液）、Goldview核酸染色劑、雙蒸水、4種毒力基因的上、下游引物，采購于深圳華大基因科技有限公司，包括E.coilK88-F841bp、E.coilK88-R841bp、E.coilK99-F543bp、E.coilK99-R543bp、E.coil987P-F463bp、E.coil987P-R463bp、E.coilF41-F682bp、E.coilF41-R682bp以及16SrRNA引物一共9種引物，購置于南京諾唯贊生物科技有限公司的2×TaqPCRMasterMix、購置北京天壇藥物生物技術開發公司的藥敏紙片。設備SW-CJ-2F型雙人雙面凈化工作臺、BPH-9162型精密恒溫培養箱（37℃）、HYC-356型醫用冷藏箱（2-8℃）、CX31RBSF型電子顯微鏡、DW-25L262型醫用低溫保存箱（-25℃）、A300型基因擴增儀、WD-2102B型全自動酶標儀、JY04S-3E型凝膠成像分析系統、300E型電泳儀、TGL-20M型高速冷凍離心機、THZ-100型恒溫培養搖床、H1650-W型醫用離心機、JM-A6002型電子天平、GW-T7型電陶爐、ML204T型電子天平（精密）、量筒（50ml、100ml、1000ml）、HWS-26型電熱恒溫水浴鍋、MX-F型渦旋機、MINI-6000型微型離心機、移液器（100-1000μl、20-200μl、0-100μl、5-50μl、0.5-10μl、0.1-2.5μl）、30-300μl的排槍、接種環、試管架、槍頭等。方法細菌的分離純化配制培養基在燒杯中按照試劑說明比例加入試劑充分混合，然后將燒杯放置在電陶爐上加熱，邊加熱邊攪拌，防止瓊脂糊底，待瓊脂溶解后，分裝到相應的錐形瓶中，不超過最大容積的三分之二。塞上橡膠塞，包裹上牛皮紙，用橡皮筋纏起來，然后放入高壓滅菌鍋中，121℃高壓滅菌30min，再拿出來冷卻，最后在無菌條件下，倒入干燥已滅菌的平板中即可。下層培養基的配制基本相似，將上層培養基配料中的瓊脂粉減半即可，加熱之后趁熱分裝到試管中，每支試管中5ml，塞上橡膠塞之后，7支試管一扎，用牛皮紙和橡皮筋包扎好高壓滅菌。營養肉湯中不加瓊脂粉，所以也就不需要加熱，配料完成后，包扎好，直接高壓滅菌即可。配料表如表1:表1上、下層普通營養瓊脂培養基以及營養肉湯培養基配料表成分上層普通營養瓊脂培養基下層普通營養瓊脂培養基營養肉湯培養基牛肉浸粉3g3g3g瓊脂粉15g8g-蛋白胨粉10g10g10g氯化鈉5g5g5g蒸餾水1000ml1000ml1000ml細菌的分離將超凈臺臺面用酒精消毒，并且打開紫外燈殺菌20min。滅菌完成后，用75%的酒精消毒雙手。開始操作，點燃酒精燈，將鑷子放在酒精燈上來回灼燒幾次殺菌，然后打開樣品管，用鑷子夾取出棉拭子，涂布在培養皿上，并進行編號，然后放入37℃恒溫箱中24h后觀察。細菌的純化待涂布好的培養皿上長出單菌落后，用滅菌的接種環挑取疑似大腸桿菌的單菌落進行純化。用接種環在麥康凱培養基上進行劃線，分三區劃線，畫完線的平板放入37℃恒溫箱中，等長出單菌落后，再次挑取單菌落在麥康凱培養基進行劃線分離純化。這樣重復3次，直到菌落完全純化，挑取單菌落到5mlLB肉湯試管中，在37℃恒溫搖床中過夜培養12h。細菌的鑒定革蘭氏染色鏡檢對純化好的單菌落進行革蘭氏染色。首先將載玻片洗凈擦干，在灼燒殺菌，然后在載玻片中央滴一滴生理鹽水，用灼燒冷卻后的接種環挑取單菌落，在生理鹽水中涂勻，用酒精燈烤干固定，然后拿出革蘭氏染色劑中的草酸銨結晶紫，滴1滴，染色1min，1min后，用蒸餾水沖洗，然后再用碘液染色1min，1min后，用蒸餾水沖洗，用吸水紙吸去水分，用95%的酒精數滴進行酒精脫色，30s后，水洗，吸水，最后用沙黃1滴，染色1min，然后用蒸餾水沖洗，再用吸水紙吸干水分。干燥后鏡檢，油鏡下觀察細菌形態。細菌的生化鑒定用糖發酵試驗，選取葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、甘露醇5種細菌微量生化鑒定管對分離菌株進行生化特征鑒定。