1.限制酶的選擇原則(1)根據目的基因兩端的限制酶切點確定限制酶的種類①應選擇切點位于目的基因兩端的限制酶，以便將目的基因“切出”，如圖甲可選擇PstⅠ。②不能選擇切點位于目的基因內部的限制酶，以防破壞目的基因，如圖甲不能選擇SmaⅠ。③為防止目的基因和質粒的自身環化和隨意連接，也可使用不一樣的限制酶切割目的基因和質粒，如圖甲也可選擇用PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶(但要保證質粒上也有這兩種酶的切點)，并且這種切點不致于破壞所有的“標識基因”以及啟動子和終止子。(2)根據質粒的特點確定限制酶的種類①所選限制酶要與切割目的基因的限制酶相一致，以保證具有相似的黏性末端。②質粒作為載體必須具有標識基因等，因此所選擇的限制酶盡量不要破壞這些構造，應至少具有一種完好的標識基因，如圖乙中限制酶pstⅠ因其會破壞標識基因而不適宜選擇。③所選限制酶切點不應位于復制原點處以防破壞復制原點，假如所選酶的切點不止一種，則切割重組後也許會丟失某些片段，若丟失的片段含復制原點區，則切割重組後的片段進入受體細胞後不能自主復制。④所選限制酶，其切點應位于啟動子與終止子之間，如圖乙中HindⅢ會破壞啟動子，EcoRⅠ會破壞終止子，而NdeⅠ和BamHⅠ切出的切口可讓目的基因嵌入啟動子與終止子之間。(3)參照Ti質粒的T－DNA片段選擇限制酶若質粒上標出T－DNA片段，則所選限制酶切點應位于T－DNA片段中，從而有助于將目的基因嵌入到T－DNA片段上——由于Ti質粒的T－DNA片段最易轉移至受體細胞并且整合到受體細胞染色體DNA上，如用兩種限制酶XbaⅠ和SacⅠ(兩種酶切出的黏性末端不一樣)切割某DNA，獲得含目的基因的片段。若運用該片段構建基因體現載體，則下圖中甲、乙、丁，Ti質粒均不適宜選擇，而丙Ti質粒宜選用。(分析如下)2.目的基因的檢測與鑒定(1)界定“標識基因”與“DNA分子雜交技術”在目的基因檢測中的作用：①載體上標識基因的標識原理載體上的標識基因一般是某些抗生素的抗性基因。目的基因要轉入的受體細胞沒有抵御有關抗生素的能力。當具有抗生素抗性基因的載體進入受體細胞後，抗性基因在受體細胞內體現，使受體細胞可以抵御對應抗生素，因此在受體細胞的培養體系中加入該種抗生素就可以只保留轉入載體的受體細胞，倘若在選擇培養基中不能存活，則表明無質粒轉入，當然不會有“目的基因”轉入，能存活時必含該載體，原理如下圖所示：②“標識基因”篩選後為何還需應用“DNA分子雜交技術”確認目的基因與否轉入？經上述環節篩選得到的受體細胞，只是含特定的標識基因的質粒，然而，該質粒上與否成功嵌入了目的基因，還不能確定，故仍需使用“目的基因”作探針，運用DNA分子雜交技術，檢測受體細胞的質粒上與否含目的基因。(2)使用“目的基因”作探針，運用“分子雜交技術”檢測目的基因與否轉錄出特定mRNA。(3)采用“抗原—抗體雜交技術”，從轉基因生物中提取蛋白質(作抗原)與對應抗體雜交，根據與否出現雜交帶確認目的基因與否“指導”特定蛋白質的合成。(4)采用抗蟲、抗病毒等“接種試驗”進行目的基因成功體現的“個體生物學”水平的檢測。【例證】(·全國卷Ⅲ，40)圖(a)中的三個DNA片段上依次表達出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三種限制性內切酶的識別序列與切割位點，圖(b)為某種體現載體的示意圖(載體上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切點是唯一的)。根據基因工程的有關知識，回答問題：(1)經BamHⅠ酶切後得到的目的基因可以與上述體現載體被酶切後的產物連接，理由是__________________________________________________________________________________________________________________________。(2)若某人運用圖(b)所示的體現載體獲得了甲、乙、丙三種具有目的基因的重組DNA分子，如圖(c)所示，這三種重組DNA分子中，不能在宿主細胞中體現目的基因產物的有，不能體現的原因是__________________________________________________________________________________________________________________________________。