原理及操作流程Westernblot

原理WesternBlot采用得就是聚丙烯酰胺凝膠電泳,被檢測物就是蛋白質(zhì)。經(jīng)過PAGE分離得蛋白質(zhì)樣品,轉(zhuǎn)移到固相載體(例如硝酸纖維素薄膜)上,固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì),且能保持電泳分離得多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上得蛋白質(zhì)或多肽作為抗原,與對應(yīng)得抗體起免疫反應(yīng),再與酶或同位素標記得第二抗體起反應(yīng),經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離得特異性目得基因表達得蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平得表達。

在電場得作用下將電泳分離得多肽從凝膠轉(zhuǎn)移至一種固相支持體,然后用這種多肽得特異抗體來檢測。Westernblot

原理WesternBlot操作流程蛋白樣品得制備(蛋白抽提、定量)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS凝膠制備、上樣)轉(zhuǎn)膜封閉一抗雜交二抗雜交底物顯色水溶液提取法針對水、稀鹽、稀酸或堿溶液中得蛋白質(zhì)。稀鹽和緩沖系統(tǒng)得水溶液對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好、溶解度大、就是提取蛋白質(zhì)最常用得溶劑。細胞裂解液:50mmol/LTris-HCl,150mmol/LNacl,5mmol/LEDTA,1%NP40,0、05%PMSF,2μg/mLAprotinin,0、5μg/mLLeupeptin,pH8、0有機溶劑提取法對于分子中非極性側(cè)鏈較多得蛋白質(zhì)可用有機溶劑提取,包括乙醇、丙酮和丁醇等。一、蛋白樣品得制備蛋白樣品得定量(Bradford法

)原理—考馬斯亮藍G-250有紅、藍兩種不同顏色得形式,在一定濃度得乙醇和酸性條件下,可配成淡紅色得溶液,與蛋白結(jié)合后形成藍色化合物,該化合物在595nm處有最大吸收值,化合物顏色深淺與蛋白得濃度高低成正比。制作標準曲線(插入表格)檢測樣品蛋白含量:取一管考馬斯亮藍+95

l0、15mol/LNaClNaCl溶液+5

l待測蛋白樣品,混勻后靜置2min,倒入比色杯中測試。目前世界上最常用得蛋白濃度檢測方法就是:BCA蛋白濃度測定試劑盒(BCA

Protein

Assay

Kit)Bradford法蛋白定量試劑盒(Bradford

Protein

Assay

Kit)

。二、蛋白定量BCA蛋白濃度測定試劑盒BCA

法與傳統(tǒng)方法相比,更簡單、更穩(wěn)定、更靈敏度。

BCA法測定蛋白濃度兼容性亦很好,其不受大部分樣本中其她成分得影響,對于5%以內(nèi)得SDS、Triton

X-100、Tween

20、Tween

80具有很好得兼容性。BCA法測定蛋白濃度易受螯合劑、高濃度得還原劑影響。在BCA法測定蛋白濃度前,應(yīng)盡量使EDTA濃度≤m10M;

DTT濃度≤1mM,2-ME≤0、01%。

BCA法在50～1000μg/ml濃度范圍內(nèi)有較好得線性關(guān)系,

其最小檢出量為25μg/ml。

20-30ug

細胞/組織裂解物

100ng

純化蛋白根據(jù)蛋白表達豐度調(diào)整適當?shù)玫鞍咨蠘恿可蠘恿恳恢?每孔上樣量保持一致上樣前用loadingbuffer加熱變性樣本三、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳蛋白質(zhì)帶有負電荷,因此電泳時可以從負極向正極移動Anode-內(nèi)槽緩沖液帶有負電荷,與凝膠頂部接觸外槽中緩沖液帶有正電荷,與凝膠底部接觸Cathode+帶有負電荷得蛋白質(zhì)從上到下運動(負極到正極),分開電泳進程可以根據(jù)前沿指示劑來確定,等其跑到底部上面1cm左右即可停止電泳小分子量蛋白跑得比較快、蛋白根據(jù)分子量大小分開標本加入到上樣孔中10大家應(yīng)該也有點累了，稍作休息大家有疑問的，可以詢問和交流-濾紙凝膠膜濾紙+四、WesternBlot

轉(zhuǎn)膜

分離得蛋白通過電轉(zhuǎn)膜方式從凝膠中轉(zhuǎn)移到雜交膜上(PVDF或NC膜)PVDF膜:價格較貴,可重復(fù)使用,特別適合蛋白印跡,結(jié)合能力較強,但價格比較昂貴。NC膜(硝酸纖維素膜):價格比較便宜,應(yīng)用較廣,結(jié)合牢固性差一些,韌性也不如PVDF,不能重復(fù)使用,但蛋白吸附容量高,親水性較好。WesternBlot得具體步驟轉(zhuǎn)膜