在無菌環境下，用灼燒冷卻后的接種環挑取適量的、待檢驗菌苔于生理鹽水中，混合均勻，制備細菌懸濁液。用移液器分別取100μl細菌懸濁液加入5種細菌微量生化鑒定管中，在37℃培養18～24h后，觀察顏色變化，并與鑒定標準進行對比REF_Ref23841\r\h[5]REF_Ref31863\r\h[6]。PCR鑒定首先是大腸桿菌特異性引物的鑒定。根據深圳華大基因科技有限公司研發的大腸桿菌特異性鑒定引物，EC370-F：5，-GATAAGCCCGCAGTCACCT-3，，EC370-R:5，-TCCCGTAACTCATCACCATCA-3，，對分離的各細菌菌株進行鑒定。用菌液做DNA模板，配制成25μl的PCR反應體系。其中需要上游引物1μl，下游引物1μl，DNA模板2μl，雙蒸水8.5μl，2×TaqPCRMasterMix12.5μl。將反應體系混合均勻，用瞬時離心機瞬離，按照95℃預變性5min，開始循環：94℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸55s，30個循環，最后72℃總延伸10min，終止反應20min。最后用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR產物，預期擴增的目的片段大小為370bp。量取100ml1×TAE緩沖液于燒杯中，稱取1g瓊脂糖放入其中，用電陶爐加熱融化直到液體清亮，將其冷卻到40-60℃，再用移液器取5μl核酸染色劑，搖晃混合均勻，在凝膠盤中放好凝膠板，事先根據樣品數量需要放入梳子，將配好的膠倒入凝膠盤中，使膠板的厚度大約為5mm，放置30min，制備成1.0%瓊脂糖凝膠。膠板冷卻凝固后，拔出梳子，將凝膠連同凝膠板放入水平電泳槽，倒入1×TAE緩沖液淹沒膠面。PCR反應完成后，各取5μlPCR擴增產物加入到各個加樣孔中，并且加入陽性對照，同時加入標準分子量Maker做分子質量大小對照，在120V電壓下電泳20min。在電泳結束后，關掉電源，取出凝膠，放進天能凝膠成像系統中，打開其中的紫外燈，輔助其余的燈光，觀察條帶。由于TAE緩沖液具有一定的毒性，所以在配制1×TAE緩沖液，1.0%瓊脂糖凝膠，以及電泳，取膠時，應該全程佩戴橡膠手套，必要時可戴兩層，操作完成后，要洗手清潔。其次是大腸桿菌血清型的鑒定。根據劉澤文REF_Ref25544\r\h[7]等報道的大腸桿菌K88，K99，987P，F41四種毒力基因（表2），進行大腸桿菌的血清型鑒定。以菌液為模板配制成25μl的PCR反應體系，進行PCR反應。反應條件按照95℃預變性5min，開始循環：94℃變性30s，設置48℃-48℃-46℃-45℃的梯度退火30s，72℃延伸1min，30個循環，最后72℃總延伸10min，終止反應20min。擴增完成后，進行電泳，觀察條帶。表24種致病性大腸桿菌毒力基因PCR引物毒力基因種類序列長度退火溫度K88F：GATGAAAAAGACTCTGATTGCAR：GATTGCTACGTTCAGCGGAGCG841bp45℃K99F：CTGAAAAAAACACTGCTAGCTATTR：CATATAAGTGACTAAGAAGGATGC543bp46℃987PF：GTTACTGCCAGTCTATGCCAAGTGR：TCGGTGTACCTGCTGAACGAATAG463bp54℃F41F：GATGAAAAAGACTCTGATTGCAR：TCTGAGGTCATCCCAATTGTGG682bp45℃藥敏試驗采用藥敏紙片法對分離得到的菌株做藥物敏感性測定。在無菌條件下，用移液器取100μl經純培養的菌液，置于瓊脂平板內，用一次性涂布棒將菌液涂布在瓊脂培養基表面上，每次將平板轉動一些角度，稍稍傾斜，涂布棒要涂布到平板的邊緣，以保證菌液涂布的均勻，等待平板上的水分完全被吸收之后，貼上藥敏紙片[8]。用酒精燈灼燒過的冷卻后的無菌鑷子夾取出藥敏紙片（頭孢噻肟、恩諾沙星、青霉素、新霉素、環丙沙星、左氧氟沙星、氨芐西林、慶大霉素一共9種藥敏紙片）分別平貼在瓊脂表面，用鑷子輕輕按壓，保證貼緊，但不要將瓊脂戳破。