圖(c)(3)DNA連接酶是將兩個DNA片段連接起來的酶，常見的有和，其中既能連接黏性末端又能連接平末端的是__________________________。[慧眼識圖獲取信息](1)三種限制酶切割成果分析(2)體現載體與重組DNA分子分析答案(1)Sau3AⅠ兩種酶切割後產生的片段具有相似的黏性末端(2)甲、丙甲中目的基因插入在啟動子的上游，丙中目的基因插入在終止子的下游，兩者的目的基因均不能被轉錄(3)E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶T4DNA連接酶1.(·湖南長沙長郡中學月考)下圖是運用工程菌(大腸桿菌)生產人生長激素的試驗流程。所用的pBR322質粒具有限制酶PstⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ的切點各一種，且三種酶切割形成的末端各不相似，而Ampr表達氨芐青霉素抗性基因，Tetr表達四環素抗性基因。請回答如下有關問題：(1)過程①所用到的組織細胞是，過程④所用的酶是。⑤過程常用溶液處理大腸桿菌。(2)經②過程得到的互補DNA片段，稱為。(3)假如用限制酶PstⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ對圖中質粒進行切割，用一種酶、兩種酶和三種酶分別切割時形成的DNA片段種類與用一種酶和兩種酶分別切割時形成的DNA片段種類(填“相似”或“不一樣”)，這些種類的DNA片段中具有完整氨芐青霉素抗性基因的DNA片段和四環素抗性基因的DNA片段分別有種和種。(4)假如只用限制酶PstⅠ切割目的基因和質粒，完畢過程④、⑤後(受體大腸桿菌不含Ampr、Tetr)，將三角瓶內的大腸桿菌先接種到甲培養基上，形成菌落後用無菌牙簽挑取培養基甲上的單個菌落，分別接種到乙和丙兩個培養基的相似位置上，一段時間後，菌落的生長狀況如圖乙、丙所示。接種到甲培養基上的目的是篩選的大腸桿菌；接種到培養基乙上的大腸桿菌菌落，能存活的大腸桿菌體內導入的是。具有目的基因的大腸桿菌在培養基乙和丙上的生存狀況是___________________________________________________________________________________________________________。(5)將大腸桿菌培養在含氨芐青霉素、四環素培養基上的過程，屬于基因工程基本操作中的______________________________________________________________________________________________________________________環節。該基因工程中的pBR322質粒徹底水解的產物是______________________________________________________________________________________。解析(1)過程①獲得的是人生長激素mRNA，因此組織細胞取自人垂體組織細胞；過程④構建基因體現載體的酶是DNA連接酶；過程⑤將基因體現載體導入大腸桿菌前，常用CaCl2溶液處理大腸桿菌，使之成為感受態細胞。(2)②過程是人的生長素mRNA逆轉錄形成cDNA的過程。(3)PstⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ三種酶的切點分別用1、2、3表達，一種酶酶切時，一共可以得到3種相似長度的片段；兩種酶酶切時，可得到1－2，2－1，2－3，3－2，1－3，3－1六種片段；三種酶酶切時，可得到1－2，2－3，3－1三種片段，與前面反復，因此用一種酶、兩種酶和三種酶分別切割時形成的DNA片段種類與用一種酶和兩種酶分別切割時形成的DNA片段種類相似。這些種類的DNA片段中具有完整氨芐青霉素抗性基因的DNA片段和四環素抗性基因的DNA片段分別有3種和3種。(4)在甲中能生長的是具有四環素抗性的細菌，具有四環素抗性基因；在乙培養基中能生長的是具有四環素和氨芐青霉素抗性的細菌，因此導入的是完整的pBR322質粒或具有Ampr、Tetr的質粒。與丙相比，乙培養基中少了兩個菌落，闡明丙培養基中這兩個菌落中的大腸桿菌成功導入了重組質粒，并且目的基因插入質粒後，破壞了氨芐青霉素抗性基因，使具有目的基因的大腸桿菌不能在具有氨芐青霉素的乙培養基上生長，但四環素抗性基因是完好的，則具有目的基因的大腸桿菌能在具有四環素的丙培養基上生長。