免疫組織化學復旦大學上海醫學院病理學系朱虹光概述1，免疫組織化學：20世紀70年代的病理學棕色革命。2，目的：原位顯示待測抗原。一、組織和細胞標本制備目的：1，最大限度地保存組織結構。2，最大限度地保存抗原性。注意事項：在選擇組織處理方法前，先根據實驗目的，參考抗體說明，確定組織處理方式。（一）石蠟切片

最常用，組織保存最好，易于保存，在大多數情況下優先選用。1，取材（1）原則：盡可能新鮮，動物標本可選用動脈灌注固定。（2）取材部位：盡量包括病灶和正常組織交界處，避免選擇壞死組織。（3）避免擠壓：受擠壓組織不但影響HE切片的觀察，還造成非特異性免疫組化組織著色。2，固定根據不同的染色目的，選擇不同的固定液，盡可能采用新鮮組織。切成合適的組織塊。3，制備蠟塊

沖水、脫水、透明、包埋。盡可能采用低溫石蠟包埋。4，切片（1）避免破損，避免切片不平整。（2）一次性制備足夠的連續切片。（3）避免切片脫落：清潔玻片、涂膠、切片平整、徹底烘干。5，襯染常用蘇木精或甲基綠襯染細胞核。6，封固和保存絕大多數免疫酶染色后都可用樹膠封固，但如用DAB以外的底物進應注意有色沉淀物如為脂溶性，應改用水溶性封固物如明膠、甘油沖液等。7，保存1，酶免疫染色切片可保存數周甚至數月。2，免疫熒光染色后應盡快觀 察、拍照。（二）常用固定劑1，醛類：（1）甲醛：常用4%甲醛固定液，最好采用緩沖甲醛。優點：結構保存好，組織收縮 少。缺點：可能對抗原破壞性較強，造成假陰性結果。甲醛固定造成假陰性的原因A，甲醛氧化為甲酸，pH降低。B，氨基交聯形成酸甲基，造成空間障礙C，分子間交連掩蓋抗原決定簇。常用固定劑（2）戊二醛：穿透性好，多用作電鏡固 定劑。但對抗原有一定的破壞。（3）多聚甲醛：效果好，價格昂貴。2，醇類（1）乙醇：優點：固定作用強，抗原保存好。缺點：組織收縮，變硬。（2）甲醇：多用甲醇加丙酮，可用于培養細胞的固定、通透；或冰凍切片的固定。抗原保存好。（三）冰凍切片優點：抗原不受損失。缺點：不易保存，組織結構保存差，不易制作連續切片。1，制備冰凍組織塊（1）干冰丙酮，內置異烷法。（2）CO2氣霧噴凍法。（3）液氮法。注：組織需用OCT包埋，置于鋁箔中，貯存于-700C冰箱中。冰凍切片制作及處理冰凍切片制作：要求同石蠟切片。切片后處理：一般自然晾干后用冷丙酮固定。（4）細胞標本制備1，組織印片：將載玻片輕壓于新鮮的病灶切面上，自然干燥后最好盡快染色。2，貼壁培養細胞：可制備爬片。3，懸浮培養細胞：最好用CYTOSPIN制作甩片。（4）細胞標本制備4，細胞膜通透：因爬片或涂片中細胞膜是完整的，如果免疫組化染色的靶抗原為細胞內物質，應先用50%甲醇+50%丙酮于-200C預冷后將細胞制片內置20分鐘，既可達到細胞固定的目的，又可完成細胞膜通透過程。（五）標本內抗原性的修復

由于固定中抗原性受損，一般在對石蠟切片的免疫組化染色前應對切片進行抗原修復。（五）標本內抗原性的修復1，溶解、洗脫變性蛋白常用的有0.05%~0.1%胰蛋白酶（含0.1%CACL2）；0.1%胃蛋白酶（PH2）。2，目前最常用者為將切片置于PH6的檸檬酸緩沖液中，微波處理5~15分鐘。二、常用的免疫染色方法和原理