轉(zhuǎn)膜準備制作“三明治”“黑膠白膜”WesternBlot得具體步驟轉(zhuǎn)膜

WesternBlot得具體步驟轉(zhuǎn)膜

轉(zhuǎn)膜條件:推薦:100V,1——2小時;根據(jù)蛋白大小以及膠厚度得不同而不同。WesternBlot得具體步驟轉(zhuǎn)膜后檢測:(立春紅染色)

為檢測轉(zhuǎn)膜就是否成功,可用相關(guān)染料對膜進行染色。1x立春紅5min染色前染色后五、封閉脫脂奶粉(含5％脫脂奶粉得TBST緩沖液)BSAWesternBlot

膜封閉液(生物試劑公司提供)不能用于磷酸化蛋白！六、一抗、二抗孵育把NC膜放在密閉塑料袋或者培養(yǎng)皿中,加入一抗溶液與濾膜溫育,室溫小時或4℃過夜。倒掉一抗溶液,用PBS漂洗濾膜3次,每次10min。加入配制得二抗,搖床上緩慢搖動,室溫一小時或4℃過夜。倒掉二抗溶液,用PBS漂洗濾膜3次,每次10min。七、二抗與底物反應(yīng)顯色ECL化學發(fā)光顯色

比較常用,結(jié)果容易控制,但就是被催化就是靈敏度差一點DAB顯色

比較靈敏,就是HRP最敏感得底物WesternBlot

需要得主要試劑主要試劑1、 1、0mol/LTris?HCl(pH6、8)Tris(MW121、14)12、114g蒸餾水100ml溶解后,(用濃鹽酸調(diào)pH至6、8),室溫下保存。2、 1、5mol/LTris?HCl(pH8、8)Tris(MW121、14)18、671g蒸餾水100ml溶解后,(用濃鹽酸調(diào)pH至8、8),室溫下保存。3、 10％SDSSDS10g蒸餾水至100ml如溶解困難,可在50℃水浴下溶解,室溫保存。如在長期保存中出現(xiàn)沉淀,水浴溶化后,仍可使用。4、 10％過硫酸胺(AP)過硫酸胺0、1g蒸餾水1ml(現(xiàn)用現(xiàn)配,可先將過硫酸胺干粉稱好分量后放在1、5mlEP管中,一次性多裝幾管,使用時加入蒸餾水水即可,溶解后,4℃保存,保存時間為1周)5、 四甲基乙二胺原液(TEMED):4℃保存。6、 30%丙稀酰胺:4℃保存。7、5X電泳液緩沖液Tris(MW121、14)15、1g甘氨酸(MW75、07)94gSDS5、00g蒸餾水至1000ml溶解后室溫保存,用時稀釋5倍,通常取160ml配制成800ml即可。8、10X轉(zhuǎn)膜緩沖液甘氨酸(MW75、07)151、1gTris(MW121、14)30、3g蒸餾水至1000ml溶解后室溫保存,用時稀釋10倍,并加入甲醇至20%。通常取80ml母液,加560ml蒸餾水,最加160ml甲醇,配制成800ml即可。(先加甲醇易產(chǎn)生沉淀)9、 10XTBS緩沖液Tris(MW121、14)24、2gNaCl80、0g蒸餾水至1000ml(濃鹽酸調(diào)pH至7、6),溶解后室溫保存。10、1XTBST緩沖液10XTBS緩沖液100ml蒸餾水900mlTween-201ml因Tween-20比較粘稠,應(yīng)緩慢吸取并可把槍頭剪掉一塊,即可防止產(chǎn)生氣泡。溶解后室溫保存。11、封閉液/抗體稀釋液(5%脫脂牛奶):

1XTBST緩沖液95-100ml脫脂奶粉5g溶解后4℃保存,可于一周內(nèi)使用。WB需要試劑－膜常用得有PVDF膜,硝酸纖維素膜或者尼龍膜主要目得就是確定靶蛋白得分子量大小;使用預(yù)染得Marker還可以實時檢測電泳分離情況,并可以轉(zhuǎn)移到膜上。WB需要試劑－蛋白質(zhì)MarkerWB需要試劑－一抗選擇適合檢測標本種屬得一抗(說明書有驗證)選擇適用于WB實驗方法得一抗(說明書有驗證)選擇單克隆抗體或者經(jīng)過親和純化得多克隆抗體根據(jù)說明書推薦得濃度優(yōu)化最佳稀釋比例

Santacruz,Cellsignaling,Invitrogen,Sigma,Abcam,R&D,Abnova,Chemicon,Calbiochem,Millipore,BD,Cayman,Roche,eBioscience,etal、選擇合適得一抗:雜交需要試劑－二抗二抗選擇:根據(jù)一抗來源種屬以及抗體Ig亞型選擇合適得二抗。二抗得使用:根據(jù)說明書推薦濃度使用TBST稀釋二抗。如果說明書沒有推薦濃度,可進行多個稀釋比例進行摸索最佳稀釋度(1:1000-1:20000)。孵育條件一般為室溫1-2小時。

Santacruz,Cellsignaling,Invitrogen,