(5)將大腸桿菌培養在含氨芐青霉素、四環素培養基上的過程，屬于基因工程中的篩選含目的基因的受體細胞環節。該基因工程中的pBR322質粒的化學本質是DNA，其徹底水解的產物是磷酸、脫氧核糖和四種含氮堿基。答案(1)人垂體組織細胞DNA連接酶CaCl2(2)cDNA(3)相似33(4)含四環素抗性基因完整的pBR322質粒(或具有Ampr、Tetr的質粒)在丙中能存活，在乙中不能存活(5)篩選含目的基因的受體細胞磷酸、脫氧核糖、四種含氮堿基2.(·河南名校聯盟調研)如圖所示為培育轉基因細菌的操作流程，回答問題：(1)圖中①過程所用工具酶有。為了防止載體和外源DNA自連，應怎樣操作？________________________________________________________。(2)當細菌的轉化過程中吸取的外源DNA是病毒DNA時，該轉化過程又稱轉染。圖中外源DNA來自。為了提高轉染效率，應使用處理細菌。(3)圖中②過程，重組DNA增殖時需要哪些條件？__________________________________________________________________。(4)圖中③過程，篩選含重組質粒的細菌需用到基因的功能。已知所用載體內有青霉素抗性基因和四環素抗性基因兩種抗性基因，請寫出能在含四環素的培養基上生長，但不能在含青霉素的培養基上生長的細菌即為含外源DNA細菌的前提條件：_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________(答出兩點即可)。解析根據轉染的定義可知，培育圖示轉基因細菌的外源DNA應來自(DNA)病毒。此外，限制酶也可以答成限制性核酸內切酶。答案(1)限制酶和DNA連接酶應使用兩種限制酶同步切割載體和外源DNA(2)(DNA)病毒Ca2＋(3)模板、原料、酶和能量等(4)標識原細菌不具有青霉素和四環素的抗性基因，外源DNA插入到載體的青霉素抗性基因內部課後·加強訓練(時間：15分鐘)1.(·全國卷Ⅰ，40)某一質粒載體如圖所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中會導致對應的基因失活(Ampr表達氨芐青霉素抗性基因，Tetr表達四環素抗性基因)。有人將此質粒載體用BamHⅠ酶切後，與用BamHⅠ酶切獲得的目的基因混合，加入DNA連接酶進行連接反應，用得到的混合物直接轉化大腸桿菌，成果大腸桿菌有的未被轉化，有的被轉化。被轉化的大腸桿菌有三種，分別是具有環狀目的基因、具有質粒載體、具有插入了目的基因的重組質粒的大腸桿菌。回答問題：(1)質粒載體作為基因工程的工具，應具有的基本條件有___________________________________________________________________(答出兩點即可)，而作為基因體現載體，除滿足上述基本條件外，還需具有啟動子和終止子。(2)假如用品有氨芐青霉素的培養基進行篩選，在上述四種大腸桿菌細胞中，未被轉化的和僅含環狀目的基因的細胞是不能辨別的，其原因是___________________________________________________________________；并且和的細胞也是不能辨別的，其原因是__________________________________________________________________。在上述篩選的基礎上，若要篩選具有插入了目的基因的重組質粒的大腸桿菌的單菌落，還需使用品有的固體培養基。(3)基因工程中，某些噬菌體經改造後可以作為載體，其DNA復制所需的原料來自于_______________________________________________________________。解析(1)作為運載體必須具有如下特點：①能自主復制，從而在受體細胞中穩定保留；②含標識基因，以供重組DNA的鑒定和篩選；③具一種至多種限制酶切割位點以便外源DNA插入。(2)在具有氨芐青霉素的培養基上，只有具有Ampr的大腸桿菌才可以生長。而Ampr位于質粒上，故未被轉化的和僅含環狀目的基因的大腸桿菌細胞中無Ampr，不能在培養基中生長，而僅具有質粒載體的和具有插入了目的基因的重組質粒的大腸桿菌均具有Ampr因而能在培養基中生長。目的基因的插入破壞了質粒載體的Tetr，故具有插入了目的基因的重組質粒的大腸桿菌不能在具有四環素的平板上生長，從而與僅具有質粒載體的大腸桿菌得以辨別。