常用的免疫染色法有免疫熒光法，免疫酶法，免疫金銀法和放射免疫自顯影法。最常用者為前兩種。（一）免疫熒光法優點：簡便、快速，可以定量，可以用直接法進行雙重標記或多重標記。缺點：需要熒光顯微鏡。用于組織染色特別是石蠟切片組織染色時常有自發熒光干 擾。（一）免疫熒光法最常用的熒光素有：1，異硫氰酸熒光黃 （FITC）。2，四甲基異硫氰酸羅達明。3，化學發光體（可增加敏感度，增加標記種類）。（一）免疫熒光法主要用途：1，細胞免疫染色，可做多重標記，可上細胞流式儀進行定量分析等。2，組織免疫染色時多用于檢測免疫復合物的沉積。

525nm(20-nmbandpass)525(spectrallyunmixed)Compositeimage(qd+autofluor)RGBMultispectralimagingisolatessignalsfromautofluorescence

FFPEprostate:PSMAlabeledwith525-nmQDOTsFITCComponentAutofluorescenceComponent40xMagnificationKidneyglomerulus:FITCantibodytoC3andAutofluorescence

NuanceimageRGBimageNuancecompositeimageEGFRandphospho-EGFRinskintissueRGBimageDAPIphospho-EGFREGFRAutofluorescenceNuanceimage:EGFRgreen,p-EGFRred（二）免疫酶法優點：1，不需要熒光顯微鏡。2，襯染后組織結構顯示良 好。3，染色后切片易保存。4，可用于免疫電鏡。（二）免疫酶法主要應用范圍：1，多用于組織中的抗原檢 測。2，一般不要用于細胞免疫染 色中。常用標記物及底物呈色反應1，辣根過氧化物酶（horseradishperoxidase,HRP)：為最常用者，該酶最常用的還原型染料為二氨基聯苯胺（DAB，終產物為棕色）；氨基乙基卡巴唑（AEC，終產物為橘紅色），4-氯1-萘酚（CN，終產物為灰藍色）。DAB染色后用明膠封固，AEC和CN染色后用水溶性封固劑（最常用者為緩沖甘油）封固。常用標記物及底物呈色反應2，堿性磷酸酶（AP）為另一種常用標記酶。可通過兩反應顯色：（1）偶氮偶聯反應，水解-萘酚磷酸鹽為- 萘酚后與 fastblue（終產物為藍色）或 fastred（終產物為紅色）形成不溶性沉 淀。（2）靛藍-四唑反應，水解溴氯羥吲哚磷酸鹽（BCIP）并將其氧化為靛藍，而氮藍四（NBT）則在反應中被還原成不溶性紫色沉淀。常用的免疫酶法（1）免疫酶標法：分為直接法和間接法兩種————————————————常用的免疫酶法（2）非標記免疫酶法：最典型為PAP法或雙PAP法，APAAP法。__________________________________-（3）親合免疫組化法A，SPA法（staphylococcusproteinA)：原理：利用SPA與Fc受體的高親合力，用酶標記SPA后作為酶標二抗或用于PAP法中作為橋抗。優點：與Fc段高親和力，染色背景淡。缺點：不能分辯抗體種屬，而形成非特異性染色；與某些IgG亞型的Fc段無親合力，在一抗為單克隆抗體時要注意選擇。（3）親合免疫組化法B，生物素（biotin）~卵白素（avidin）法：生物素分子量為244，卵白素分子量為67kD，

兩者有極高的親和力。可分為標記式（抗體標記生物素，酶或熒光素標記卵白素）；橋式（抗體標記生物素，酶標記生物素，卵白素為橋，序貫上片）。ABC法（avidin~biotin~complex）先將生物素與卵白素形成大晶格復合物，靈敏度很高。（4）凝集素法凝集素是一類糖蛋白或結合糖的蛋白質，其生理功能為通過與細胞表面糖分子間的非共價鍵結合，使細胞發生凝集而得名。其最大特點為細胞表面糖復合物結合的專一性，故可被用于研究細胞膜表面某些糖分子的改變。可直接標記凝集素或結合使用抗凝集素抗體進行檢測。（5）受體配體法