每個瓊脂平板上貼5張不同的藥敏紙片，各個紙片的間距不能少于25mm，每張紙片的中心離平板邊緣不少于15mm。將操作完的平板反扣過來，放置在37℃恒溫溫箱中培養18～24h，然后取出，從平板背面測量抑菌圈的直徑[9][10]。結果細菌的分離培養和形態學觀察經37℃恒溫培養24h后，可以看見在普通瓊脂上形成圓形菌落;在麥康凱培養基上形成圓形粉紅色菌落，可見表面光滑、扁平、凸起，經過連續傳代培養后菌落大小均一樣（圖1）。革蘭氏染色鏡檢發現染色的菌體呈紅色，為革蘭氏陰性菌，且單一或兩個存在，兩端鈍圓的短桿菌，因此初步判斷為疑似大腸桿菌（圖2）。圖1細菌在麥康凱培養基上的形態圖2革蘭氏染色后顯微鏡下的形態生化鑒定5種糖發酵試驗結果顯示，分離到的菌株能夠在葡萄糖、乳糖、麥芽糖以及甘露醇發酵管中產酸產氣，不能利用蔗糖（表3），根據生化反應結果判定為大腸桿菌。表3分離菌株的生化鑒定生化鑒定項目鑒定結果葡萄糖+乳糖+麥芽糖+蔗糖-甘露醇+PCR鑒定用PCR方法檢測分離菌株的K88、K99、987P、F41四種血清型的鑒定，分離所得到的48株菌株均未擴增出K88、K99、F41的目的條帶，其中有2株細菌用987P引物擴增出了目的條帶，大小為463bp（見圖3）。250bp500bp2000bp250bp500bp2000bp250bp500bp2000bp250bp500bp2000bp圖3987P結果M：DNA標準分子質量為DL20001-48：48個樣品的DNA擴增結果藥敏試驗用藥敏紙片擴散法對48株菌株進行耐藥試驗，并根據《歐盟藥敏試驗標準》進行判定。根據藥物敏感性測定的結果判斷菌株對頭孢噻肟、恩諾沙星、環丙沙星、左氧氟沙星敏感，對青霉素、新霉素、多西環素、氨芐西林、慶大霉素耐藥。藥敏試驗抑菌圈見圖4，48株細菌對各種藥物的敏感度見表4。圖4藥敏試驗抑菌圈表4分離菌株藥敏試驗結果菌株編號頭孢噻肟恩諾沙星青霉素新霉素環丙沙星多西環素左氧氟沙星氨芐西林慶大霉素1++--+-+--2++--+-+--3++--+-+--4++--+-+--5++--+-+--6++--+-+-+7++--+-++-8++--+-+--9++--+-+--10++--+-+--11++--+-+--12++--+-+--13++--+14++--+-+--15++-++-16++--+-+--17++--+-+--18++--+-+--19++--+-+--20++--+21++--+-++-22-+--+-+-+23++--+-+--24++--+-+--25++--+-+--26++--+-++-27+++--28++--+-+--29++--+-++-30++--+-+--31++--+-+--32-+--+-+-+33++--+-+--34++--+-+--35++--+-+--36++--+-+--37++--+-+--38++--+-+--39++--+-+-+40++-+--41++--+42++--+-++-43++--+-+--44++--+-+--45++--+-+-+46++--+-+--47++--+-+--48++--+-+--注：“+”表示敏感，“-”表示耐藥。討論仔豬感染大腸桿菌會導致仔豬黃痢、仔豬白痢、仔豬水腫病，致使仔豬食欲降低，精神狀態不良，生產性能下降，嚴重的引起仔豬大量死亡，造成嚴重經濟損失。本實驗從煙臺海陽某養豬場采集的仔豬腹瀉樣品中分離到大腸桿菌菌株，并對其進行了革蘭氏染色鏡檢，生化鑒定，PCR鑒定，以及藥物敏感性測定。在實驗中遇到了許多問題。豬源致病性大腸桿菌的血清型主要有K88、K99、987P、F41四種類型。本試驗在PCR鑒定的過程中，K88和K99兩組的陽性對照沒有出現條帶，懷疑K88和K99標準株的序列發生變化，送到機構檢測，發現這兩株菌沒有黏附素基因。所以只鑒定到2株987P血清型的大腸桿菌，其它菌株的血清型有待鑒定。福建農林大學的余佳REF_Ref15937\r\h[11]分離到了F41型的大腸桿菌，湖北的劉澤文等REF_Ref30971\r\h[7]987P型的大腸桿菌，可見不同地區的致病性大腸桿菌血清型存