(3)噬菌體是病毒，無細胞構造，無法自主合成DNA，需借助宿主細胞完畢DNA復制。答案(1)能自我復制、具有標識基因(2)兩者均不具有氨芐青霉素抗性基因，在該培養基上均不生長具有質粒載體具有插入了目的基因的重組質粒(或答具有重組質粒)兩者均具有氨芐青霉素抗性基因，在該培養基上均能生長四環素(3)受體細胞2.(·湖北武漢市調研)人類是乙型肝炎病毒的唯一宿主，既有的肝硬化、肝癌多從乙肝發展而來，接種乙肝疫苗是防止乙肝病毒感染的最有效措施。乙肝疫苗的研制先後經歷了血源性疫苗和基因工程疫苗階段。血源性乙肝疫苗是取用乙肝病毒感染者的血液，用高速離心法提純血液中的乙肝病毒，之後再將其滅活，制成乙肝疫苗，具有一定的感染風險。如圖所示為乙肝基因工程疫苗的生產和使用過程(注：質粒中lacZ基因可使細菌運用培養基中的物質X－gal，從而使菌落呈藍色，若無該基因，則菌落呈白色)。請回答問題：(1)過程①最佳選用的限制酶方案可以是。A.EcoRⅤ和BamHⅠB.BamHⅠ和EcoRⅠC.EcoRⅤ和EcoRⅠD.只用BamHⅠ(2)由圖中過程③可知，該目的基因的詳細功能是_____________________________________________________________________________________________________________________________________。(3)若要迅速獲取大量的目的基因，以提高重組質粒產生的效率，常用的技術是(寫中文全稱)。圖中過程②常需要用處理，使大腸桿菌細胞轉化為感受態細胞。(4)為了篩選、獲取含重組質粒的大腸桿菌，需在培養大腸桿菌的通用培養基中額外加入，培養一段時間挑選出呈(填“藍色”或“白色”)的菌落深入培養獲得大量目的菌。(5)用基因工程疫苗接種比血源性疫苗更安全，試從疫苗的構造特點解釋原因_____________________________________________________________________________________________________________________________________。解析(1)分析題意可知，切割目的基因和運載體應用相似的限制酶，所用限制酶要保證目的基因的完整性，并且把目的基因插入質粒中，故選用BamHⅠ和EcoRⅠ(用一種限制酶切割時，目的基因和運載體也許會發生自身環化或隨意連接)。(2)從過程③可知，目的基因在大腸桿菌體內可體現出乙肝病毒外殼，故該目的基因的功能是指導乙肝病毒外殼蛋白的合成。(3)獲取大量目的基因一般采用PCR技術擴增，即多聚酶鏈式反應。將目的基因導入大腸桿菌細胞的措施一般是用Ca2＋處理細胞，使其變成易于接受外源DNA的感受態細胞。(4)篩選含重組質粒的大腸桿菌，可在培養大腸桿菌的通用培養基中加入青霉素和X－gal，青霉素可以篩選出轉入了含目的基因的重組質粒和正常質粒的大腸桿菌，由于重組質粒中lacZ基因被破壞，而lacZ基因可使細菌運用培養基中的物質X－gal，使菌落呈藍色，若無該基因，菌落呈白色，故挑選出白色菌落即可。(5)研制血源性疫苗需滅活破壞乙肝病毒的核酸構造，有也許由于意外原因導致其沒有被滅活，導致乙肝病毒在宿主細胞內大量增殖，從而使接種者患病，而基因工程疫苗不含核酸，其中起作用的是蛋白質，不會引起病毒增殖和感染。答案(1)B(2)指導合成乙肝病毒外殼蛋白(3)多聚酶鏈式反應Ca2＋(4)青霉素和X－gal白色(5)研制血源性疫苗需滅活破壞乙肝病毒的核酸構造，滅活不成功則會導致接種者患病，而基因工程疫苗不含核酸，其中起作用的是蛋白質，不會引起病毒增殖和感染3.(·河南名校一聯)胰島素是治療糖尿病的重要藥物。現運用基因工程技術讓大腸桿菌生產人胰島素，下圖為大腸桿菌質粒，請據圖作答：補充闡明：HindⅢ、BamHⅠ、EcoRⅠ是限制酶切位點tetR、ampR是抗生素抗性基因(1)獲取目的基因時，應從人的文庫(基因組/cDNA)中獲取，這樣做的原由于。獲取後不能直接對目的基因酶切，由于，因此需要在目的基因兩端添加。(2)天然人胰島素不耐儲存，可使用蛋白質工程對蛋白質進行改造。蛋白質工程的基本途徑為→設計預期蛋白質構造→→找到相對應的脫氧核苷酸序列。答案(1)cDNAcDNA中無內含子序列，可以在大腸桿菌中體現對的蛋白質cDNA中只有編碼氨基酸的序列，直接酶切會導致基因構造變化BamHⅠ和EcoRI的識別位點(2)預期蛋白質功能推測應有的氨基酸序列4.(