目前有廣泛的應用，如檢測乳腺癌細胞的雌、孕激素受體，對手術后的化療方案有重要的指導意義。但這一類檢測逐漸被抗原抗體反應所取代。（三）其他方法1，免疫金銀法：用膠體金標記染色后用 銀放大顯影，多用于免疫電鏡。2，免疫半抗原法：最常用如地高辛法 等，前應用日趨廣泛。3，放射免疫自顯影法：多用于同位素示蹤，敏感性高但不能觀察組織結構。（三）其他方法4，葡聚糖聚合物技術：原理是以葡聚糖為骨干，與多達100個酶分子和約20個抗體分子結合，從而大大提高了檢測的敏感性和特異性。可分為直接標記一抗的一步法和標記二抗的兩步 法。四、非特異性著色及其對照設置（一）非特異性著色及其消除方法1，內源性組織成分的干擾（1）自發熒光和誘發熒光：自發熒光多位于纖維組織中，一般較弱，波長很少和特異性誘發熒光相同，往往容易區分；非特異性誘發熒光往往見于甲醛固定后的組織，往往呈黃色。四、非特異性著色及其對照設置（2）內源性酶：采用HRP標記時必須在加入HRP前以0.3%~0.5%H2O2去除內源性過氧化物酶；用AP標記時一般僅在顯示胃腸上皮抗原時需用10mM左旋咪唑去除內源性鹼性磷酸酶。四、非特異性著色及其對照設置（3）內源性生物素：肝、胰、腎等實質臟器細胞內含有內源性生物素，在冰凍切片時尤為豐富，應避免使用ABC法，或預先遮蔽。最好的方法為用葡聚糖聚合物技術替代avididn-biotin系統。2，標記物產生的干擾（1）熒光素：一般應選用激光級，已標記者選用F/P為1~2者。染色前可用G-25小柱去除游離熒光素。（2）HRP：酶純度≧3，E/P=4。（3）Avidin引起的背景著色可用Strept-

Avidin改善。3，抗體引起的干擾（1）抗體蛋白與組織的非特異性吸附：可用正常的二抗同種血清孵育切 片；在抗體稀釋液中加BSA加以改善。（2）免疫原問題：可分為抗原不純和交叉反應兩類。兩者均可用單克隆抗體法解決，后者也可用新合層析純化抗體。3，抗體引起的干擾（3）IgG的Fc段與Fc受體的結合：可用

Fab段抗體解決，但該法不能用于間接免疫法。（4）天然抗體：見于多抗，可采用高效價抗體或用親合層析法去除。4，組織處理不當（1）血清或分泌物對細胞的污染，可充分洗滌去除。（2）組織固定不及時，造成抗原彌散或非特異性染色。（3）染片過程中洗滌不充分。（二）對照設置1，陽性對照：包括自身對照。2，陰性對照：（1）陰性標本對照。（2）空白或替代對照。（3）吸收實驗：實踐中很難做到。（4）抑制實驗：只用于直接法。（三）增強對比度1，預處理：如消化、微波處理等。2，染色過程在微波下進行。3，后處理：如在DAB顯色液中加入NiCl2等。五、雙重或多重免疫組化原則：選好抗體配伍（一）常用的雙標或多標記法1，雙重熒光染色（1）直接法：最好，但可行性不大， 敏感性也較差。（2）間接法：關鍵在于選好相應的一 抗和熒光標記二抗。（一）常用的雙標或多標記法（3）親合免疫組化法：第一次用除羊以外的抗體為第一抗體，后接FITC 標記的SPA；第二次用結合生物素 的山羊抗體，后接標記RB200的卵 白素。（一）常用的雙標或多標記法2，雙重酶染色法：（1）上述幾種方法中用HRP和AP取代 熒光素。（2）非標記免疫酶法：第一套用小鼠PAP；第二套用羊APAAP。橋抗分別用兔抗小鼠和兔抗山羊。（二）消除雙重染色間交叉反應的方法1，分步固定法：用同種酶染色方法時，第一種顯色（DAB）完成后用甲醛蒸汽固定后作第二次染色，顯色用 CN。2，解離洗脫法：在第一次顯色后用高強度或酸性溶液將已形成的免疫復合物解離。（三）注意事項1，實驗前周密設計，確保無交叉反應。2，先分別做單標染色得出明確結果和最佳條件。3，先做抗原性不穩定者。4，先用結果穩定的呈色反應。5，熒光法時先用RB-200后用FITC結果判定原則：1，有HE常規染色切片作為形態參照。2，知道應該出現的染色陽性細